Summary
El siguiente protocolo se centra en el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente (STS). Este modelo podría ayudarnos a entender mejor el fondo molecular y perfil farmacológico de estos raros tumores malignos y podría representar un punto de partida para futuras investigaciones destinadas a mejorar la gestión de STS.
Abstract
Sarcomas de tejidos blandos (STB) representan un espectro de neoplasias heterogéneas con un difícil diagnóstico, clasificación y gestión. Hasta la fecha, se han identificado más de 50 subtipos histológicos de estos raros tumores sólidos. Así, debido a su extraordinaria diversidad y baja incidencia, nuestra comprensión de la biología de estos tumores es todavía limitada. Paciente derivados de culturas representan la plataforma ideal para el estudio de la farmacología y patofisiología de STS. Así desarrollamos un modelo humano de preclínico de STS a partir de muestras tumorales de pacientes sometidos a resección quirúrgica. Paciente derivado STS cultivos celulares fueron obtenidos de los especímenes quirúrgicos por digestión de colagenasa y aislados por filtración. Las células cuentan, semillas y quedaban durante 14 días en cultivos monocapa estándar y luego procesadas por análisis aguas abajo. Antes de realizar el análisis moleculares o la farmacia, el establecimiento de cultivos primarios STS fue confirmado a través de la evaluación de características cytomorphologic y, cuando esté disponible, marcadores immunohistochemical. Este método representa una herramienta útil 1) para estudiar la historia natural de estas neoplasias pobremente explorados y 2) para probar los efectos de diferentes fármacos en un esfuerzo para aprender más sobre sus mecanismos de acción.
Introduction
Sarcomas de tejidos blandos (STB) incluyen un espectro de lesiones heterogéneas de origen mesenquimal representa 1% de todos los tumores sólidos1,2, y la nueva clasificación de la Organización Mundial de la salud reconoce la presencia de más de 50 diferentes subtipos3. Entre estos, los histotypes más comunes son sarcoma del adipocito o liposarcoma y el leiomiosarcoma, representando el 15% y 11% de todos adultos STS, respectivamente4,5. Aunque STS puede desarrollar en diferentes partes del cuerpo, las extremidades y retroperitoneo son los sitios más comunes, que ocurren en el 60% y el 20% de los casos, respectivamente6.
La piedra angular de la terapia para la enfermedad localizada es la resección quirúrgica amplia, mientras que los beneficios de la quimioterapia adyuvante y neoadyuvante aún no están claros y son considerados sólo en casos seleccionados7. En el entorno metastásico, la quimioterapia es el estándar de cuidado pero muestra resultados limitados8. Una mejor comprensión de la biología molecular de STS ayudaría a mejorar el diagnóstico diferencial actual, optimizar los tratamientos disponibles e identificar nuevas dianas para el tratamiento.
En este contexto, se ha realizado investigación en cáncer durante muchos años con líneas de células inmortalizadas9. Estos modelos experimentales normalmente son cultivados en monocapa estándar soporta o implantados en roedores inmunodeficientes para establecer modelos de xenoinjerto en vivo 10. Líneas celulares inmortalizadas representan un material manejable y fácil a las tiendas con las que se puede realizar un amplio número de experimentos de investigación. Son, de hecho, el menos costoso y más ampliamente utilizado herramienta de estudios preclínicos11.
Sin embargo, modelos de línea celular en cáncer también tienen algunas limitaciones, por ejemplo prolongada cultura en un sistema de monocapa junto con un número cada vez mayor de pasajes induce fenotípica y deriva genética, que hace menos probable células recapitular tumor clave características. Por otra parte, cultivos de la línea de celulares no reproducir la interacción célula a célula y señalización interferencia de molécula que imitan el comportamiento biológico de los tumores y caracterizar el microambiente tumoral. Estos temas constituyen la base de la brecha existente entre los resultados preclínicos y clínicos12.
