Summary
Cerebral organoids repræsenterer en nye modelsystem til at undersøge tidlig menneskelige hjerne udvikling i vitro. Denne artikel giver den detaljeret metode til effektivt generere homogene dorsale forhjernen-type organoids fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller herunder kritiske karakterisering og validering trin.
Abstract
Den menneskelige cortex er stærkt udvidet og udstiller en kompleks struktur med specifikke funktionelle områder, giver højere hjernefunktion, såsom kognition. Bestræbelser på at studere menneskelige hjernebarken udviklingen har været begrænset af tilgængeligheden af modelsystemer. Omsætte resultater fra gnaver undersøgelser til det menneskelige system er begrænset til arter forskelle og undersøgelser på primære væv er hæmmet af en mangel på væv tilgængelighed samt etiske bekymringer. Seneste udvikling i humane pluripotente stamceller (PSC) teknologi omfatter generation af tre-dimensionelle (3D) selvorganiserende organotypic kultur systemer, som efterligner til en visse omfang menneske-specifikke hjerne udvikling i vitro. I øjeblikket er forskellige protokoller tilgængelige for generation af enten hele hjernen eller hjerne-regionen specifikke organoids. Metoden for generation af ensartet og reproducerbar forhjernen-type organoids fra induceret PSC (iPSC), som vi tidligere har etableret og beskrive her, kombinerer PSC iboende evne til at selv organisere med guidede differentiering mod den forreste neuroectodermal afstamning og matrix indlejring for at støtte dannelsen af en kontinuerlig neuroepithelium. Mere specifikt denne protokol omfatter: (1) generation af iPSC aggregater, herunder konvertering af iPSC kolonier til en sammenflydende éncellelag kultur; (2) induktion af anterior neuroectoderm; (3) integrering af neuroectodermal aggregater i en matrix stillads; (4) generation af forhjernen-type organoids fra neuroectodermal aggregater; og (5) fiksering og validering af forhjernen-type organoids. Som sådan, giver denne protokol en let anvendelig ordning for generation af standardiserede og reproducerbare iPSC-afledte kortikale væv strukturer i vitro.
Introduction
Den menneskelige hjerne er klart en af de mest komplekse organer og er ansvarlig for alle menneskelige intellektuelle evner. En dybere forståelse af menneskelige-specifikke hjernens udvikling er således en afgørende forudsætning for forståelsen af menneskets kognitive evner. Traditionelt, transgene dyr fungerede som modelorganismer til at undersøge hjernens udvikling. Disse modeller leveres grundlæggende indsigt i principperne for hjernens udvikling. Vi ved nu, at en fælles funktion af hjernens udvikling hos alle pattedyr er en præcis koreografi stamfader spredning, neurogenese og neuronal migration. Der er dog betydelige strukturelle forskelle mellem hjerner af modelorganismer som gnavere og mennesker, især i neocortex. De primære mekanismer, der er blevet foreslået at bidrage til primat kortikale evolution er en øget spredning af stamceller og stamfader celler og generation af ydre radial glia celler (oRGCs), der findes kun meget sjældent i gnavere1 ,2,3.
Metoder til model menneskelige hjernebarken udvikling omfatter generation af PSC-afledte telencephalic stamceller og hjernebarken projektion neuroner som éncellelag kulturer. Disse standardiserede differentiering protokoller replay visse aspekter af menneskelig kortikale udvikling som den stereotype tidsmæssige rækkefølge af kortikale neurogenese4. De falder dog kort når det kommer til sammenfatning af udviklingsprocesser for organogenesis såsom rumlige mønstre og morfogenese. Nyere udvikling i stamceller biologi førte til oprettelsen af 3D organoid kulturer fra PSC'er, som revolutionerer forskning af in vitro- humane organogenesis. Udnytte PSC'er kapacitet til selvstændig organisere i organotypic strukturer, har forskellige organoids, som afspejler vigtige strukturelle og funktionelle egenskaber af organer, herunder nyrer, gut, øjet og hjernen været etableret5. Sådanne organoids indeholder flere orgel-specifikke cellulære undertyper, som kan samle og rumligt organisere meget lig den udvikle organer i vivo5,6. Derudover afslørede celle sammensætning, lineage forhold og genet netværk undersøgelser ved hjælp af encellede RNA sekventering at menneskelige cerebral organoids trofast sammenfatte vigtige aspekter af menneskelig føtal neocortex udvikling såsom gen expression programmer 7 , 8. en større ulempe, som forhindrede deres bred anvendelse hidtil, var dog stor batch til batch variationer og organoid til organoid heterogenitet9.
