Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom

doi: 10.3791/56767 Published: April 11, 2018

Summary

Het volgende protocol is gericht op de oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom (STS). Dit model kan ons helpen om beter inzicht in de moleculaire achtergrond en farmacologisch profiel van deze zeldzame maligniteiten en kon vertegenwoordigen een startpunt voor verder onderzoek ter verbetering van het beheer van de St.

Abstract

Weke delen sarcomen (STS) vertegenwoordigen een breed scala aan heterogene maligniteiten met een moeilijke diagnose, classificatie en beheer. Tot op heden zijn meer dan 50 histologische subtypes van deze zeldzame solide tumoren geïdentificeerd. Dus, wegens hun buitengewone verscheidenheid en lage incidentie, ons begrip van de biologie van deze tumoren is nog steeds beperkt. Patiënt afkomstige culturen vertegenwoordigen het ideale platform om te studeren St pathofysiologie en farmacologie. Dus ontwikkelden we een menselijke preklinische model van St vanaf tumor specimens geoogst van patiënten chirurgische resectie ondergaan. St celculturen patiënt afkomstige waren de chirurgische specimens verkregen door collagenase spijsvertering en geïsoleerd door filtratie. Cellen werden geteld, zaadjes, en vertrok naar 14 dagen in standaard enkelgelaagde culturen en vervolgens verwerkt door downstream-analyse. Voordat u moleculaire of farmaceutische analyses uitvoert, de oprichting van St primaire culturen werd bevestigd door de evaluatie van cytomorphologic functies en, voorzover beschikbaar, immunohistochemische markeringen. Deze methode is een nuttig instrument 1) te bestuderen de natuurlijke geschiedenis van deze slecht onderzocht maligniteiten en 2) de effecten van verschillende drugs testen in een poging om meer te leren over hun mechanismen van actie.

Introduction

Weke delen sarcomen (STS) omvat een spectrum van heterogene laesies van mesenchymale oorsprong boekhouding voor 1% van alle stevige tumors1,2, en de nieuwe classificatie van de World Health Organization erkent de aanwezigheid van meer dan 50 verschillende subtypen3. Daaronder zijn de meest voorkomende histotypes adipocyte Sarcoom of liposarcoom en leiomyosarcoma, 15% en 11% van alle volwassen St, respectievelijk4,5. Hoewel St in verschillende delen van het lichaam ontwikkelen kunnen, zijn de extremiteiten en het retroperitoneum de meest voorkomende sites, die zich in de 60% en 20% van de gevallen, respectievelijk6.

De hoeksteen van therapie voor gelokaliseerde ziekte is breed chirurgische resectie, terwijl de voordelen van adjuvante en neoadjuvante chemotherapie nog steeds onduidelijk zijn en alleen in bepaalde gevallen7 overwogen zijn. In de gemetastaseerde setting, chemotherapie is de standaard van zorg maar beperkte resultaten8toont. Een beter begrip van de moleculaire biologie van St zou bijdragen tot het verbeteren van de huidige differentiële diagnose, optimaliseren van de beschikbare behandelingen en identificeren van nieuwe streefcijfers voor therapie.

In dit verband is onderzoek naar kanker uitgevoerd voor vele jaren met vereeuwigd cel lijnen9. Deze experimentele modellen zijn normaal gekweekt in standaard enkelgelaagde ondersteunt of immunodeficiëntie knaagdieren om in vivo xenograft modellen10ingeplant. Vereeuwigd cellijnen vertegenwoordigen een beheersbaar en easy-to-winkel materiaal waarmee een voldoende aantal onderzoek experimenten kan worden uitgevoerd. Ze zijn in feite de minst dure en meest gebruikte hulpmiddel in preklinische studies11.

Echter cellijn-gebaseerd kanker modellen hebben ook enkele beperkingen, bijvoorbeeld langdurig cultuur in een enkelgelaagde systeem samen met een toenemend aantal passages induceert fenotypische en genetische drift, maken cellen minder waarschijnlijk te recapituleren belangrijke tumor functies. Bovendien celculturen lijn niet reproduceren de cel-naar-cel interactie en signalering Overspraak van het molecuul dat het biologisch gedrag van tumoren wordt nagebootst en karakteriseren van de communicatie van de tumor. Deze vraagstukken vormen de basis van het verschil tussen de resultaten van de preklinische en klinische12.

