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Cancer Research

रोगी की एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना-कोमल ऊतक सार्कोमा व्युत्पंन

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/56767
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

Summary

निंनलिखित प्रोटोकॉल रोगी की एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना पर केंद्रित नरम ऊतक सार्कोमा (अनुसूचित जनजातियों) व्युत्पंन । इस मॉडल में मदद कर सकता है हमें बेहतर आणविक पृष्ठभूमि और इन दुर्लभ द्रोह के औषधीय प्रोफ़ाइल को समझने के लिए और आगे अनुसूचित जनजातियों के प्रबंधन में सुधार के उद्देश्य से अनुसंधान के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रतिनिधित्व सकता है ।

Abstract

सॉफ्ट टिशू sarcomas (अनुसूचित जनजातियों) एक मुश्किल निदान, वर्गीकरण, और प्रबंधन के साथ विषम द्रोह के एक स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं । तारीख करने के लिए, इन दुर्लभ ठोस ट्यूमर के ५० से अधिक ऊतकवैज्ञानिक उपप्रकार की पहचान की गई है । इस प्रकार, उनके असाधारण विविधता और कम घटनाओं के कारण, इन ट्यूमर के जीव विज्ञान की हमारी समझ अभी भी सीमित है । रोगी-व्युत्पंन संस्कृति अनुसूचित जनजातियों pathophysiology और औषध विज्ञान अध्ययन करने के लिए आदर्श मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं । हम इस प्रकार शल्य चिकित्सा लकीर के दौर से गुजर रोगियों से काटा ट्यूमर नमूनों से शुरू अनुसूचित जनजातियों के एक मानव नैदानिक मॉडल विकसित की है । रोगी-अनुसूचित जनजातियों सेल संस्कृतियों collagenase पाचन द्वारा शल्य नमूनों से प्राप्त किया गया और निस्पंदन द्वारा पृथक । कोशिकाओं को गिना, बीज, और मानक monolayer संस्कृतियों में 14 दिनों के लिए छोड़ दिया और फिर बहाव विश्लेषण द्वारा संसाधित किया गया । आणविक या दवा विश्लेषण प्रदर्शन से पहले, अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना cytomorphologic सुविधाओं के मूल्यांकन के माध्यम से की पुष्टि की थी और, जब उपलब्ध है, immunohistochemical मार्करों । इस विधि का प्रतिनिधित्व करता है एक उपयोगी उपकरण 1) के प्राकृतिक इतिहास का अध्ययन करने के लिए इन खराब पता लगाया द्रोह और 2) कार्रवाई के अपने तंत्र के बारे में अधिक जानने के प्रयास में विभिन्न दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए.

Introduction

नरम ऊतक sarcomas (अनुसूचित जनजातियों) सभी ठोस ट्यूमर के 1% के लिए mesenchymal मूल लेखांकन के विषम घावों की एक स्पेक्ट्रम शामिल1,2, और नई विश्व स्वास्थ्य संगठन वर्गीकरण से अधिक की उपस्थिति पहचानता है ५० विभिंन उपप्रकार3। इन के अलावा, सबसे आम histotypes adipocyte सार्कोमा या liposarcoma और leiomyosarcoma, 15% और सभी वयस्क अनुसूचित जनजातियों के 11% के लिए लेखांकन, क्रमशः4,5रहे हैं । हालांकि अनुसूचित जनजातियों शरीर के विभिंन भागों में विकसित कर सकते हैं, अतिवादियों और retroperitoneum सबसे आम साइटों रहे हैं, ६०% और मामलों के 20% में होने वाली, क्रमशः6।

स्थानीयकृत रोग के लिए चिकित्सा की आधारशिला विस्तृत शल्य चिकित्सा लकीर है, जबकि सहायक और neoadjuvant कीमोथेरेपी का लाभ अभी भी अस्पष्ट हैं और केवल चयनित मामलों में माना जाता है7. मेटास्टेटिक सेटिंग में, कीमोथेरेपी देखभाल के मानक है, लेकिन सीमित परिणाम दिखाता है8। अनुसूचित जनजातियों के आणविक जीवविज्ञान की एक बेहतर समझ के लिए वर्तमान विभेदक निदान में सुधार, उपलब्ध उपचार का अनुकूलन में मदद मिलेगी, और चिकित्सा के लिए नए लक्ष्य की पहचान ।