Her give vi en detaljeret protokol for en enkel og standardiseret forhjernen-type organoid kultur system. Det centrale element i dette system er, at det effektivt og reproducerbar genererer PSC-afledte organoids næsten eksklusiv dorsale telencephalic identitet. Protokollen er baseret på de metoder, der anvendes i vores seneste Celle rapporter papir10. Det kombinerer selvorganisering kapacitet på iPSCs med selektiv induktion af kortikale neuroepithelium og håndfast kan generere homogene kulturer af tidlige dorsale telencephalic væv inden 3 uger. Protokollen bygger på tidligere rapporteret SMAD signalering og Wnt hæmning strategi, der guider differentiering af PSC mod forreste neuroectodermal slægt11,12 i kombination med matrix indlejring, som fremmer dannelsen af omfattende og kontinuerlige neuroepithelial strukturer13. Vi har med succes brugt metoden beskrevet på forskellige iPSC linjer, med flere kloner pr. person. Vi viste, at dette system er velegnet til downstream applikationer hvor reproducerbarhed og ensartethed er af stor betydning som sygdom modellering. Når anvendelsen af protokollen til iPSCs stammer fra patienter lider af en svær kortikale misdannelse, var vi i stand til at sammenfatte patologiske kendetegnende for sygdommen i vitro og identificere nye molekylære mekanismer fører til de fænotypiske ændrer10. Vi foreslår, at den beskrevne organoid protokol kan udnyttes for at lukke kløften mellem reduktionistiske PSC-afledte kortikale éncellelag kulturer og i vivo undersøgelser, og at det repræsenterer en pålidelig og stabil cellebaserede modelsystem til at simulere tidligt menneskelige kortikale udvikling i sundhed og sygdom uden for menneskekroppen.
Protocol
1. generation af iPSC aggregater
- Generation af encellede éncellelag kulturer fra iPSC kolonier
- Forberede en basalmembran ekstrakt (BME) belagt 6-godt plade. Tø BME på isen ved 4 ° C i 2-3 h, fortyndes med koldt Dulbecco ændret Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 1:50 fortyndingen), dække plade med 1 mL/godt af den fortyndede BME løsning og gemme plade natten over ved 4 ° C.
- Opsug mediet og vaske intakt iPSC kolonier af mindst 2 brønde i en 6-godt plade med 0,5 mM EDTA i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) to gange, før inkubere kolonier med 0,5 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) i PBS i 4 min ved stuetemperatur (RT). Opsug EDTA-oploesning og forsigtigt løsne kolonierne ved at vaske dem ned i bunden af fadet med 5 mL af DMEM-F12 medium. Samle dem i en 15 mL tube og pellet ved centrifugering (4 min på 1.200 x g på RT).
Bemærk: iPSCs omprogrammerede fra kommercielt tilgængelige fibroblaster har været med succes brugt10. - Opsug supernatanten og inkuberes iPSC kolonier med 500 µL af celle-dissociation reagens i 6 min. ved 37 ° C.
- Med pipette overfoeres cellesuspension flere gange forsigtigt op og ned med 1 mL pipette at opdele resterende celle klynger i enkelte celler.
- Tilsættes 4 mL af DMEM-F12 til cellesuspension til at fortynde den celle-dissociation reagens.
- Spin celler ned på 1.200 x g i 4 min på RT.
- Resuspend celler i 2 mL af iPSC medium suppleret med 5 µM Y-27632 og frø celler i en brønd på en BME belagt 6-godt plade.
Bemærk: Bruge iPSC medium angivet i Tabel af materialer til en enkelt celle éncellelag iPSC kulturer. - Den næste dag, skal du erstatte medium med friske iPSC medium mangler Y-27632. Fra dette punkt, fortsat kultur celler, skiftende medium hver dag, indtil iPSCs er 100% sammenflydende. Afhængigt af cellelinie og confluency af de begyndende brønde, vil det tage mellem 2-4 dage.
- Når sammenflydende, passage af iPSCs. Opsug medium og anvende 500 µL af celle-dissociation reagens på cellerne.
- Inkuber celler i 5-10 min. ved 37 ° C. Forsigtigt rock plade for at frigøre cellerne.
- Vaske cellerne fra brønden med 2 mL af DMEM-F12 og samle dem i en 15 mL tube. Tilføj DMEM-F12 for en samlet maengde paa 5 mL.
- Spin ned celler ved 1.200 x g i 4 min på RT og Opsug supernatanten.