Gezien het bovenstaande is de belangstelling in de patiënt-afgeleide primaire culturen13toegenomen. Inderdaad, de besnijdenis van kwaadaardige en normaal weefsel vermindert het risico van verlies van kanker cel fenotype en heterogeniteit, waardoor grondstof die meer representatief is voor de communicatie van de tumor. Bovendien, het gebruik van verse tumor specimens geoogst van patiënten die een chirurgische resectie stelt ons in staat te onderzoeken enkele tumoren en vergelijken van de verschillende letsels van hetzelfde deel van een patiënt lichaam14. Om bovenstaande redenen bieden weefsel afkomstige celculturen een waardevol materiaal om te bestuderen van de tumor pathofysiologie en farmacologie15,16,17, vooral in St in welke cellijnen verkrijgbare Sarcoom beperkte18bent. We geoptimaliseerd dus een methode om vast te stellen een patiënt afkomstige St primaire celculturen vanaf Operatief verwijderde tumor weefsel13,19,20. Onze werkwijze bestaat uit disaggregating van de tumor specimen in kleine weefsel fragmenten gevolgd door overnight enzymatische weefsel dissociatie te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. De volgende dag, de enzymatische spijsvertering wordt tegengehouden door het toevoegen van verse cultuurmedia en de verkregen schorsing wordt gefilterd om weefsel fragmenten, cel-aggregaten, en overtollige matrix materiaal of puin te verwijderen. Ten slotte, een fractie van geïsoleerde tumorcellen is cytospinned in glas dia's, vaste en opgeslagen voor downstream analyse gericht op het bevestigen van de oprichting van St primaire cultuur door cytomorphological, immunohistochemische en moleculaire cytogenetische evaluatie (b.v. vis analyse van versterking van de MDM2 vormt de standaard differentiële diagnose voor een goed gedifferentieerde liposarcoom en de dedifferentiated liposarcoom) 4. de resterende cellen worden overgeënt in een standaard enkelgelaagde cultuur voor gen expressie profilering en farmacologische studies. Al de experimenten zijn uitgevoerd met behulp van lage primaire culturen om te voorkomen dat de selectie van specifieke kanker subklonen passage en geanalyseerd door een ervaren Sarcoom patholoog. Dus hebben we een volledig mens St ex-vivo model13,19,20. Deze uiterst veelzijdige, gebruiksvriendelijke handvat model kon vertegenwoordigen een nuttig hulpmiddel voor verschillende soorten preklinisch onderzoek, bijvoorbeeld identificeren van nieuwe moleculaire merkers voor diagnose en prognose of krijgen een dieper begrip van de activiteit en de mechanismen van werking van standaard en nieuwe geneesmiddelen die gebruikt worden bij het beheer van de St.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

St cellen zijn geïsoleerd uit een tumor massa operatief weggesneden uit patiënten met St. Het protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie en wordt uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor goede klinische praktijken en de verklaring van Helsinki. Alle patiënten gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de studie. De chirurgische specimens worden geanalyseerd door een ervaren Sarcoom patholoog en verwerkt binnen 3 uur na de operatie.

1. tumor Specimen Collection en verwerking:

