Summary
次のプロトコルは、患者由来の軟部肉腫 (STS) の主要な文化の確立に焦点を当てください。このモデルでは、分子の背景、これらのまれな悪性腫瘍の薬理学的プロファイルを理解する私たちを助けることができる、STS 管理の改善に向けたさらなる研究のための開始点を表すことができます。
Abstract
軟部組織肉腫 (STS) は、異種悪性腫瘍診断が困難、分類、および管理とのスペクトルを表します。日には、これらのまれな腫瘍の 50 以上の組織学的サブタイプが同定されています。したがって、彼らの驚くべき多様性と発生率が低いため、これらの腫瘍の生物学の私達の理解はまだ限られています。患者由来の文化は、STS の病態と薬理学の研究に理想的なプラットフォームを表します。このように外科的切除を受けた患者から収穫される腫瘍の標本から STS の人間前臨床モデルを作成しました。患者由来 STS 細胞培養は、コラゲナーゼの消化力によって摘出標本から得られ、濾過によって分離します。セルがカウント、シードしの標準的な単層培養 14 日間左し、下流の分析によって処理されます。細胞機能と、利用可能な場合の評価を通じて確認した STS 初代培養の確立医薬や分子の解析を実行する前に免疫組織化学的マーカー。このメソッドは、これらの不十分な検討悪性腫瘍の自然史を勉強するには 1) と 2) の作用メカニズム詳細については努力でさまざまな薬物の効果をテストするための便利なツールを表します。
Introduction
軟部組織肉腫 (STS) は、間葉系由来会計すべて固形腫瘍1,2, 1% の異機種混在病変のスペクトルと新しい世界保健機関の分類は 50 以上の存在を認識しサブタイプが異なる3。これらのうち、最も一般的な histotypes、脂肪肉腫や脂肪肉腫、平滑筋肉腫、15% とすべてアダルト STS、それぞれ4、5の 11% を占めます。STS は、体のさまざまな部分で成長できる、四肢と後腹膜が 60% とそれぞれ6の場合の 20% で発生する、最も一般的なサイトです。
ローカライズされた疾患の治療の基礎は広範囲の外科的切除、術前・術後の化学療法の利点がまだ明確でないと選択された場合は7にのみと見なされます。転移性の設定では、化学療法の標準治療が限られた結果8に示します。STS の分子生物学のよりよい理解は、現在の差動診断を改善、利用可能な治療の最適化、および療法のための新しいターゲットを識別に役立つでしょう。
このコンテキスト内で不死化細胞ライン9を使用して長年にわたって癌の研究を行った。これらの実験モデルは通常標準的な単分子膜サポートで培養または、生体内で異種移植モデル10を確立する免疫不全齧歯動物に注入します。不死化細胞株は、研究実験の十分な数を行うことができます管理およびストア簡単材料を表します。彼らは、実際には、少なくとも高価な最も広く臨床研究11でツールを使用します。
ただし、セルライン基づく癌モデルもいくつかの制限があります、例えば延長通路数の増加とともに単分子膜における文化誘導表現型、遺伝的浮動作る細胞ほどキーとなる癌を要約するには機能。さらに、ライン培養細胞は、細胞間相互作用やシグナル伝達の分子クロストーク腫瘍の生物学的挙動を模倣し、がん微小環境の特徴を再現する失敗します。これらの問題は、既存の前臨床および臨床結果12の間のギャップの基礎を形成します。
上記を考えると、患者由来の主な文化への興味は13に増加しています。確かに、癌と正常組織の切除は癌細胞の表現型とより腫瘍微小環境の代表は、原料をご提供の不均一性を失うことのリスクを軽減します。また、外科的切除を受けた患者から収穫される新鮮な腫瘍の標本の使用は、単一の腫瘍を調べると患者の体14の同じ部分から異なる病変を比較する私たちできます。上記の理由から、組織由来細胞培養腫瘍病態と薬理学15,16,17, 特にどの市販肉腫細胞株における STS の研究に貴重な資料を提供します。限定18です。我々 はこのため手術時摘出腫瘍組織13,19,20から始まって患者由来 STS 一次電池文化を確立する方法を最適化しました。本手法は、腫瘍標本を単一細胞懸濁液を取得する一晩の酵素組織解離に続いて小さな組織片に分解ので構成されます。次の日は新鮮な培地を追加することで酵素消化を停止し、得られた懸濁液を抽出し、組織片、細胞凝集塊と余分なマトリックス材料やゴミを取り除きます。