- Seed cellerne i iPSC medium suppleret med 5 µM Y-27632 i en 1:2 til 1:4 forholdet på en BME belagt 6-godt plade (2 mL/brønd af medium).
- Fortsat kultur cellerne for 2-5 dage og ændre iPSC medium mangler Y-27632 hver dag. Når sammenflydende, passage iPSCs (trin 1.1.4-1.1.8).
Bemærk: Kultur iPSCs for mindst 2 passager som en éncellelag i iPSC medium angivet i Tabel af materialer før du bruger dem for generation af iPSC aggregater til tillader cellerne at tilpasse sig de kultur.
- Bruge éncellelag iPSC kulturer, når de er 70-90% sammenflydende for generation af iPSC aggregater.
Bemærk: iPSC dyrkningsbetingelserne er tilpasset som enkelt celler er mindre tilbøjelige til at understrege, at fører til celledød under proceduren dissociation og sammenlægning. Éncellelag iPSC kulturer skal vise typiske pluripotente morfologi med ingen tegn på differentiering. Teste kulturer på en regelmæssig basis for mycoplasma forurening. Arbejde kun med mycoplasma-fri iPSC kulturer.- Opsug næringssubstratet fra en brønd med en 6-godt plade og anvende 500 µL af celle-dissociation reagens på cellerne.
- Inkuber celler i 5-10 min. ved 37 ° C. Forsigtigt rock plade for at frigøre cellerne.
- Vaske cellerne fra brønden med 2 mL af DMEM-F12 og samle dem i en 15 mL tube. Tilføj DMEM-F12 for en samlet maengde paa 10 mL.
- Til celle optælling, tage 25 µL fra cellesuspension og bland det med 25 µL af trypan blå til at markere døde celler. Tælle de levende celler ved hjælp af en optælling kammer.
- Indsamle nok celler (4.500 celler pr. iPSC samlede) fra cellesuspension i en 15 mL tube.
- Spin ned celler ved 1.200 x g i 4 min på RT og Opsug supernatanten.
- Resuspend celler i et passende volumen af iPSC medium suppleret med 50 µM Y-27632 at opnå 4.500 levende celler pr. 150 µL.
Bemærk: Ved hjælp af en høj koncentration af Y-27632 (50 µM) er afgørende for overlevelsen af iPSCs. - Plade 150 µL i hver godt af en lav-attachment 96-brønd U-nederste plade og placere den i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Når du genererer iPSC aggregater, overveje at mindst 6 organoids er nødvendige for kvalitetskontrollen på dag 20 (Se afsnit 5).
2. induktion af forreste Neuroectoderm
- Nøje overvåge morfologi ændringer af iPSC aggregaterne hver dag under vævskultur mikroskop ved hjælp af en 4 X eller 10 X power linse. Observere på dag 1, celle aggregater med klare grænser. Fortsat kultur iPSC aggregater i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Et vist antal døde celler/brønd er normal og vil ikke påvirke organoid generation. - Feed iPSC aggregater fra dag 2 og fortsætter med hver anden dag ved forsigtigt sugning ca 2/3 af medium uden at forstyrre de celle aggregater i bunden. Tilføje en ekstra 100 µL af iPSC medium mangler Y-27632.
Bemærk: Inden for 4-6 dage vil celle aggregater 350-450 µm i diameter for udstille glatte kanter. - På dette stadium, pool cellen aggregater med et cut 100 µL pipette tip til en lav-attachment 6 cm parabol (højst 20 aggregater/parabol) i kortikale induktion medium indeholdende DMEM-F12 med N2 tillæg (1:200), B27 supplement (1: 100), glukose (0,2 mg/mL), cyklisk adenosin fra (cAMP; 0,15 µg/mL), 0,5% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1% L-alanyl-L-glutamin, heparin (10 µg/mL) og forbindelser LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM), og hæmmer af Wnt svar-1 (IWR-1) (10 µg/mL). Feed celle aggregater ved at ændre det kortikale induktion medium 3 dage efter overføre dem til 6 cm parabol.
- Nøje overvåge morfologiske ændringer under kortikale induktion mikroskopet vævskultur ved hjælp af en 4 X power linse.
Bemærk: Efter 4-5 dage i kortikale induktion medium, bør kanter af celle aggregater begynde at lysne på overfladen, der angiver neuroectodermal differentiering. På dette stadium fremgår radial organisation af en pseudostratified epitel. Gå til afsnit 3 at integrere celle aggregater i en BME matrix.
3. integrering af Neuroectodermal aggregater i en Matrix stillads
- Tø BME på isen ved 4 ° C i 2-3 h. alikvot ufortyndet BME i tilstrækkelige mængder.
- Forberede proceduren for indlejring en plastik paraffin film ark. Skær plast paraffin film ved hjælp af steril saks i 4 cm x 4 cm store stykker, Læg et stykke af plastikken paraffin film over en tom 100 µL tip bakke for 100 µL tips, og tryk på med en behandsket finger, så små smilehuller på arket plast paraffin film er lavet (1 di mple/celle samlede behov). Ren plast paraffin film med 70% ethanol og bestråle den med UV-lys (power: 15 watt, bølgelængde: 435 nm) under den lukkede steril bænk i 30 min.
- Overføre hver celle samlet til én dimple af arket plast paraffin film ved hjælp af en 100 µL skåret spidsen med 1,5-2 mm åbning i diameter. I det tilfælde, at to cell aggregater er smeltet, adskille ikke dem. men overføre dem sammen til et smilehul.
- Forsigtigt Aspirér medium omkring celle aggregater ved hjælp af en uklippet 100 µL pipette tip.
Bemærk: Være omhyggelig med ikke at suge celle aggregater ind i spidsen, da dette vil skade aggregater. - Tilføje 40 µL af ufortyndet BME til hver celle aggregat.
- Position hver celle samlet i midten af BME drop ved hjælp af en uklippet 100 µL pipette tip.
Bemærk: Være meget omhyggelig med ikke at skade den udvikle neuroepithelium med pipette spids. - Omhyggeligt overføre arket plast paraffin film ved hjælp af steril pincet til en 10 cm petriskål (eller en anden tilstrækkelig celle kultur parabol) og placere skålen i inkubator for 15-20 min at tillade BME størkne.
- I mellemtiden Forbered en lav-attachment 6 cm parabol der indeholder 5 mL af kortikale induktion medium.
- Efter polymerisering af BME, fjerne de dråber, der indeholder de celle aggregater fra plast paraffin film ark. Drej plast paraffin film over ved hjælp af steril pincet og forsigtigt klemme celle aggregater i den lidt skrå (omkring 30 °) lav-attachment 6 cm parabol indtil dråberne falder af plast paraffin film ark. Overføre maksimalt 16 celle aggregater i en 6 cm parabol.
- Fortsat at udruge celle aggregater ved 37 ° C.
4. generation af forhjernen-type Organoids fra Neuroectodermal aggregater
- En dag efter indlejring i en BME matrix, placere organoid kultur retter på en vuggende celle kultur shaker med en vippe vinkel på 5 ° og 14 rpm, installeret i en celle kultur inkubator.
- Overvåge organoids hver dag. Homogen neuroepithelial loop-lignende strukturer udvikle gradvist efter indlejring i BME matrix.
- Når neuroepithelial loop strukturer er synlige, ændre mediet til organoid differentiering mellem indeholdende DMEM-F12 med N2 tillæg (1:200), B27 supplement (1: 100), glukose (0,2 mg/mL), cAMP (0,15 µg/mL), 0,5% NEAA, 1% L-alanyl-L-glutamin, insulin (2,5 µg/mL)
- Udskift organoid differentiering mellem hver 3-4 dage, indtil det ønskede differentiering tidspunkt er nået. Så fix organoids (Se afsnit 5).
Bemærk: Lejlighedsvis, kan vævet udstille knopper af optisk gennemsigtige væv uden loop strukturer. Selv om dette ikke er ideelt, dette ikke påvirker udviklingen af kortikale strukturer. Organoids kan være kulturperler i organoid differentiering medium for op til 40 dage. For udvidet kultur perioder (40-100 dage) organoid differentiering medium kan suppleres med 1:50 BME at øge væv kompleksitet og med BDNF og GDNF at tillade neuronal overlevelse og modning14,15.
5. fiksering og validering af forhjernen-type Organoids
- For validering, skal du indsamle 6 organoids på dag 20. Bruge 3 organoids til mRNA isolation og PCR analyser. Overføre de yderligere 3 organoids til en 24-godt plade der indeholder PBS ved hjælp af en cut 1 mL pipette spids med en åbning på 3-3,5 mm til fiksering og sekventiel andre analyser.
- Vask af organoids to gange ved omhyggeligt sugning PBS og erstatte det med friske PBS ved hjælp af en 5-mL pipette. Lave organoids for 15 min i kold 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) (pH 7,4).
Forsigtighed: Pas på, at PFA er et kendt kræftfremkaldende. Alt arbejde skal gøres i en kemisk stinkskab nitril handsker. Det anbefales at bære sikkerhedsbriller. Formaldehyd kan forårsage uoprettelige skader på hornhinden. - Opsug PFA omhyggeligt og vask, tre gange ved hjælp af stuetemperatur PBS i 10 min.
- Erstatte PBS med en 30% rørsukkeropløsning (wt/vol, PBS-baseret) og gemme prøver ved 4 ° C til at tillade organoids at dehydrere. Organoids kan opbevares i op til 7 dage indtil videre forarbejdning.
- En dag efter fiksering, pletten pre dehydreret organoids ved at tilføje trypan blå på ca 1:50 i 10 min at tillade visualisering af organoids under cryosectioning proceduren.
- Forberede indlejring medium indeholdende 10% saccharose, 7,5% gelatine wt/vol i PBS, og varm det til 75 ° C, indtil det er flydende.
- Erstat 30% rørsukkeropløsning med indlejring medium og overføre den 24-godt plade på en varme tallerken (60 ° C) i 15 min. til Reagensglasset organoids.
- Dække bunden af indlejring formene med et lag af indlejring medier og placere dem på is at polymerisere.
- Overførsel organoids fra 24-godt plade til integrering forme indeholdende polymere indlejring medium, tilføje yderligere indlejring medium på toppen således, at organoids er dækket, og placere formen hurtigt i en 100% ethanol/tøris frysning () bad temperaturen skal være mellem -30 til-50 ° C) i mindst 1 minut til chok-freeze.
- Placer mug med pincet på tøris midlertidigt og enten gemme dem ved-80 ° C eller direkte fortsætte med cryosectioning.
- Cryosection organoids på 20 µm tykkelse og indsamle sektioner på objektglas, holde styr af sektioner på dias (sekventiel optagelse). Tillad sektioner til tørre på dias i flere timer, før gemme dem ved-80 ° C eller direkte udfører andre farvning.
Representative Results
Standardiseret forhjernen-type organoid protokollen beskrevet her typisk genererer meget homogen organoid kulturer af næsten udelukkende dorsale kortikale identitet fra menneskelige iPSCs senest 20 dage efter dyrkning (protokol skitseret i figur 1 A). Det anbefales at udføre flere kvalitetskontrol trin tid i løbet af den protokol, defineret her som: 'gå' (fortsætte differentiering) og "no-go" (suboptimal kulturer, det anbefales at opsige batchen) (figur 1 ). Det er også tilrådeligt at dokumentere hver kvalitetskontrol trin godt ved at tage billeder og noter.
Den første afgørende skridt i at generere forhjernen-type organoids er at starte med høj kvalitet iPSC kulturer. Det er vigtigt, at iPSCs ikke indeholder større brøkdele af differentierede celler. Kun bruge iPSC kulturer, der til stede som en homogen éncellelag af udifferentierede celler på befolkningens start (tal 1B, C). Det er derudover afgørende at starte med given celle nummer til iPSC sammenlægning. Den første detaljeret inspektion af iPSC aggregaterne skal udføres på dag 2. På dette stadium, bør aggregater have dannet kompakt celle knopper med glatte kanter ('go') uregelmæssig vises aggregeringer eller aggregeringer med hulrum bør være kasseret ("no-go") (tal 1 d, E). Den næste kvalitetskontrol trin skal udføres på dag 10 i protokollen. På dette tidspunkt, celle aggregater skal vise glat og optisk gennemsigtige væv på den ydre overflade, der repræsenterer induktion af neuroectoderm ('go'), der henviser til, at fraværet af sådanne væv angiver suboptimal neurale induktion ("no-go") (tal 1F, G ). Kun disse aggregater, der udviser en gennemsigtig overflade (figur 1F) bør integreres i BME matrix. Når indlejret, udvikle den kortikale organoids kontinuerlig neuroepithelial loop-lignende strukturer, som vil ekspandere hurtigt. Analysere effektiviteten af de kortikale induktion på dag 15 og 20 ved at undersøge, om organoids har udviklet polariseret neurale ectoderm som vist i figur 1H, Jørgensen ('go'). I det tilfælde, at organoids ikke har udviklet sådan neuroepithelial knopper ("no-go" som illustreret i figur 1,I, K), kritisk revision udføres kvalitetskontrol trin til fejlfinding. Hvornår stramt efter protokollen, meget standardiserede organoid partier vil være genereret (tal 2A, B), som vil vise ≥ 90% ensartethed i polariseret neurale ectoderm dannelse inden for og på tværs af partier (figur 2C). En almindelig fejl fører til variabel effektivitet af polariseret neurale ectoderm dannelse er at øge celle startnummer til iPSC sammenlægning, eller til at starte med lav kvalitet iPSC kulturer såsom mycoplasma forurenet kulturer eller kulturer, der indeholder differentierede celler.
En detaljeret validering af den genererede organoids dorsale telencephalic identitet bør udføres på dagen 20. Med henblik herpå, bør 3 organoids fast og immunfluorescens analyselaboratorier. Stratificeret neuroepithelial sløjfer (fig. 3A) express neurale stamceller markør Sox2 (fig. 3B, D), forhjernen markører Pax6 og Otx2 (tal 3 c, E), og den dorsale kortikale markør Emx1 (figur 3 F). disse kortikale sløjfer karakteriseres yderligere ved en apikale lokalisering af N-cadherin og ZO-1 (tal 3 g, H), ventrikulær zone radial glia cell (vRGC)-afledt mikrotubulus, som strækker sig fra den apikale til i basal side af strukturer ( Figur 3 jeg), og apikale beliggende dividere celler, der plette positive for fosforyleres vimentin (p-Vimentin, figur 3J). Celledød kan være til stede inde i organoid strukturer. Centrale apoptose er normale og påvirker ikke udviklingen af kortikale væv. Derudover bør 3 organoids anvendes til at vurdere homogeniteten af protokollen af gen expression analyser. Forhjernen-type organoids Vis udtryk for de dorsale forhjernen markører (FoxG1, Otx2, Emx1), mens udtryk for midthjernen (FoxA2, Pax5) og baghjernen (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) markører er ikke påviselig (figur 3K).
Partier af kvalitetskontrollerede organoids kan bruges til forskellige applikationer som analyser af division flyet af apikale radial gliaceller. I forbindelse foreslår vi udfører dobbelt farvning af antistoffer mod p-Vimentin og Tpx2 (fig. 3J). P-Vimentin er fosforyleret af CDK1 under mitosen og er beliggende i kernen, dermed markerer alle kerner i mitotiske fase16. Tpx2 er en mikrotubulus forbundet protein, der kan visualisere den mitotiske spindel og de apikale processer under interkinetic nukleare migration17,18. Ved hjælp af disse markører, tre aspekter af vRGC division kan i princippet blive analyseret: (I) hvorvidt celle division finder sted på den apikale side, (II) om division flyet er justeret lodret (der angiver symmetrisk celledeling), horisontale eller skrå ( Angiver asymmetrisk celledeling) til den apikale overflade, og (III) om mikrotubulus organisere centre dannes normalt.
Organoids kan også yderligere opdeles i mere komplekse organiseret og stratificeret kortikale væv strukturer. Kortikale strukturer i dag 35 ± 2 organoids er sammensat af en ventrikulær zone (VZ)-, en indre og ydre subventricular zone (SVZ), samt en kortikale plade (CP) - som område. Inden for VZ og den indre og ydre SVZ, kan vRGCs og mellemliggende stamceller (IPs) celler minder om oRGCs identificeres. Derudover oprindelige dannelsen af et lagdelt cortex kan observeres i CP-lignende område med dyb kortikale neuroner udtryk for Tbr1 og Ctip2 inde og øvre kortikale neuroner udtryk for Satb2, samt at udtrykke Reelin celler i de yderste regioner10.
Figur 1 : Skematisk oversigt over organoid protokol og illustration af 'go' og 'no-go' kriterier. (A) skematisk oversigt over protokollen. CI medium: kortikale induktion medium; CD: kortikale differentiering medium. (B-C) Billede af en optimal 90% sammenflydende iPSC éncellelag kultur (B) og en ikke-egnet iPSC kultur udstiller differentiering (C). (D-E) Aggregeret iPSC optimalt i størrelse, celle tæthed, og overflade udseende (D) og to "no-go" celle aggregater udstiller enten celle reservedele hulrum (E, øvre aggregat) eller uregelmæssige kanter (E, lavere samlede) to dage følgende celle sammenlægning. (F-G) Celle aggregater udstiller gennemsigtig og glat kanter (F) og celle aggregater mangler optisk clearing (G). Den gule linje er visualisering område af interesse. (Hansen-K) En optimal organoid med kontinuerlig neuroepithelial sløjfer (H- J) og en organoid, der har kunnet udvikle radialt arrangeret neuroectoderm, (jeg, K) afbildet på dag 15 og 20, henholdsvis. Skala barer, B-C 500 µm; D-K 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Homogenitet og reproducerbarhed af forhjernen-type organoid protokol. (En-B) Repræsentative lysfelt billeder af organoids fra et parti på 15 (A) og dag 26 (B). (C) kvantitative analyser af organoids på dag 20. Organoids, der vises på den ydre overflade en neuroepithelium, genkendelige i lysfelt som optisk klare overfladiske væv med en klar kant og beviser af radial cellulære arkitektur var kvantificeret (n = 3 pr. iPSC linje med mindst 16 organoids per eksperiment). Skala barer, A-B: 500 µm. fejl barer ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Validering af forhjernen-type organoids på dag 20. (En-J) Andre karakterisering af organoids. Organoids organiserer i flere neuroepithelial sløjfer (A, counterstained med DAPI). Stratificeret organiseret celler i neuroepithelial sløjfer express neurale stamceller markør Sox2 (B, D), forhjernen markører Pax6 (C, D) og Otx2 (E), såvel som den dorsale forhjernen markør Emx1 (F). Kortikale loop strukturer udstillet et fint vedhængende junction bælte højst apikale side med ophobning af N-cadherin (G) og zona occludens protein 1 (ZO-1; H). ventrikulær RGCs mikrotubulus netværk (plettet af acetyleret α-tubulin, Ac-badekar) strækker sig fra den apikale til basal side af loop strukturer, (jeg). Prolifererende celler udtrykker p-vimentin (p-Vim) er placeret på den apikale overflade. Mitotiske spindler farves af Tpx2. repræsentant højere forstørrelse billede af en lodret og en vandret opdeling fly er vist til højre (J). (K) RT-PCR analyse for de områdespecifikke transkriptionsfaktorer i dag 20 af to uafhængige sæt af organoids stammer fra 2 forskellige iPSC linjer. FB: fostrets hjerne kontrol; AB: voksen hjerne kontrol. Skala barer, A-D 200 µm; E-jeg 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Epitop | Fortynding |
| Sox2 | 1 - 300 |
| Pax6 | 1 - 500 |
| Otx2 | 1 - 500 |
| Emx1 | 1 - 50 |
| N-cadherin | 1 - 500 |
| ZO-1 | 1 - 100 |
| P-Vimentin | 1 - 1000 |
| Tpx2 | 1 - 500 |
| Acetyleret α-tubulin | 1 - 500 |
| Alexa488 anti-ms | 1 - 1000 |
| Alexa488 anti rb | 1 - 1000 |
| Alexa555 anti-ms | 1 - 1000 |
| Alexa555 anti rb | 1 - 1000 |
Tabel 1: Antistoffer for kvalitetskontrol af organoids på dag 20.
| Primer | Sekvens |
| Otx2 frem | tgcaggggttcttctgtgat |
| Otx2 omvendt | agggtcagagcaattgacca |
| FoxG1 frem | ccctcccatttctgtacgttt |
| FoxG1 omvendt | ctggcggctcttagagat |
| Emx1 frem | agacgcaggtgaaggtgtgg |
| Emx1 omvendt | caggcaggcaggctctcc |
| FoxA2 frem | ccaccaccaaccccacaaaatg |
| FoxA2 omvendt | tgcaacaccgtctccccaaagt |
| Pax5 frem | aggatgccgctgatggagtac |
| Pax5 omvendt | tggaggagtgaatcagcttgg |
| HoxB2 frem | tttagccgttcgcttagagg |
| HoxB2 omvendt | cggatagctggagacaggag |
| HoxA4 frem | ttcagcaaaatgccctctct |
| HoxA4 omvendt | taggccagctccacagttct |
| HoxB4 frem | acacccgctaacaaatgagg |
| HoxB4 omvendt | gcacgaaagatgagggagag |
| HoxB6 frem | gaactgaggagcggactcac |
| HoxB6 omvendt | ctgggatcagggagtcttca |
| 18s frem | ttccttggaccggcgcaag |
| 18s omvendt | gccgcatcgccggtcgg |
Tabel 2: Primer og primer sekvenser for gen expression profil.
Discussion
Hjernen organoids repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere menneskelige hjerne udvikling i vitro , da de giver de relevante arter baggrund og den komplekse 3D arrangement af celler i forbindelse med væv. Med det bygge de bro mellem ikke-menneskelige dyremodeller og reduktionistisk menneskelige todimensional éncellelag celle kultur teknikker. Deres programmer hæmmes imidlertid af manglende reproducerbarhed9. Vi har udviklet en forhjernen-type organoid protokol, som overvinder den store prøve til prøve variation ved at kombinere iPSC selvorganiserende kapacitet med deres imødekommenhed til mønster faktorer. Specifikt, iPSCs blev lagt sammen for at fremme selv-organisering og efterfølgende hæmme TGF-β/SMAD signalerer til fremme dorsale cortex differentiering ved at udsætte kulturer til en BMP (LDN-193189) og en TGF-β type I-receptor inhibitor (A83-01). Derudover blev en sammensat hæmme Wnt vej (IWR) til at forhindre, at posteriorization anvendt. I modsætning til 'iboende' cerebral organoid protokoller19, som er baseret på samlesæt uden ekstern kontrol giver anledning til temmelig heterogene hjernen organoids og udviser stor batch variationer (målt ved effektivitetsgevinsterne af polariseret neurale ectoderm dannelse15), protokollen beskrevet her reproducerbar genererer homogene forhjernen-specifikke organoids fra menneskelige iPSCs.
Disse forhjernen-type organoids kan bruges til en bred vifte af applikationer som Neuro-udviklingsmæssige undersøgelser, evolutionær undersøgelser herunder gen funktion undersøgelser, sygdom modellering og potentielt, drug test og terapeutiske formål. Protokollen er dog mest velegnet til at undersøge tidlige aspekter af menneskelig kortikale udvikling. Vi har for eksempel brugt forhjernen-type organoids til at undersøge menneske-specifikke aspekter af vRGC adfærd. Mere specifikt patofysiologiske forandringer forbundet med en svær form af lissencephaly, en menneskelig kortikale misdannelse karakteriseret ved en i nærheden af fravær af kortikale foldning, blev behandlet. Kun visse aspekter af denne sygdom kan modelleres i mus, musen hjernen er naturligvis lissencephalic. Når du anvender ordningen med organoid til lissencephaly patient-afledte iPSCs, kunne vi pålideligt sammenfatte menneske-specifikke aspekter af sygdommen og identificere underliggende mekanismer. Mere specifikt kunne vi vise, at patienten-afledte organoids viser en signifikant reduktion i størrelse skyldes et skift fra symmetrisk til asymmetrisk celledeling af vRGCs. Denne switch var forbundet med ændringer i organisationen af vRGCs' mikrotubulus net, en afbrydelse af arkitekturen i VZ niche og ændret udtryk for celle adhæsionsmolekyler, fører til en nedsat aktivering af N-cadherin/β-catenin signalering akse10. Note: β-catenin-afhængig regulering af vRGC division tilstande blev foreslået for at være menneske-specifikke som overekspression af β-catenin i mus fører til tangential cortex ekspansion og efterfølgende kortikale folde20. Således, vores data fremhæve at ordningen forhjernen-type organoid repræsenterer et lovende redskab til at studere i en målelig måde human-specifikke aspekter af tidlig kortikale udvikling i vitro.
En stor udfordring for fremtiden er at opretholde ensartethed af organoids over længere tidsperioder for at opnå mere modne neuronal fænotyper. Dette kunne realiseres af en eller flere af følgende: dyrkning af organoids i en bioreaktor system14, anvende flydende scaffolds15, supplere differentiering mediet med neurale vækst eller neuronal overlevelse faktorer. Til sidst kan en kontrolleret stigning i hjernen kompleksitet opnås ved fusing forhjernen-type organoids med cerebral organoids af forskellige regionale identitet21,22.
Tilsammen, tilbyder forhjernen-type organoid protokol præsenteres her en let anvendelse og pålidelige værktøj for generation af tidlige kortikale strukturer in vitro. Protokollen giver anledning til meget homogene tidlige kortikale væv på tværs af flere iPSC linjer og kan udnyttes til at pålideligt oprette individuelle-specifikke kortikale væv. Således er systemet specielt velegnet til programmer, der kræver en høj grad af ensartethed og reproducerbarhed som sygdom modellering.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejdet var støttet af Ministeriet for Innovation videnskab og forskning i Nordrhein-Westfalen (Junior Research Group) og ERA-NET NEURON, JTC 2015 nervesystemets, STILK-MCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
| Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
| Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
| Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
| Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
| D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
| DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
| Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
| Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
| Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
| IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
| L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
| Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
| Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
| Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
| Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
| Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
| Antibodies | |||
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
| Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
| Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
| Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
| N-cadherin | BD | 610921 | |
| ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
| P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
| Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
| Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
| Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |
References
- Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size. Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Iefremova, V., et al. An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome. Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. , (2017).
- Yamaguchi, T., et al. Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis. J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).
- Heidebrecht, H. J., et al. p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood. 90 (1), 226-233 (1997).
- Kosodo, Y., et al. Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain. EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Chenn, A., Walsh, C. A. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. , (2017).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