  1. Het verzamelen van monsters van de tumor met de hulp van een patholoog Sarcoom in een 100 mL steriele urine container met 50 mL DMEM lage glucose voedingsbodem verzegeld met een paraffine-film.
  2. Het opslaan van de monsters bij 4 ° C voor een maximum van 3 h na resectie van de tumor.
  3. Voer alle volgende stappen onder de motorkap van een steriele weefselkweek.
    1. Steriliseren van de kap met 70% ethanol en steriele handschoenen dragen.
    2. Steriliseren staal inox pincet met 70% ethanol (gebruik een steriel gaas).
    3. Verwijder de folie van de paraffine uit de urine-container en gooi deze weg.
    4. Wassen op de buitenkant van de container van de urine met 70% ethanol.
    5. Open een vierkante petrischaal.
    6. Open de container van de urine en breng de specimens van de tumor in de vierkante petrischaal met behulp van de gesteriliseerde staal inox pincet.
  4. De specimens van de tumor met PBS tweemaal wassen.
  5. Open een steriele chirurgische scalpel.
    1. Fijn versnipperen de tumor specimens in 1-2 mm3 stuks.
    2. Een kwart van het totale monster in een tube 2-mL verzamelen.
    3. Voeg vervolgens 1 mL van trizol reagens (gekocht) aan de buis en onmiddellijk bevriezen bij-80 ° C (het monster zal worden gebruikt in de downstream-analyse voor de beoordeling van St gen expressie).
  6. Het verzamelen van de rest van het materiaal voor fijn gesnipperde tumor in een tube van 15 mL.
    1. Voeg 4 mL collagenase typ ik oplossing (collagenase type ik wordt opgelost in PBS, met een concentratie van 4 µg/mL).
    2. Verdun de collagenase typ ik oplossing met 4 mL DMEM hoge voedingsbodems (eindconcentratie van collagenase type ik is 2 µg/mL).
    3. Sluit de tube van 15 mL en verzegelen met paraffine film.
    4. Zet de buis 15 mL in een rollende shaker in een incubator bij 37 ° C in roeren voorwaarden voor 15 min te activeren van de spijsvertering.
    5. Bewaar de buis in de glooiende shaker onder roeren voorwaarden bij kamertemperatuur 's nachts na 15 min.
  7. De volgende dag zet de buis 15 mL onder de steriele motorkap.
  8. Zachtjes de celsuspensie wordt gefiltreerd door een 100 µm steriele filter gekoppeld aan de bovenkant van een tube van 50 mL.
  9. Was het filter met DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
  10. Negeren van de 100 µm steriele filter, sluit de tube 50 mL en centrifuge op 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis.
  12. Resuspendeer de cellen met 1-2 mL DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
    Opmerking: Het volume is afhankelijk van de hoeveelheid tumor monster verwerkt.
  13. De cellen met een kamer Neubauer tellen.
    1. Verdun de monster 1:2 in trypan blauw en cellen tellen met 10 µL van de verdunning.
    2. Ten minste tweemaal tellen en berekent het gemiddelde van de wordt gerepliceerd naar het totale gemiddelde aantal cellen verzamelde kennen.
  14. De cellen van de plaat in een standaard enkelgelaagde cultuur bij een dichtheid van 80.000 cellen/cm2.
    Opmerking: Altijd besturingselementen opnemen in experimenten. Voer ten minste 3 technische replicatieonderzoeken voor elke voorwaarde. Voer ten minste 2 biologische replicatieonderzoeken. Voor preklinische farmacologie, genuitdrukking en eiwit expressie analyses, moeten proeven worden verricht met een laag aantal passages van de cultuur binnen 30-45 dagen cel zaaien om te voorkomen dat de kanker cel fenotypen verloren gaat.
  15. Cytologische monstervoorbereiding.
    1. Verzamelen van 100.000 cellen in 200 µL van DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
    2. Pipetteer de oplossing (200 µL pipet) in een wegwerp trechter voorzien van een filter en gemonteerd met een glasplaatje.
    3. Open de cytocentrifuge en plaats van de monsters.
    4. De cytocentrifuge bij 18.6 x g gedurende 20 min lopen.
    5. Gooi de trechter uitgerust met het filter.
    6. De dia's in aceton gedurende 10 minuten gevolgd door chloroform voor 5 min opgelost.
    7. Opslaan van de dia's bij-20 ° C.
      Opmerking: Ontdooien en hydrateren van de monsters vóór kleuring en voeren de kleuring na instructies van de fabrikant. Ten minste 3 technische replicatieonderzoeken voor te bereiden.

2. St celculturen:

  1. Wijzigen media eenmaal per week (DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine).
    1. Gooi het kweekmedium met behulp van een precisiepipet 200-1000 µL.
    2. Het toevoegen van nieuwe verse medium met behulp van een precisiepipet 200-1000 µL.
    3. Cel passage:
      1. Ontkoppel cellen wanneer de samenvloeiing ligt rond de 90 procent:
        Opmerking: St cel cultuur versterking moet eenmaal per week op basis van de cultuuromstandigheden worden uitgevoerd.
      2. Negeren van medium, wassen met PBS en voeg 2-3 mL trypsine 1 x in PBS
        Opmerking: Het volume van de trypsine gebruikt, is afhankelijk van de hoeveelheid gekweekte cellen verkregen.
      3. Incubeer de cellen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C.
      4. Vrijstaand cellen van de plaat met behulp van een precisiepipet 200-1000 µL verzamelen.
      5. Pipetteer van de vrijstaande cellen in een buis 15 mL en voeg 4 mL van DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine om te stoppen met de enzymatische reactie.
      6. Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      7. Verwijder het supernatant.
      8. Resuspendeer de pellet cel door toevoeging van 1 mL van DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
      9. Het zaad van de cellen in een maatkolf met een eindvolume volgens de instructies van de fabrikant of een nieuwe plaat van de cultuur.
        Opmerking: Splits cellen meer dan 1:3 niet.