Dado lo anterior, ha aumentado el interés en cultivos primarios derivados del paciente13. De hecho, la supresión del tejido maligno y normal reduce el riesgo de perder el fenotipo de la célula de cáncer y de la heterogeneidad, ofreciendo material de partida que es más representativo del microambiente tumoral. Por otra parte, el uso de muestras de tumor fresco cosechado de pacientes sometidos a resección quirúrgica nos permite investigar los tumores individuales y comparar diversas lesiones de la misma parte del cuerpo de un paciente14. Por las razones expuestas, cultivos de células derivadas de tejido proporcionan un valioso material para estudiar tumor Fisiopatología y Farmacología15,16,17, especialmente en el STB en que líneas de células de sarcoma comercialmente disponibles son limitado18. Así hemos optimizado un método para establecer una cultura de célula primaria de STS paciente derivado a partir de la excisión quirúrgica del tumor tejido13,19,20. Nuestro método consiste en desagregar a la muestra de tumor en los fragmentos pequeños de tejido seguidas por la disociación enzimática de tejido durante la noche para obtener una suspensión unicelular. Al día siguiente, la digestión enzimática se detiene mediante la adición de medio fresco de cultivo y la suspensión obtenida se filtra para remover fragmentos de tejido, agregados de la célula y exceso de matriz material o escombros. Por último, una fracción de las células tumorales aisladas es cytospinned sobre portaobjetos de vidrio, fijos y almacenados para análisis posteriores destinadas a confirmar el establecimiento del cultivo primario STS cytomorphological, immunohistochemical y evaluación citogenética molecular (p. ej. análisis de los pescados de MDM2 amplificación representa el estándar diagnóstico diferencial de un liposarcoma bien diferenciado y liposarcoma dedifferentiated) 4. las células restantes se siembran en una cultura estándar monocapa para estudios farmacológicos y perfiles de expresión génica. Todos los experimentos se realizan con bajos pasajes cultivos primarios para evitar la selección de subclones de cáncer específico y analizan por un patólogo experimentado sarcoma. Así hemos creado un humano STS vivo ex modelo13,19,20. Este versátil, fácil de manija modelo podría representar una herramienta útil para diferentes tipos de investigación preclínica, por ejemplo, para identificar nuevos marcadores moleculares para el diagnóstico y pronóstico o para obtener una comprensión más profunda de la actividad y los mecanismos de acción de estándar y nuevos fármacos utilizados en el tratamiento del STB.
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Protocol
STS células están aisladas de un tumor suprimido masa quirúrgico de pacientes con STB. El protocolo ha sido aprobado por el Comité de ética Local y se realiza según las directrices de buena práctica clínica y la declaración de Helsinki. Todos los pacientes dieron consentimiento informado para participar en el estudio. Los especímenes quirúrgicos son analizados por un patólogo experimentado sarcoma y procesados dentro de 3 horas de cirugía.
1. tumor recogida de muestras y procesamiento:
- Recoger las muestras de tumor con la ayuda de un patólogo de sarcoma en un contenedor de orina estéril de 100 mL con 50 mL de DMEM glucosa baja medio sellado con una película de parafina.
- Almacenar las muestras a 4 ° C por un máximo de 3 h después de la resección del tumor.
- Realizar los siguientes pasos bajo una campana de cultivo estériles para tejidos.
- Esterilizar la campana con etanol al 70% y guantes estériles.
- Esterilice las pinzas de acero inox con etanol al 70% (uso una gasa estéril).
- Retire la película de parafina el envase de la orina y descartar.
- Lave el exterior del contenedor de orina con etanol al 70%.
- Abrir una caja de Petri cuadrada.
- Abra el envase de la orina y transferir a las muestras de tumor en la placa Petri cuadrada utilizando las pinzas esterilizadas de acero inox.
- Lavar a las muestras de tumor con PBS dos veces.
- Abrir un bisturí quirúrgico estéril.
- Triturar finamente las muestras de tumor en pedazos de3 1-2 mm.
- Recoger un cuarto de la muestra total en un tubo de 2 mL.
- Añadir 1 mL del reactivo de trizol (comprado) en el tubo y congelar inmediatamente a-80 ° C (la muestra se utilizará en el análisis posterior para la evaluación de expresión del gene del STS).
- Recoger el resto del material finamente triturado tumor en un tubo de 15 mL.
- Añadir 4 mL de colagenasa tipo I solución (tipo colagenasa está disuelta en PBS, en una concentración de 4 μg/mL).
- Diluir la colagenasa tipo I solución con 4 mL de DMEM alta cultura media (concentración final de colagenasa tipo es 2 μg/mL).
- Cierre el tubo de 15 mL y sellar con la película de parafina.
- Poner el tubo de 15 mL en un agitador balanceo en una incubadora a 37 ° C en condiciones de agitación de 15 minutos activar la digestión.
- Después de 15 min guardar el tubo en el agitador balanceo bajo agitación condiciones a temperatura ambiente durante la noche.
- Al día siguiente pone el tubo de 15 mL debajo de la cubierta estéril.
- Suavemente, filtrar la suspensión de células a través de un filtro estéril de 100 μm a la parte superior de un tubo de 50 mL.
- Lave el filtro con medios de cultivo alta DMEM suplementado con 10% suero fetal bovino, glutamina 1% y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Descarte el filtro estéril de 100 μm, cerrar el tubo de 50 mL y centrifugar a 225 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Eliminar el sobrenadante por inversión del tubo.