最後に、孤立した腫瘍細胞の割合はスライド ガラス固定し、細胞形態学的、免疫組織化学、分子細胞遺伝学的評価による STS の主な文化の確立を目的と下流の分析のため保存に cytospinned(例えば魚における MDM2 増幅は高分化型脂肪肉腫と dedifferentiated の脂肪肉腫の標準的な鑑別診断を表します)4します。 残りの細胞は遺伝子発現プロファイリングと薬理学的研究のための標準的な単層培養に播かれます。低い使用して、実験を行いすべては通路の初代培養特異的ながんのサブクローンの選択を避けるために、経験豊富な肉腫の病理学者によって分析しました。このように完全に人間 STS ex vivoモデル13,19,20を作成しました。この汎用性の高い、簡単にハンドル モデルは異なったタイプの臨床研究など診断と予後のための新しい分子マーカーを識別するかのメカニズムと活動をより深く理解するための便利なツールを表すことができます。STS の管理で使用される標準および新しい薬剤のアクション。
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Protocol
STS 細胞質量手術 STS 患者から摘出した腫瘍から分離されます。このプロトコルは、ローカル倫理委員会によって承認されている、よい臨床練習のガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従って実行されます。すべての患者は、研究に参加する書面によるインフォームド コンセントを与えた。摘出標本は経験豊富な肉腫の病理学者によって解析し、手術後 3 時間以内に処理されます。
1. 腫瘍標本収集と処理:
- パラフィン フィルムで密封 DMEM 低グルコース培地 50 mL で 100 mL 滅菌尿容器に肉腫の病理学者の助けを借りて、腫瘍標本を収集します。
- 腫瘍切除後 3 h の最大 4 ° C でサンプルを格納します。
- 滅菌のティッシュ文化フードの下のすべての次の手順を実行します。
- 70% エタノールでフードを消毒し、滅菌手袋を着用します。
- 70% のエタノール (滅菌ガーゼを使用) と鋼ステンレス ピンセットを消毒します。
- 尿容器からパラフィン フィルムを削除し、破棄します。
- 70% エタノールで尿容器の外装を洗ってください。
- 角型シャーレを開きます。
- 尿容器を開き、滅菌鋼ステンレス ピンセットを使用して角型シャーレに腫瘍の標本を転送します。
- PBS での腫瘍の標本を 2 回洗います。
- 無菌手術のメスを開きます。
- 1-2 mm3個の腫瘍の標本細かくシュレッドします。
- 2 mL チューブに総サンプルの 4 分の 1 を収集します。
- (購入) チューブを trizol 試薬 1 mL を追加し、-80 ° C (サンプルは STS 遺伝子発現評価ダウン ストリームの解析に使用されます) ですぐにフリーズします。
- 15 mL チューブに精巧に寸断された腫瘍材料の残りの部分を収集します。
- コラゲナーゼの 4 つの mL を追加私にソリューション (4 μ G/ml の濃度で、PBS に溶解しているコラゲナーゼ タイプ) を入力します。
- コラゲナーゼを希釈 4 ml DMEM 高文化メディアのソリューション型 (最終濃度コラゲナーゼ型の私は 2 μ G/ml)。
- 15 mL チューブを閉じてパラフィン フィルムでシールします。
- 15 mL チューブを消化させる 15 分攪拌条件で 37 ° C でインキュベーターでローリング シェーカーに入れてください。
- 15 分後に、一晩室温で撹拌条件下でローリング シェーカーにチューブを格納します。
- 次の日は、滅菌のフードの下で 15 mL のチューブを置きます。
- 軽く 50 mL チューブの上部に接続されている 100 μ m の滅菌フィルターを介して細胞懸濁液をフィルターします。
- 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン 1%, 10% 牛胎児血清を添加した DMEM 高文化メディアでフィルターを洗浄します。
- 100 μ m の滅菌フィルターを捨てて、50 mL のチューブを閉じ、室温で 5 分間 225 × g で遠心します。
- チューブを反転して上清を破棄します。
- 1-2 mL DMEM 高文化メディアの 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン 1%, 10% 牛胎児血清を添加した細胞再中断します。
注:ボリュームは、腫瘍サンプルの処理量に依存します。 - ノイバウアー室を持つセルをカウントします。