3. stroomafwaarts Analyses:

Opmerking: Een scala aan verschillende experimenten kan worden uitgevoerd met behulp van dit model (zie hieronder). Het is daarom cruciaal om tijdens de ontwerpfase van de studie die analyses worden uitgevoerd zodat een voldoende aantal monsters en replicaten kan worden voorbereid.

  1. Proliferatie assays zoals MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (en)
  2. Apoptotic assays zoals terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick einde labeling (TUNEL) assay
  3. Analyse van Immunohistochemical
  4. Gen expressie analyse
  5. Westelijke vlekkenanalyse
  6. Analyse ELISA
  7. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse
  8. In vivo xenograft model

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We ontwierpen een eenvoudige methode voor het verkrijgen van de oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom en rapporteren hier een voorbeeld van resultaten op één specifieke St histotype13. Het protocol werd gebruikt voor de totstandbrenging van primaire culturen van verschillende St histotypes met inbegrip van goed gedifferentieerde liposarcoom, dedifferentiated liposarcoom myxoid liposarcoom, pleomorfe liposarcoom, myxofibrosarcoma, gedifferentieerdeproductie pleomorfe Sarcoom, GIST en desmoid fibromatosis.

Het slagingspercentage voor de totstandbrenging van primaire culturen was 54% (13 primaire culturen van 24 st chirurgische monsters) voor chirurgische specimens afkomstig van patiënten behandeld met chemotherapie, radiotherapie of niet behandeld. Daarentegen was 72% (13 primaire culturen van 18 St chirurgische monsters) chirurgische monsters slechts afgeleid onbehandelde patiënten.

Tumorcellen werden geïsoleerd uit een goed-differentiated/dedifferentiated liposarcoom (ALT/DDLPS) operatief verwijderd uit een 54-jarige patiënt. MDM2 amplificatie analyse, momenteel uitgevoerd voor de standaard differentiële diagnose van ALT/DDLPS en beoordeeld door een ervaren Sarcoom patholoog, was positief, bevestiging van de aanwezigheid van een laesie van de ALT/DDLPS(Figuur 1). Cytologische analyse van MDM2 versterking in geïsoleerde tumorcellen bevestigd de oprichting van een patiënt afkomstige ALT/DDLPS primaire cultuur (94,6% van gekweekte cellen waren gunstig zijn voor de versterking van de MDM2) (Figuur 1B). De primaire cultuur blijven vermenigvuldigen na passages in standaard enkelgelaagde culturen en levensvatbaarheid van de cellen werd gecontroleerd door MTT en Tunel assay.

Dit model ons in staat om de gevoeligheid van de ALT/DDLPS primaire cultuur tot verschillende drugs die momenteel worden gebruikt of onder klinische evaluatie voor de behandeling van ALT/DDLPS zoals ifosfamide (IFO), navelbine (EPI), de combinatie IFO + EPI, trabectedin (TRABE), testen en eribulin (ERI), uitgevoerd met behulp van de MTT-bepaling. De resultaten bevestigen de gevoeligheid van de culturen tegen chemotherapie(Figuur 2). De meest actieve behandeling was IFO + EPI, een eerstelijns therapie gebruikt in gevorderde of metastatische ALT/DDLPS. Cel morfologie werd verder onderzocht na drug blootstelling, resultaten in de morfologische veranderingen van de ighlighting in de primaire cultuur met betrekking tot de controle en de bevindingen van de cytotoxische test (Figuur 2B). Zoals vermeld in het protocol, kunnen diverse downstream analyses worden uitgevoerd met dit model. Figuur 3 geeft een schematische voorstelling van de methode en omvat een tijdlijn waarbinnen de experimenten moeten worden uitgevoerd om translationeel resultaten te verkrijgen.