- Resuspender las células con DMEM alta 1-2 mL medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 1% y 1% de penicilina/estreptomicina.
Nota: El volumen depende de la cantidad de tumor muestra procesada. - Contar las células con una cámara de Neubauer.
- Diluir la muestra 1:2 en trypan azul y 10 μl de la dilución para contar las células.
- Contar por lo menos dos veces y calcular el promedio de las repeticiones para saber el número medio total de las células recogidas.
- Células de la placa en una cultura estándar monocapa a una densidad de 80.000 células/cm2.
Nota: Siempre incluyen controles en los experimentos. Realizar al menos 3 repeticiones técnicas para cada condición. Realizar al menos 2 réplicas biológicas. Farmacología Preclínica, expresión génica y análisis de expresión de la proteína, experimentos deben llevarse a cabo con un bajo número de pasajes de la cultura dentro de 30-45 días de siembra celular para evitar perder cáncer de fenotipos de células. - Preparación de la muestra citológica.
- Recoger 100.000 células en 200 μL de DMEM alto medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 1% y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Pipeta de la solución (una pipeta de 200 μL) en un embudo desechable equipada con un filtro y montado con un portaobjetos de vidrio.
- Abra la Citocentrifuga y coloque las muestras.
- Ejecute la Citocentrifuga 18,6 x g por 20 min.
- Deseche el embudo equipado con el filtro.
- Fije los portaobjetos en acetona durante 10 min seguida de cloroformo durante 5 minutos.
- Almacenar las diapositivas a-20 ° C.
Nota: Descongelar e hidratar las muestras antes de la tinción y realizar la tinción siguiendo las instrucciones del fabricante. Preparar al menos 3 repeticiones técnicas.
2. las culturas STS de la célula:
- Cambiar los medios de comunicación una vez por semana (DMEM alto medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 1% y 1% de penicilina/estreptomicina).
- Descartar el medio de cultivo utilizando una pipeta de 200-1.000 μl.
- Agregar nuevo medio natural utilizando una pipeta de 200-1.000 μl.
- Paso de la célula:
- Separar las células cuando la confluencia es alrededor del 90%:
Nota: Amplificación de la cultura de célula de STS debe realizarse una vez por semana sobre la base de las condiciones de cultivo. - Deseche el medio, lavar con PBS y añadir 2-3 mL de tripsina 1 x en PBS
Nota: El volumen de la tripsina utilizado depende de la cantidad de células cultivadas obtenidas. - Incube las células 3-5 min a 37 ° C.
- Recoger las células separadas de la placa con una pipeta de 200-1.000 μl.
- Pipetear las células separadas en un tubo de 15 mL y añadir 4 mL de DMEM alto medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 1% y 1% de penicilina/estreptomicina para detener la reacción enzimática.
- Centrifugue a 225 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante.
- Resuspenda el precipitado de células mediante la adición de 1 mL de DMEM alto medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 1% y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Las células en una placa de cultivo nuevo o un frasco con un volumen final según las instrucciones del fabricante de la semilla.
Nota: No dividir las células más que 1:3.
- Separar las células cuando la confluencia es alrededor del 90%:
3. posteriores análisis:
Nota: Una variedad de diferentes experimentos puede llevarse a cabo utilizando este modelo (ver más abajo). Por lo tanto, es crucial decidir durante la fase de diseño del estudio que analiza se realizará por lo que se puede preparar un número suficiente de muestras y repeticiones.
- Ensayos de proliferación como el bromuro de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium MTT
- Análisis de apoptosis como la transferasa terminal del deoxynucleotidyl (TdT) nick final etiquetado ensayo (TUNEL)
- Análisis de Immunohistochemical
- Análisis de expresión génica
- Análisis de Western blot
- Ensayo ELISA
- Celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS)
- En vivo el modelo de xenoinjerto
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Representative Results
Hemos diseñado un método sencillo para obtener el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente e informar aquí un ejemplo de los resultados obtenidos en un determinado histotype de STS13. El protocolo fue utilizado para el establecimiento de cultivos primarios de diferentes histotypes de STS como liposarcoma bien-distinguido, dedifferentiated liposarcoma, liposarcoma mixoide, liposarcoma pleomórfico, myxofibrosarcoma, Indiferenciado pleomórfico sarcoma GIST y desmoides fibromatosis.
La tasa de éxito para el establecimiento de cultivos primarios fue 54% (cultivos primarios 13 de 24 muestras quirúrgicas STS) para especímenes quirúrgicos derivados de pacientes tratados con quimioterapia, radioterapia o no tratados. Por el contrario, fue 72% (cultivos primarios 13 de 18 muestras quirúrgicas del STS) para las muestras quirúrgicas derivadas solamente de pacientes no tratados.
Las células del tumor fueron aisladas de un liposarcoma bien-distinguido/dedifferentiated (ALT/DDLPS) extraído quirúrgica de un paciente de 54 años de edad. Análisis de amplificación MDM2, actualmente realizada para el diagnóstico diferencial estándar de ALT/DDLPS y revisado por un patólogo experimentado sarcoma, fue positiva, confirmando la presencia de una lesión ALT/DDLPS (figura 1A). El análisis citológico de MDM2 amplificación en las células tumorales aisladas confirmó el establecimiento de un paciente derivado ALT/DDLPS cultivo primario (94,6% de las células cultivadas fueron positivas para la amplificación MDM2) (figura 1B). El cultivo primario continuó a proliferar después de pasajes en cultivos monocapa estándar y viabilidad celular fue supervisado por el MTT y Tunel ensayo.
Este modelo nos permitió probar la sensibilidad de la cultura primaria de ALT/DDLPS a diferentes fármacos utilizados actualmente o bajo evaluación clínica para el tratamiento de ALT/DDLPS como ifosfamida (IFO), epirubicina (EPI), la combinación IFO + EPI, trabectedina (altura), y eribulina (ERI), que se realizó mediante el ensayo MTT. Los resultados confirmaron la sensibilidad de las culturas a la quimioterapia (figura 2A). El tratamiento más activo fue IFO + EPI, una terapia de primera línea utilizada en ALT/DDLPS avanzado o metastásico. Además, la morfología celular fue examinada después de la exposición, resulta en cambios morfológicos de ighlighting en el cultivo primario con respecto al control y los resultados del análisis citotóxico (figura 2B). Como se menciona en el protocolo, pueden realizarse varios análisis posteriores con este modelo. Figura 3 proporciona una representación esquemática del método e incluye una línea de tiempo en el que los experimentos deben realizarse para obtener resultados traslacionales.
Figura 1 . Establecimiento de cultivo primario paciente derivado de ALT/DDLPS. A) In situ del hibridación (pescado) realizado para detectar amplificación MDM2 en una muestra de tejido del paciente (imagen de 100 X). B) In situ del hibridación (pescado) se realiza para detectar amplificación MDM2 en un cultivo primario (100 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Quimioterapia en un cultivo primario de ALT/DDLPS. A) las células fueron tratadas con: ifosfamida (IFO), epirubicina (EPI), IFO + EPI, trabectedina (altura) y la eribulina (ERI). Se realizaron tres réplicas independientes para cada experimento. Datos se presentan como media ± error estándar (SE), como se dijo, con la n que indica el número de repeticiones. Diferencias entre grupos fueron evaluadas por de dos colas estudiante t-test, * p < 0.05. B) cultivo primario imágenes de ALT/DDLPS después de la exposición de la droga (2 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Modelo de cultivo primario de STS. Representación esquemática del modelo preclínico de STS en cultivo primario incluyendo la línea de tiempo y los posibles análisis aguas abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Modelos preclínicos bien definidos son necesarios para dilucidar el fondo molecular de tumores, predecir pronóstico pobre y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para pacientes con cáncer. Esto es especialmente importante para los tumores raros como STS cuya alta heterogeneidad en términos de morfología, comportamiento agresivo de la clínico y potencial desafía nuestra comprensión de la biología de STS y tratamiento del paciente21. Por otra parte, las líneas de células de sarcoma comercial pocos disponibles limita las investigaciones preclínicas en este grupo de tumores mesenquimales18. Modelos ex vivo así representan un recurso de investigación valioso para el STB. Hemos desarrollado un modelo plenamente humanos en vitro de STS a partir de tejido del tumor resecado quirúrgicamente (figura 3). Durante la optimización del método, varios temas críticos fueron abordados y resuelto. El primer problema refiere el intervalo de tiempo entre tratamiento quirúrgico y procesamiento de las muestras. Inicialmente, cuando muestras de tumor llegaron a nuestro laboratorio de biociencias después de cierto tiempo, fueron almacenados durante la noche a 4 ° C y procesadas al día siguiente. Las STS células aisladas de estas muestras exhibieron actividad de proliferación baja y pobre viabilidad en cultivo monocapa estándar. Esto puede atribuirse en parte al hecho de que muestra tumor entero se mantiene durante un período prolongado de tiempo en el envase de la orina antes de ser procesada. Por lo tanto modificamos el tiempo a partir de la muestra de proceso a un máximo de 3 h después de la cirugía para asegurar que el cultivo primario continúa de proliferar en cultivo monocapa estándar y presentan buena viabilidad. También hemos optimizado el proceso de desagregación celular: fragmentos pequeños de tejido homogéneo son necesarios para facilitar la digestión enzimática, y esto se logró con un bisturí. Por otra parte, aunque el protocolo se trabajó con muestras de diferentes tamaños, el establecimiento de un cultivo primario a partir de muestras de limitado tamaño (< 2 cm) es más difícil de lograr. La concentración de colagenasa fue otro tema importante porque anenzyme demasiado alta concentración puede causar estrés celular, llevando a cambios fenotípicos en el cultivo primario de STS o una disminución en la supervivencia de la célula tumoral. Buena digestión enzimática es necesaria para separar las células de escombros y material de la matriz. Finalmente hemos optimizado la concentración de enzima a utilizar en la fase de digestión. Por otra parte, para limitar el estrés celular y proporciona nutrientes para las células STS durante la fase de aislamiento resuspendió la enzima en medios de cultivo en lugar de otros reactivos, tales como PBS. Por último, varios experimentos realizados en cultivos primarios de diferentes STS como liposarcoma y myxofibrosarcoma revelaron cambios en la expresión génica en el tiempo y aumento de la sensibilidad a la quimioterapia13,20. Estos resultados son atribuibles a la cultura prolongada de células STS derivadas del paciente en un sistema de monocapa junto con un creciente número de pasajes, tanto de que inducen fenotípica y la deriva genética. La fiabilidad decreciente de este sistema de cultivo en el tiempo para recapitular el tejido del tumor, como se muestra, representa una de las limitaciones más importantes de ex vivo modelos22,23. Así hemos optimizado el protocolo al reducir el tiempo en el que realizar experimentos (dentro de 30-45 días de la siembra de la célula del tumor) y mediante el uso de culturas de paso bajo para obtener resultados reproducibles y traslacionales. Por otra parte, los cultivos primarios pueden ser congelados, pero su posterior viabilidad depende de varios factores, incluyendo la localización del tumor, STS histotype, cantidad de espécimen quirúrgico y el número de pasajes de la cultura realizado.
Nuestro sistema tiene una serie de ventajas, es decir, es un modelo preclínico plenamente humano, en contraste con otros basados en murine sarcoma de la célula línea modelos24,25,26,27. Además, mientras que la confirmación del establecimiento de cultivos primarios de STS, logrado por cytomorphological, immunohistochemical y evaluación citogenética molecular, con el apoyo de un sarcoma experimentado patólogo, es obligatorio en nuestro protocolo , esto no es siempre el caso para otros modelos de cultivo primario de STS. En algunos trabajos, se realizó análisis aguas abajo de las células de especímenes quirúrgicos sin confirmar el porcentaje de diagnóstico el STS celular en los cultivos primarios28. Nuestro sistema también es versátil, reproducible y puede utilizarse para realizar una amplia variedad de experimentos. Por otra parte, célula siembra y estímulos externos pueden modificarse para estudiar las respuestas y características específicas. El desarrollo de este modelo nos permitió investigar la sensibilidad del paciente STS las células derivadas de diferentes fármacos utilizados actualmente o bajo evaluación clínica para el tratamiento del STB. Este modelo, por lo tanto, representa una importante herramienta preclínica para predecir la respuesta a la terapia y, si además, pueden utilizar para mejorar la terapia personalizada. También podría utilizarse para identificar marcadores moleculares diagnósticos o pronósticos, especialmente importantes en STS donde algunos biomarcadores específicos están disponibles. Una de las limitaciones del protocolo es el relativamente corto tiempo disponible para realizar análisis de aguas abajo después del establecimiento del cultivo primario. El protocolo puede mejorarse realizando el perfil de expresión génica y clustering análisis para tumor y cultivos primarios derivados de un mismo paciente con el tiempo para evaluar la capacidad de la cultura primaria para imitar la heterogeneidad del tejido del tumor, especialmente para los histotypes de STS para que un marcador de diagnóstico no está disponible. Tales análisis nos ayudaría para caracterizar cómo las células en la cultura obtenida difieren de las derivadas directamente de muestras tumorales.
En conclusión, el establecimiento de modelos preclínicos robustos es esencial para avanzar en nuestra comprensión de la patología tumoral. Creemos que nuestro modelo ayudará a descubrir los mecanismos moleculares que son responsables del pronóstico pobre de STS y contribuirán a la identificación de nuevas estrategias terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
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