- トリパン ブルー色素のサンプル 1:2 を希釈し、希釈の 10 μ L を使用してセルをカウントします。
- 少なくとも 2 回カウントし、収集したセルの合計の平均数を知っている複製の平均を計算します。
- 80,000 のセル/cm2の密度で単層培養細胞。
注:常に実験でコントロールを含めます。各条件の少なくとも 3 の技術的なレプリケートを実行します。少なくとも 2 の生物的複製を実行します。臨床薬理学、遺伝子発現、タンパク質発現解析の実験実施されなければならない文化通路の数が少ないと細胞が癌細胞の表現型を失うことを避けるために播種の 30-45 日以内。 - 細胞試料。
- 200 μ L 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン 1%, 10% 牛胎児血清を添加した DMEM 高文化メディアに 100,000 細胞を収集します。
- ピペット使い捨て漏斗にソリューション (200 μ L ピペット) フィルター、ガラス スライドを搭載します。
- 収集を開き、サンプルを挿入します。
- 20 分間 18.6 x g で、収集を実行します。
- 目標到達プロセス、フィルター搭載を破棄します。
- 10 分 5 分クロロホルムによって続いてのアセトンのスライドを修正します。
- -20 ° C でスライドを保存します。
注:雪解けに汚れる前にサンプルをメタンハイド レートし、染色の製造元の指示に従ってを実行します。少なくとも 3 技術的複製を準備します。
2. STS 細胞培養:
- 週に一度 (DMEM 高文化メディア 10% 牛胎児血清、グルタミン 1% 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと補われる) メディアを変更します。
- 200-1,000 μ L ピペットを使用して培養液を破棄します。
- 200-1,000 μ L ピペットを使用して新しい新鮮な培地を追加します。
- セル通過:
- 合流点が約 90% のセルをデタッチします。
注:STS 細胞培養増幅は、培養条件に基づいて週に一度実行必要があります。 - 媒体を廃棄し、PBS で洗浄、トリプシン 1 2 3 mL を追加し PBS で x
注:トリプシンの使用量は、得られた培養細胞の量に依存します。 - 37 ° C で 3-5 分のための細胞を孵化させなさい
- 200-1,000 μ L ピペットを使用してプレートから剥離細胞を収集します。
- 15 mL チューブに剥離細胞をピペット、1% ペニシリン/ストレプトマイシン酵素反応を停止する、1% のグルタミン, 10% 牛胎児血清を添加した DMEM 高培地 4 mL を追加します。
- 室温で 5 分間 225 × g で遠心分離機します。
- 上清を捨てます。
- 再 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン 1%, 10% 牛胎児血清を添加した DMEM 高培地 1 mL を追加することによって細胞のペレットを中断します。
- 新しい培養プレートまたは製造元の指示に従って最終巻とフラスコのセルをシードします。
注:1:3 以上の細胞を分割しないでください。
- 合流点が約 90% のセルをデタッチします。
3. 下流解析:
注:さまざまなさまざまな実験は、このモデル (下記参照) を使用して実施することができます。したがって、どの解析が実行されるは、十分な数のサンプルと複製を準備することができますので、研究の設計段階の間に決定することが重要です。
- MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイドなど増殖アッセイ
- ターミナルトランスフェラーゼ (TdT) などアポトーシス アッセイ ニック端標識 (tunel)
- 免疫組織化学的解析
- 遺伝子発現解析
- 西部のしみの分析
- ELISA の試金
- 蛍光活性化セル (FACS) 分析を並べ替え
- 異種移植モデル生体内で
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Representative Results
患者由来の軟部肉腫の主な文化の確立を取得し、結果を得られた 1 つの特定の STS histotype13の例をここで報告する簡単な方法を考案しました。プロトコルは高分化脂肪肉腫を含む別の STS histotypes の初代培養の確立のために使用された、脱分化型脂肪肉腫、粘液型脂肪肉腫、多形型脂肪肉腫、未分化 myxofibrosarcoma多形細胞肉腫、GIST、デスモイド線維腫症。