Figure 1
Figuur 1 . Oprichting van patiënt-afgeleide primaire cultuur van ALT/DDLPS. A) In situ hybridisatie (FISH) uitgevoerd om te detecteren MDM2 amplificatie in een patiënt weefsel monster (100 X image). B) In situ hybridisatie (FISH) uitgevoerd om te detecteren MDM2 versterking in een primaire cultuur (100 X vergroting). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Chemotherapie in een primaire cultuur van ALT/DDLPS. A) de cellen werden behandeld met: ifosfamide (IFO), navelbine (EPI), IFO + EPI, trabectedin (TRABE), en eribulin (ERI). Drie onafhankelijke replicatieonderzoeken werden uitgevoerd voor elk experiment. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout (SE), zoals gezegd, met n die het aantal replicatieonderzoeken aangeeft. Verschillen tussen groepen werden beoordeeld door een tweezijdige Student t-test, * p < 0.05. B) beelden van ALT/DDLPS primaire cultuur na drug blootstelling (2 X vergroting). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : St primaire cultuur model. Schematische weergave van de preklinische model van primaire cultuur St met inbegrip van de tijdlijn en de mogelijke downstream analyses. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Goed gedefinieerde preklinische modellen zijn nodig om het ophelderen van de moleculaire achtergrond van tumoren, voorspellen van slechte prognose en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen voor kankerpatiënten. Dit is vooral belangrijk voor zeldzame tumoren zoals St waarvan hoge heterogeniteit in termen van morfologie, agressief gedrag van de potentiële en klinische daagt ons begrip van de biologie van de St en patiëntenbeheer21. Bovendien beperkt het aantal commerciële Sarcoom cellijnen beschikbaar preklinisch onderzoek naar deze groep mesenchymale tumoren18. Ex vivo modellen vertegenwoordigen dus een waardevolle onderzoek resource voor St. We ontwikkelden een volledig mens in vitro model van St vanaf operatief gereseceerd tumor weefsel (Figuur 3). Tijdens de optimalisatie van de methode, waren verschillende kritieke problemen aangepakt en opgelost. Het eerste probleem betreft het tijdsinterval tussen chirurgische behandeling en verwerking van de steekproef. Aanvankelijk, toen tumor exemplaren bij ons laboratorium biosciences na een bepaalde tijd aangekomen, waren ze opgeslagen 's nachts bij 4 ° C en de volgende dag verwerkt. De cellen van de St geïsoleerd van deze monsters tentoongesteld lage proliferatie activiteit en arme levensvatbaarheid in standaard enkelgelaagde cultuur. Dit kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan het feit dat specimen van de hele tumor wordt gehouden voor een langere periode van tijd in de urine container voordat wordt verwerkt. Wij gewijzigd waardoor de begintijd van het monster verwerken tot een maximum van 3 h na de operatie om ervoor te zorgen dat de primaire cultuur blijven vermenigvuldigen in standaard enkelgelaagde cultuur en goede levensvatbaarheid vertonen. Wij ook de cel aggregatieniveau proces geoptimaliseerd: kleine homogene weefsel fragmenten ter vergemakkelijking van de enzymatische spijsvertering nodig zijn, en dit werd bereikt met behulp van een scalpel. Bovendien, hoewel het protocol met exemplaren van verschillende maten gewerkt, de oprichting van een primaire cultuur vanaf specimens van beperkte grootte (< 2 cm) is moeilijker te bereiken. De concentratie van collagenase was een ander belangrijk punt omdat de concentratie te hoog anenzyme cellulaire stress, leidt tot fenotypische veranderingen in de St primaire cultuur of een afname van de overleving van de cel van de tumor kan veroorzaken. Goede enzymatische vertering is nodig om cellen scheiden van matrix materiaal en puin. We geoptimaliseerd ten slotte de concentratie van enzym te gebruiken in de fase van de spijsvertering. Bovendien, om te beperken van cellulaire spanning en voedingsstoffen voorzien in St cellen tijdens de fase van isolatie we opnieuw geschorst het enzym in kweekmedia in plaats van andere reagentia zoals PBS. Tot slot geopenbaard verschillende experimenten uitgevoerd op verschillende St primaire culturen zoals liposarcoom en myxofibrosarcoma wijzigingen in genexpressie in de tijd en verhoogde gevoeligheid voor chemotherapie13,20. Deze bevindingen zijn te wijten aan de langdurige cultuur van patiënt-afgeleide St cellen in een enkelgelaagde systeem samen met een toenemend aantal passages, zowel van die induceren fenotypische en genetische drift. De afnemende betrouwbaarheid van het systeem van deze cultuur na verloop van tijd te recapituleren tumor weefsel, zoals eerder weergegeven, vertegenwoordigt een van de belangrijkste beperkingen ex vivo modellen22,23. We geoptimaliseerd dus het protocol door het verminderen van de tijd waarin voor het uitvoeren van experimenten (binnen 30-45 dagen van tumor cel zaaien) en met behulp van lage passage culturen om reproduceerbare en translationeel resultaten te verkrijgen. Bovendien, de primaire culturen kunnen ingevroren worden, maar hun latere levensvatbaarheid is afhankelijk van verschillende factoren, met inbegrip van tumor locatie, St histotype, hoeveelheid van de chirurgische model en aantal cultuur passages uitgevoerd.