इस संदर्भ में, कैंसर में अनुसंधान कई वर्षों के लिए किया गया है का उपयोग कर अमर सेल लाइंस9। ये प्रयोगात्मक मॉडल सामान्य रूप से मानक monolayer में culture हैं समर्थन करता है या immunodeficient कुतर में प्रत्यारोपित करने के लिए vivo xenograft मॉडल10 में स्थापित. अमर सेल लाइनों एक प्रबंधनीय और आसान करने के लिए दुकान सामग्री है जिसके साथ अनुसंधान प्रयोगों की एक पर्याप्त संख्या प्रदर्शन किया जा सकता है प्रतिनिधित्व करते हैं । वे वास्तव में कर रहे हैं, कम खर्चीली और सबसे व्यापक रूप से नैदानिक अध्ययन11में उपकरण का इस्तेमाल किया ।

हालांकि, सेल लाइन आधारित कैंसर मॉडल भी कुछ सीमाएं हैं, जैसे एक monolayer प्रणाली में लंबे समय तक संस्कृति एक साथ मार्ग की बढ़ती संख्या के साथ phenotypic और आनुवंशिक बहाव लाती है, कोशिकाओं को कम दोहराऊंगा कुंजी ट्यूमर होने की संभावना बना सुविधाओं. इसके अलावा, सेल लाइन संस्कृतियों सेल को पुन: पेश करने के लिए सेल संपर्क और अणु crosstalk संकेत है कि ट्यूमर के जैविक व्यवहार की नकल और ट्यूमर microenvironment विशेषता असफल । ये समस्याएँ नैदानिक और नैदानिक परिणाम12के बीच मौजूद अंतर के आधार पर प्रपत्र ।

उपर्युक्त को देखते हुए, रोगी-व्युत्पंन प्राथमिक संस्कृतियों में रुचि13बढ़ गई है । दरअसल, घातक और सामांय ऊतक के उत्पाद कैंसर कोशिका phenotype और विविधता खोने के जोखिम को कम कर देता है, इस प्रकार शुरू सामग्री है कि ट्यूमर microenvironment के अधिक प्रतिनिधि है की पेशकश की । इसके अलावा, शल्य चिकित्सा लकीर के दौर से गुजर रोगियों से काटा ताजा ट्यूमर नमूनों का उपयोग हमें एकल ट्यूमर की जांच करने के लिए और एक रोगी के शरीर के एक ही भाग से अलग घावों की तुलना करने के लिए सक्षम बनाता है14. उपरोक्त कारणों के लिए, ऊतक व्युत्पंन सेल संस्कृतियों एक बहुमूल्य सामग्री प्रदान करने के लिए ट्यूमर pathophysiology और औषध विज्ञान के अध्ययन के लिए15,16,17, विशेष रूप से अनुसूचित जनजातियों में जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सार्कोमा सेल लाइनों 18सीमित हैं । हम इस प्रकार एक रोगी को स्थापित करने के लिए एक विधि को अनुकूलित अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक सेल शल्य चिकित्सा उत्पादेड ट्यूमर ऊतक से शुरू संस्कृति13,19,20। हमारे विधि एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए रातोंरात एंजाइमी ऊतक पृथक्करण द्वारा पीछा छोटे ऊतक टुकड़े में ट्यूमर नमूने को एकत्र करने के होते हैं । अगले दिन, एंजाइमी पाचन ताजा संस्कृति मीडिया जोड़कर बंद कर दिया है और प्राप्त निलंबन ऊतक टुकड़े, सेल समुच्चय, और अधिक मैट्रिक्स सामग्री या मलबे को दूर करने के लिए फ़िल्टर किया गया है । अंत में, अलग ट्यूमर कोशिकाओं का एक अंश ग्लास स्लाइड पर cytospinned है, स्थिर और बहाव cytomorphological, immunohistochemical और आणविक सितोगेनिक क मूल्यांकन द्वारा अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृति की स्थापना की पुष्टि करने के उद्देश्य से विश्लेषण के लिए संग्रहीत (जैसे MDM2 प्रवर्धन के मछली विश्लेषण एक अच्छी तरह से विभेदित liposarcoma और विभेदित liposarcoma के लिए मानक विभेदक निदान का प्रतिनिधित्व करताहै ) 4. शेष कोशिकाओं जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा और औषधीय अध्ययन के लिए एक मानक monolayer संस्कृति में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । सभी प्रयोगों कम मार्ग प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग कर विशिष्ट कैंसर उपक्लोनों के चयन से बचने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं, और एक अनुभवी सार्कोमा पैथोलॉजिस्ट द्वारा विश्लेषण किया । हम इस प्रकार एक पूरी तरह से मानव अनुसूचित जनजातियों पूर्व vivo मॉडल13,19,20बनाया है । इस उच्च बहुमुखी, मॉडल को संभालने के लिए आसान नैदानिक अनुसंधान के विभिंन प्रकार के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व कर सकता है, जैसे निदान और पूर्वानुमान के लिए नए आणविक मार्करों की पहचान या गतिविधि और तंत्र की एक गहरी समझ हासिल करने के लिए अनुसूचित जनजातियों के प्रबंधन में प्रयुक्त मानक और नई औषधों की कार्रवाई.

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Protocol

अनुसूचित जनजातियों कोशिकाओं को एक ट्यूमर बड़े पैमाने पर शल्य चिकित्सा से अनुसूचित जनजातियों के साथ रोगियों से अलग कर रहे हैं । प्रोटोकॉल स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और अच्छा नैदानिक अभ्यास दिशानिर्देश और हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार किया जाता है । सभी मरीजों को पढ़ाई में हिस्सा लेने के लिए लिखित रूप से रजामंदी दी । सर्जिकल नमूनों एक अनुभवी सार्कोमा पैथोलॉजिस्ट द्वारा विश्लेषण और सर्जरी के 3 घंटे के भीतर संसाधित कर रहे हैं ।

1. ट्यूमर नमूना संग्रह और प्रसंस्करण:

  1. DMEM कम ग्लूकोज मध्यम एक आयल फिल्म के साथ बंद की ५० मिलीलीटर के साथ एक १०० मिलीलीटर बाँझ मूत्र कंटेनर में एक सार्कोमा पैथोलॉजिस्ट की मदद से ट्यूमर नमूनों को इकट्ठा ।
  2. ट्यूमर लकीर के बाद 3 एच की एक अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.
  3. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के तहत सभी निम्न चरणों का पालन करें ।
    1. ७०% इथेनॉल के साथ डाकू निष्फल और बाँझ दस्ताने पहनते हैं ।
    2. ७०% इथेनॉल के साथ इस्पात आईनॉक्स चिमटी निष्फल (एक बाँझ धुंध का उपयोग करें).
    3. मूत्र कंटेनर से तेल फिल्म निकालें और त्यागें ।
    4. ७०% इथेनॉल के साथ मूत्र कंटेनर के बाहरी धो ।
    5. एक चौकोर पेट्री डिश खोलें ।
    6. मूत्र कंटेनर खोलें और वर्ग पेट्री पकवान निष्फल इस्पात आईनॉक्स चिमटी का उपयोग कर में ट्यूमर नमूनों हस्तांतरण ।
  4. दो बार पंजाबियों के साथ ट्यूमर नमूने धो लें ।
  5. एक बाँझ शल्य स्केलपेल खोलो ।
    1. पतले 1-2mm 3 टुकड़ों में ट्यूमर नमूनों टुकड़ा ।
    2. एक 2-एमएल ट्यूब में कुल नमूना के एक चौथाई ले लीजिए ।
    3. trizol रिएजेंट की 1 मिलीलीटर जोड़ें (ट्यूब के लिए खरीदा) और तुरंत पर स्थिर-८० ° c (नमूना बहाव अनुसूचित जनजाति जीन अभिव्यक्ति मूल्यांकन के लिए अनुप्रवाह विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाएगा) ।
  6. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पतले कटा हुआ ट्यूमर सामग्री के बाकी ले लीजिए ।
    1. collagenase प्रकार मैं समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें (collagenase प्रकार मैं पंजाब में भंग कर रहा है, 4 µ जी की एकाग्रता पर/
    2. DMEM उच्च संस्कृति मीडिया के 4 मिलीलीटर के साथ collagenase प्रकार मैं समाधान पतला (collagenase प्रकार के अंतिम एकाग्रता मैं 2 µ g/एमएल) है ।
    3. 15 एमएल ट्यूब और आयल फिल्म के साथ सील बंद करो ।
    4. 15 मिनट के लिए पाचन को सक्रिय करने की स्थिति में ३७ ° c में एक मशीन में एक रोलिंग शेखर में १५ मिलीलीटर ट्यूब रखो ।
    5. 15 मिनट के बाद कमरे के तापमान पर रात भर सरगर्मी शर्तों के तहत रोलिंग शेखर में ट्यूब की दुकान ।
  7. अगले दिन बाँझ डाकू के तहत 15 मिलीलीटर ट्यूब डाल दिया ।
  8. धीरे एक ५०-एमएल ट्यूब के शीर्ष करने के लिए संलग्न एक १०० µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन फिल्टर ।
  9. DMEM उच्च संस्कृति मीडिया के साथ फ़िल्टर धो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% glutamine के साथ पूरक, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
  10. १०० µm बाँझ फिल्टर को त्यागें, ५०-एमएल ट्यूब बंद करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २२५ x g पर केंद्रापसारक ।
  11. ट्यूब को पलटने से supernatant को त्याग दें ।
  12. 1-2 मिलीलीटर DMEM के साथ कोशिकाओं को पुनः निलंबित उच्च संस्कृति मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% glutamine, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक ।
    नोट: मात्रा ट्यूमर नमूने संसाधित की मात्रा पर निर्भर करता है ।
  13. Neubauer कक्ष के साथ कक्षों को गिनना ।
    1. trypan ब्लू में नमूना 1:2 पतला और कोशिकाओं को गिनने के लिए कमजोर पड़ने के 10 µ l का उपयोग करें ।
    2. कम से दो बार गिनती करें और एकत्रित कक्षों की कुल माध्य संख्या जानने के लिए प्रतिकृति के माध्य की गणना करें ।
  14. ८०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर एक मानक monolayer संस्कृति में प्लेट कोशिकाओं/2।
    नोट: प्रयोगों में नियंत्रणों को हमेशा शामिल करें । प्रत्येक शर्त के लिए ंयूनतम 3 तकनीकी प्रतिकृति निष्पादित करें । न्यूनतम 2 जैविक प्रतिकृति निष्पादित करें । नैदानिक औषध विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, प्रयोगों से कैंसर कोशिका phenotypes खोने से बचने के लिए सेल सीडिंग के 30-45 दिनों के भीतर संस्कृति मार्ग की एक कम संख्या के साथ किया जाना चाहिए ।
  15. कोशिकाविज्ञान नमुना तयारी.
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% glutamine के साथ पूरक DMEM उच्च संस्कृति मीडिया के २०० µ एल में १००,००० कोशिकाओं को इकट्ठा, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
    2. पिपेट समाधान (२०० µ l पिपेट) एक डिस्पोजेबल एक फिल्टर के साथ सुसज्जित कीप में और एक गिलास स्लाइड के साथ घुड़सवार.
    3. cytocentrifuge खोलें और नमूने डालें ।
    4. भागो cytocentrifuge पर १८.६ x जी के लिए 20 मिनट ।
    5. फ़िल्टर से सुसज्जित फ़नल छोड़ें.
    6. 5 मिनट के लिए क्लोरोफॉर्म द्वारा पीछा 10 मिनट के लिए एसीटोन में स्लाइड को ठीक करें ।
    7. स्लाइड-20 ° c पर संग्रहीत है ।
      नोट: गल और दाग से पहले नमूनों हाइड्रेट और निर्माता के निर्देशों का पालन दाग प्रदर्शन करते हैं । न्यूनतम 3 तकनीकी प्रतिकृति तैयार करें ।

2. अनुसूचित जनजातियों सेल संस्कृतियों:

  1. एक सप्ताह में एक बार मीडिया बदलें (DMEM उच्च संस्कृति मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% glutamine और 1% पेनिसिलिन/streptomycin) के साथ पूरक ।
    1. २००-१,००० µ l पिपेट का उपयोग करके संस्कृति माध्यम को त्यागें ।
    2. एक २००-१,००० µ एल पिपेट का उपयोग कर नए ताजा माध्यम जोड़ें ।
    3. सेल मार्ग:
      1. जब संगम ९०% के आसपास हो तब कक्षों को अलग कर ᱶ:
        नोट: अनुसूचित जनजातियों सेल संस्कृति प्रवर्धन संस्कृति की स्थिति के आधार पर एक सप्ताह में एक बार किया जाना चाहिए ।
      2. मध् यम छोड़ें, पंजाबियों से धो लें और पंजाब में trypsin 1x के 2-3 mL जोड़ें
        नोट: प्रयुक्त trypsin की मात्रा प्रसंस्कृत कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करता है प्राप्त की ।
      3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं ।
      4. एक २००-१,००० µ एल पिपेट का उपयोग कर प्लेट से अलग कोशिकाओं लीजिए ।
      5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलग कोशिकाओं पिपेट और DMEM उच्च संस्कृति मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% glutamine के साथ पूरक, और एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
      6. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २२५ x g पर केंद्रापसारक ।
      7. supernatant को त्यागें ।
      8. DMEM उच्च संस्कृति मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% glutamine, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा फिर से सेल गोली निलंबित ।
      9. एक नई संस्कृति की थाली में कोशिकाओं बीज या निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अंतिम मात्रा के साथ एक कुप्पी ।
        नोट: कक्षों को 1:3 से अधिक विभाजित न करें ।

3. बहाव का विश्लेषण:

नोट: विभिंन प्रयोगों की एक किस्म इस मॉडल का उपयोग कर बाहर किया जा सकता है (नीचे देखें) । इसलिए, यह अध्ययन के डिजाइन चरण के दौरान तय करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे विश्लेषण किया जाएगा ताकि नमूनों की पर्याप्त संख्या और प्रतिकृति तैयार की जा सके ।

  1. प्रसार परख जैसे MTT 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड
  2. ऐसे टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ (TdT) निक एंड लेबलिंग (TUNEL) परख के रूप में अपोप्तोटिक परख
  3. Immunohistochemical विश्लेषण
  4. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण
  5. पश्चिमी दाग विश्लेषण
  6. एलिसा परख
  7. प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) विश्लेषण
  8. vivo में xenograft मॉडल

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Representative Results

हम एक सरल विधि के लिए रोगी की एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना प्राप्त नरम ऊतक सार्कोमा और रिपोर्ट यहां एक विशिष्ट अनुसूचित जनजातियों पर प्राप्त परिणामों का एक उदाहरण के लिए डिज़ाइन किया गया13histotype । प्रोटोकॉल विभिंन अनुसूचित जनजातियों की प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया गया था अच्छी तरह से विभेदित liposarcoma, histotypes liposarcoma, myxoid liposarcoma, pleomorphic liposarcoma, myxofibrosarcoma, विभेदक सहित pleomorphic सार्कोमा, सार, व desmoid fibromatosis.

प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए सफलता दर ५४% (24 अनुसूचित जनजातियों से 13 प्राथमिक संस्कृतियों शल्य चिकित्सा नमूनों) कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी या इलाज नहीं के साथ इलाज रोगियों से व्युत्पंन शल्य चिकित्सा नमूनों के लिए था । इसके विपरीत, यह ७२% (18 अनुसूचित जनजातियों शल्य चिकित्सा नमूनों से 13 प्राथमिक संस्कृतियों) अनुपचारित रोगियों से ही व्युत्पंन शल्य चिकित्सा के नमूनों के लिए किया गया था ।

ट्यूमर कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से अलग-विभेदित/liposarcoma (ALT/DDLPS) शल्य चिकित्सा से एक ५४ वर्षीय रोगी से हटा दिया गया । MDM2 प्रवर्धन विश्लेषण, वर्तमान में alt/DDLPS के मानक विभेदक निदान के लिए प्रदर्शन किया और एक अनुभवी सार्कोमा पैथोलॉजिस्ट द्वारा समीक्षा की, सकारात्मक था, एक ऑल्ट/DDLPS घावों की उपस्थिति की पुष्टि (चित्रा 1) । पृथक ट्यूमर कोशिकाओं में MDM2 प्रवर्धन के कोशिकाविज्ञान विश्लेषण एक रोगी की स्थापना की पुष्टि की-ALT/DDLPS प्राथमिक संस्कृति (९४.६% प्रसंस्कृत कोशिकाओं का MDM2 प्रवर्धन के लिए सकारात्मक थे) (चित्रा 1बी) । प्राथमिक संस्कृति मानक monolayer संस्कृतियों और सेल व्यवहार्यता में मार्ग के बाद पैदा करना करने के लिए जारी रखा MTT और Tunel परख द्वारा निगरानी की गई ।

इस मॉडल ने हमें ऑल्ट/DDLPS प्राथमिक संस्कृति की संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए वर्तमान में इस्तेमाल किया या alt/DDLPS जैसे ifosfamide (IFO), epirubicin (महामारी), संयोजन IFO + महामारी, trabectedin (TRABE) के उपचार के लिए नैदानिक मूल्यांकन के तहत सक्षम और eribulin (ऐरी), MTT परख का उपयोग कर प्रदर्शन किया । परिणामों कीमोथेरेपी (चित्रा 2) के लिए संस्कृतियों की संवेदनशीलता की पुष्टि की । सबसे सक्रिय उपचार IFO + महामारी, एक पहली पंक्ति में इस्तेमाल किया चिकित्सा उंनत या मेटास्टेटिक ऑल्ट/DDLPS था । इसके अलावा, सेल आकृति विज्ञान दवा जोखिम के बाद जांच की थी, नियंत्रण के संबंध में प्राथमिक संस्कृति में ighlighting रूपात्मक परिवर्तन में परिणाम और साइटोटोक्सिक परख के निष्कर्षों (चित्रा 2बी) । के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, कई बहाव विश्लेषण इस मॉडल के साथ किया जा सकता है । चित्रा 3 विधि का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रदान करता है और एक समय के भीतर जो प्रयोगों के शोधों के परिणाम प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए शामिल हैं ।

Figure 1
चित्र 1 . रोगी की स्थापना-ऑल्ट DDLPS की प्राथमिक संस्कृति व्युत्पंन । एक) सीटू संकरण में (मछली) एक रोगी ऊतक नमूना (100X छवि) में MDM2 प्रवर्धन का पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया । ख) सीटू संकरण में (मछली) एक प्राथमिक संस्कृति (100X आवर्धन) में MDM2 प्रवर्धन का पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . एक ऑल्ट में कीमोथेरेपी/DDLPS प्राथमिक संस्कृति । क) कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया: ifosfamide (IFO), epirubicin (महामारी), IFO + महामारी, trabectedin (TRABE), और eribulin (ऐरी) । प्रत्येक प्रयोग के लिए तीन स्वतंत्र प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (एसई), के रूप में कहा, n के साथ दोहराने की संख्या का संकेत है । दो-पुच्छीय विद्यार्थी के t-परीक्षण, * p < 0.05 द्वारा समूहों के बीच अंतर का मूल्यांकन किया गया । ख) दवा जोखिम (2x वृद्धि) के बाद ALT/DDLPS प्राथमिक संस्कृति की छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृति मॉडल । समय सीमा और संभव बहाव के विश्लेषण सहित अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृति के प्रारंभिक नैदानिक मॉडल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

अच्छी तरह से परिभाषित नैदानिक मॉडल के लिए ट्यूमर के आणविक पृष्ठभूमि स्पष्ट की जरूरत है, गरीब रोग का निदान भविष्यवाणी, और कैंसर रोगियों के लिए नए चिकित्सीय रणनीतियों का विकास । यह ऐसी अनुसूचित जनजातियों के रूप में जिनकी उच्च विविधता, आक्रामक क्षमता, और नैदानिक व्यवहार अनुसूचित जनजातियों जीव विज्ञान और रोगी प्रबंधन21की हमारी समझ को चुनौती के रूप में दुर्लभ ट्यूमर के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, कुछ वाणिज्यिक सार्कोमा सेल लाइनों उपलब्ध mesenchymal ट्यूमर के इस समूह में नैदानिक जांच सीमा18। पूर्व vivo मॉडल इस प्रकार अनुसूचित जनजातियों के लिए एक मूल्यवान अनुसंधान संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं । हम विकसित एक पूरी तरह से मानव इन विट्रो में अनुसूचित जनजातियों के मॉडल शल्य चिकित्सा से संप्रदाय ट्यूमर ऊतक (चित्रा 3) से शुरू । विधि के अनुकूलन के दौरान, कई महत्वपूर्ण मुद्दों को संबोधित किया और समाधान किया गया । पहली समस्या शल्य चिकित्सा उपचार और नमूना प्रसंस्करण के बीच समय अंतराल चिंतित. शुरू में, जब ट्यूमर नमूने एक निश्चित समय के बाद हमारे विज्ञान प्रयोगशाला में पहुंचे, वे 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहीत और अगले दिन संसाधित किया गया । अनुसूचित जनजातियों इन नमूनों से पृथक कोशिकाओं मानक monolayer संस्कृति में कम प्रसार गतिविधि और गरीब व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया । यह भाग में, इस तथ्य के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है कि पूरे ट्यूमर नमूना कार्रवाई होने से पहले मूत्र कंटेनर में समय की एक लंबी अवधि के लिए रखा जाता है । हम इस प्रकार की सर्जरी के बाद 3 ज की एक अधिकतम करने के लिए नमूना प्रसंस्करण के प्रारंभिक समय को संशोधित करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्राथमिक संस्कृति मानक monolayer संस्कृति और प्रदर्शन अच्छी व्यवहार्यता में पैदा करना जारी रखा । हम भी सेल के एकीकरण की प्रक्रिया को अनुकूलित: छोटे सजातीय ऊतक टुकड़े एंजाइमी पाचन की सुविधा के लिए आवश्यक हैं, और यह एक स्केलपेल का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । इसके अलावा, हालांकि प्रोटोकॉल विभिंन आकारों के नमूनों के साथ काम किया, एक प्राथमिक सीमित आकार के नमूनों से शुरू संस्कृति की स्थापना (< 2 cm) और अधिक मुश्किल को प्राप्त है । collagenase एकाग्रता एक और महत्वपूर्ण मुद्दा था क्योंकि बहुत उच्च anenzyme एकाग्रता सेलुलर तनाव पैदा कर सकता है, अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृति या ट्यूमर सेल अस्तित्व में कमी में phenotypic परिवर्तन करने के लिए अग्रणी । अच्छा एंजाइमी पाचन मैट्रिक्स सामग्री और मलबे से कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है । हम अंत में एंजाइम एकाग्रता अनुकूलित पाचन चरण में उपयोग करने के लिए । इसके अलावा, सेलुलर तनाव को सीमित करने और अलगाव चरण के दौरान अनुसूचित जनजाति कोशिकाओं के लिए पोषक तत्वों प्रदान करने के लिए हम फिर से ऐसे पंजाबियों के रूप में अंय एजेंट के बजाय संस्कृति मीडिया में एंजाइम निलंबित कर दिया । अंत में, कई ऐसे liposarcoma और myxofibrosarcoma के रूप में विभिंन अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृतियों पर प्रदर्शन प्रयोगों समय पर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता चला और कीमोथेरेपी के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता13,20। इन निष्कर्षों रोगी के लंबे समय तक संस्कृति के कारण एक monolayer प्रणाली में अनुसूचित जनजातियों कोशिकाओं को एक साथ मार्ग की बढ़ती संख्या के साथ, दोनों जिनमें से phenotypic और आनुवंशिक बहाव प्रेरित कर रहे हैं । ट्यूमर ऊतक दोहराऊंगा करने के लिए समय पर इस संस्कृति प्रणाली की कमी विश्वसनीयता, के रूप में पहले से दिखाया गया है, पूर्व vivo मॉडल की सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक का प्रतिनिधित्व करता है22,23. हम इस प्रकार (ट्यूमर कोशिका बोने के 30-45 दिनों के भीतर) और कम यात्रा संस्कृतियों का उपयोग करके reproducible और शोधों के परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोग करने में समय को कम करने के द्वारा प्रोटोकॉल अनुकूलित. इसके अलावा, प्राथमिक संस्कृतियों जमे हुए किया जा सकता है, लेकिन उनके बाद व्यवहार्यता ट्यूमर स्थान, अनुसूचित जनजातियों histotype, शल्य चिकित्सा नमूना और संस्कृति के मार्ग की संख्या की राशि सहित कई कारकों पर निर्भर है प्रदर्शन किया ।

हमारी प्रणाली के कई फायदे हैं, यानी यह एक पूरी तरह से मानव नैदानिक मॉडल है, इसके विपरीत में अन्य murine-आधारित सार्कोमा सेल लाइन मॉडल24,25,26,27. इसके अलावा, अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना की पुष्टि whilst, एक अनुभवी सार्कोमा पैथोलॉजिस्ट के समर्थन के साथ cytomorphological, immunohistochemical और आणविक सितोगेनिक क मूल्यांकन, द्वारा हासिल की, हमारे प्रोटोकॉल में अनिवार्य है , यह हमेशा अंय अनुसूचित जनजातियों प्राथमिक संस्कृति मॉडल के लिए मामला नहीं है । कुछ कागजों में शल्य नमूनों से बरामद कोशिकाओं के बहाव का विश्लेषण निदान की पुष्टि के बिना किया गया था प्राथमिक संस्कृतियों में अनुसूचित जनजातियों सेल प्रतिशत28। हमारी प्रणाली भी बहुमुखी है, reproducible और प्रयोगों की एक विस्तृत विविधता प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, सेल सीडिंग, और बाहरी उत्तेजनाओं विशिष्ट सुविधाओं और प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । इस मॉडल के विकास के लिए हमें रोगी की संवेदनशीलता की जांच करने के लिए सक्षम अनुसूचित जनजातियों कोशिकाओं को विभिंन वर्तमान में इस्तेमाल किया या अनुसूचित जनजातियों के उपचार के लिए नैदानिक मूल्यांकन के तहत दवाओं के लिए । इस मॉडल, इसलिए, चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी और, अगर आगे अनुकूलित करने के लिए, संभावित व्यक्तिगत चिकित्सा में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिनैदानिक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । यह भी नैदानिक या शकुन आणविक मार्करों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अनुसूचित जनजातियों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण जहां कुछ विशिष्ट उपमार्क्स उपलब्ध हैं । प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक अपेक्षाकृत कम समय प्राथमिक संस्कृति की स्थापना के बाद अनुप्रवाह विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध है । प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा और दोनों ट्यूमर और प्राथमिक समय पर एक ही रोगी से व्युत्पंन को ट्यूमर के ऊतकों के विविधता नकल प्राथमिक संस्कृति की क्षमता का आकलन करने के लिए clustering विश्लेषण प्रदर्शन से सुधार किया जा सकता है, विशेष रूप से उन अनुसूचित जनजातियों histotypes के लिए जो एक नैदानिक मार्कर उपलब्ध नहीं है । इस तरह के विश्लेषण भी आगे कैसे प्राप्त संस्कृति में कोशिकाओं के ट्यूमर के नमूनों से सीधे व्युत्पंन से अलग विशेषताएं करने में मदद मिलेगी ।

अंत में, मजबूत नैदानिक मॉडल की स्थापना के लिए ट्यूमर विकृति के बारे में हमारी समझ अग्रिम आवश्यक है । हमें विश्वास है कि हमारे मॉडल को आणविक तंत्र है कि अनुसूचित जनजातियों के गरीब पूर्वानुमान के लिए जिंमेदार है उजागर करने में मदद मिलेगी और नए चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान के लिए योगदान देगा ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

लेखक संपादकीय सहायता के लिए Gráinne Tierney का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose EuroClone ECB7501L
Fetal bovine serum EuroClone ECS0180D
Glutamine Gibco 25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
Penicillin streptomycin Gibco 15140122
Triazol reagent Ambion Life-Technologies 15596018
Trypsin EuroClone ECB3052D

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कैंसर अनुसंधान अंक १३४ रोगी प्राथमिक संस्कृति व्युत्पंन नरम ऊतक सार्कोमा मानव नैदानिक मॉडल इन विट्रो में दुर्लभ ट्यूमर शल्य चिकित्सा नमूना
रोगी की एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना-कोमल ऊतक सार्कोमा व्युत्पंन
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De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).

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