初代培養の確立のための成功率は、手術標本に由来する化学療法、放射線療法または扱われない患者 54% (24 STS 手術サンプルから 13 の主な文化)。逆に、未治療の患者に由来するだけ手術のサンプル 72% (18 STS 手術サンプルから 13 の主な文化) だった。
腫瘍細胞は、よく-differentiated/脱分化型脂肪肉腫 (ALT/DDLPS) 54 歳の患者から摘出から分離されました。MDM2 増幅解析は現在 ALT/DDLPS の標準的な差動診断を行うし、ALT/DDLPS 病変 (図 1A) の存在を確認する肯定的だった、経験豊富な肉腫の病理学者によって審査します。MDM2 増幅分離腫瘍細胞の細胞学的分析、患者由来 ALT/DDLPS 初代培養 (培養細胞の 94.6 %mdm2 増幅陽性であった) の確立を確認した (図 1B)。プライマリ カルチャが単層培養継代後増殖を続けており、MTT と Tunel によって監視されたセル実行可能性の試金。
このモデルでは、現在使用されているさまざまな薬物または ALT/DDLPS のイホスファミド (ifo ファイル)、エピルビシン (EPI)、IFO + エピ、トラベクテジン (TRABE) の組み合わせなどの治療のための臨床評価中の ALT/DDLPS 初代培養の感受性をテストすることができましたエリブリン (えり)、MTT の試金を使用して実行されます。結果は、化学療法 (図 2A) 文化の感度を確認しました。最もアクティブな治療だった IFO + エピ、進行性または転移性の ALT/DDLPS で使用される最初ライン療法です。さらに、ighlighting 制御と細胞毒性の試金 (図 2B) の所見に関して主な文化の形態変化の結果の薬物暴露後細胞の形態を調べた。プロトコルで述べたように、このモデルでいくつかのダウン ストリーム解析を実行できます。図 3メソッドの概略を説明し、実験対象となる翻訳結果を取得するタイムライン。
図 1.ALT/DDLPS の患者由来の初代培養の確立。A)患者組織片 (100 X 画像) MDM2 増幅を検出する現場の交配 (魚) が実行されます。B) 現場の交配 (魚) が初代培養 (100 倍) で MDM2 増幅を検出する実行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ALT/DDLPS 初代培養における化学療法。A)セルを施した: イホスファミド (IFO) トラベクテジン (TRABE) IFO + エピ (EPI)、エピルビシン、エリブリン (えり)。各実験の 3 つの独立した複製を行った。データには、複製の数を示す n が、前述のようの平均 ± 標準誤差 (SE) として表示されます。グループ間の違いをおこなった 2 尾スチューデントのt-テスト、* p < 0.05。B)薬物暴露 (2 倍) 後画像の ALT/DDLPS 初代培養。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: STS 初代培養モデル。タイムラインと可能な限り下流解析などを含む STS 初代培養の前臨床モデルの模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
よく定義された臨床前モデルは、腫瘍の分子の背景を解明、予後不良を予測して癌に対する新しい治療戦略の開発に必要です。これは特に STS などのまれな腫瘍の重要な形態の面でその高い異質性、攻撃的な潜在的なおよび臨床的行動課題 STS 生物学および患者管理21の私達の理解。さらに、利用可能ないくつかの商業肉腫細胞株は、間葉系腫瘍18のこのグループに前臨床調査を制限します。つまり、 ex vivoモデルは STS の貴重な研究資源を表します。STS 切除腫瘍 (図 3) からの完全に人間の in vitroモデルを開発しました。メソッドの最適化中にいくつかの重要な問題は解決され解決。最初の問題では、外科的治療とサンプル処理の時間間隔を懸念しています。当初、腫瘍の標本は、一定時間後バイオ サイエンス研究室に到着、4 ° C で夜通し貯え、次の日を処理します。これらのサンプルから分離された STS セルは、低増殖活性および標準的な単層培養で貧しい人々 の生存を表わした。これは一部、という事実に起因するその全体の腫瘍は尿容器に処理される前に時間の長時間にわたって保持されます。したがって、プライマリ カルチャが単層培養で増殖し、良い生存率を展示を続けていることを確認するために手術後 3 h の最大処理サンプルの開始時間を変更しました。我々 はまた細胞分解プロセスを最適化: 酵素消化を容易にする小さな同種組織片が必要とされ、これはメスを使用して達成されました。さらに、プロトコルは、異なるサイズの標本で働いて、標本から始まって主要な文化の確立制限サイズ (< 2 cm) より困難です。高すぎる anenzyme 濃度細胞ストレス、STS の主な文化の表現型の変化または腫瘍細胞生存率の低下につながる場合があるので、コラゲナーゼ濃度だったもう一つの重要な問題です。良い酵素消化は、マトリックス材料や破片から細胞を分離する必要があります。我々 は最終的に消化の段階で使用する酵素濃度を最適化されています。さらに、我々 は細胞ストレスし分離段階で STS 細胞に栄養素を提供すること、PBS などその他の試薬ではなく文化メディアで、酵素を再中断。最後に、肉腫や myxofibrosarcoma など STS プライマリ カルチャに対していくつかの実験は、時間と化学療法13,20に増加感度の遺伝子発現の変化を明らかにしました。これらの調査結果は、通路、両方を誘導表現型と遺伝的浮動の数の増加と共に単分子膜システム STS 患者由来細胞の長期培養に起因します。以前に示すように、腫瘍組織を要約する時間をかけてこの文化システムの減少の信頼性は、前のヴィヴォモデル22,23の最も重要な制限の 1 つを表します。我々 はこのために (腫瘍細胞の播種の 30-45 日間) 内で実験を実行する時間を短縮し、再現性と翻訳結果を得るため低い通路の文化を使用してプロトコルを最適化しました。また、初代培養を凍結することができます、しかし、彼らの後の生存率は腫瘍の位置、STS histotype、手術標本の量と実行文化通路の数を含むいくつかの要因に依存しています。
我々 のシステムにはいくつかの利点、すなわち他マウス ベースの肉腫細胞ライン モデル24,25,26,27と対照をなして完全に人間の前臨床モデルです。さらに、STS 初代培養の確立の確認は、細胞形態学的、免疫組織化学、分子細胞遺伝学的評価によって達成しながらサポート経験豊富な肉腫の病理学者がプロトコル必須、これは常に他の STS の初代培養モデルのためのケースではありません。いくつかの論文で初代培養28診断 STS 細胞割合を確認することがなく細胞標本から回復の下流の分析を行った。当社のシステムはまた汎用性、再現性のある、さまざまな実験を実行する使用することができます。さらに、シード、セルと外部からの刺激は、特定の機能や反応を研究する変更できます。このモデルの開発では、現在使用されているさまざまな薬物または STS の治療のための臨床評価中の STS 細胞患者由来の感受性を調査することができました。このモデルでは、したがって、治療への反応を予測するための重要な臨床ツールを表し、さらに最適化されている場合を個別化治療を改善するために使用可能性がありますします。診断や予後の分子マーカー、STS、いくつか特定のバイオ マーカーが利用できるの特に重要な識別するためにも使えます。プロトコルの制限の 1 つは初代培養の確立の後下流の分析を実行する利用可能な比較的短時間です。プロトコルは、遺伝子発現のプロファイリング、クラスタ リング解析腫瘍の腫瘍組織の不均一性を模倣する初代培養の能力を評価する時間をかけて同じ患者由来初代培養を実行することによって改善される可能性が特に、これらの STS histotypes は、診断マーカーは使用できません。そのような分析は、さらに得られた培養細胞腫瘍のサンプルから直接派生したものとは異なる方法の特性評価にも役立つでしょう。
結論としては、堅牢な前臨床モデルの確立は腫瘍病理学の理解を進めることが不可欠です。STS の予後のためし、新しい治療戦略の同定に貢献する分子メカニズムを明らかに我々 のモデルが役立つと考えています。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
著者は、編集者の支援のため Gráinne ティアニーを感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
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