Ons systeem heeft een aantal voordelen, dat wil zeggen het is een volledig mens preklinische model, in tegenstelling tot andere RattenUitrustingen gebaseerde Sarcoom cel lijn modellen24,25,26,27. Bovendien, terwijl de bevestiging van de vestiging van St primaire culturen, bereikt door cytomorphological, immunohistochemische en moleculaire cytogenetische evaluatie, met de steun van een ervaren Sarcoom patholoog, is verplicht in ons protocol , dit is niet altijd het geval is voor andere St primaire cultuur modellen. In sommige papieren, werd stroomafwaarts analyse van cellen hersteld van chirurgische exemplaren uitgevoerd zonder bevestiging van de diagnose de St cel percentage in de primaire culturen28. Ons systeem is ook veelzijdig, reproduceerbare en kan worden gebruikt voor het uitvoeren van een breed scala aan experimenten. Bovendien, cel zaaien, en externe prikkels kunnen worden gewijzigd om te bestuderen van specifieke functies en reacties. De ontwikkeling van dit model ons in staat gesteld om te onderzoeken van de gevoeligheid van de patiënt-afgeleide St cellen tot verschillende drugs die momenteel worden gebruikt of onder klinische evaluatie voor de behandeling van de St. Dit model, daarom is een belangrijk preklinische instrument voor het voorspellen van de respons op therapie en, als verder geoptimaliseerd, zou kunnen worden gebruikt om gepersonaliseerde therapie. Het kan ook worden gebruikt ter identificatie van diagnostische of prognostische moleculaire merkers, vooral in St waar enkele specifieke biomarkers beschikbaar zijn. Een van de beperkingen van het protocol is de relatief korte tijd beschikbaar voor downstream analyses uit te voeren na de oprichting van de primaire cultuur. Het protocol kan worden verbeterd door het uitvoeren van gen expressie profilering en clustering van analysemethoden zijn vastgesteld voor zowel de tumor en de primaire culturen afgeleid uit de zelfde patiënt na verloop van tijd om te beoordelen van de capaciteit van de primaire cultuur om na te bootsen de heterogeniteit van de tumor weefsel, speciaal voor deze St histotypes waarvoor een diagnostische markering niet beschikbaar is. Dergelijke analyses zou ook bijdragen tot verder karakteriseren hoe de cellen in de cultuur verkregen afwijken rechtstreeks afgeleid uit monsters van de tumor.

Kortom, is de oprichting van robuuste preklinische modellen essentieel voor ons begrip van tumorpathologie verder. Wij zijn van mening dat ons model bijdragen zal tot het ontdekken van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de slechte prognose van de St en zal bijdragen tot de identificatie van nieuwe therapeutische strategieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

De auteurs bedank Gráinne Tierney voor redactionele ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose EuroClone ECB7501L
Fetal bovine serum EuroClone ECS0180D
Glutamine Gibco 25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
Penicillin streptomycin Gibco 15140122
Triazol reagent Ambion Life-Technologies 15596018
Trypsin EuroClone ECB3052D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11, (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64, (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9, (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6, (8), 20294 (2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17, (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2, (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10, (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8, (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3, (12), 1662 (2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95, (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13, (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15, (2), 309 (2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9, (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14, (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55, (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12, (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21, (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16, (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37, (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2, (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, (8), 313 (2008).
Oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).More

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter