Summary
Cerebral organoids representerer en ny modellsystem å undersøke tidlig menneskelige hjerne utviklingen i vitro. Denne artikkelen gir detaljert metoder for å effektivt generere homogen rygg forebrain-type organoids fra menneskelige indusert pluripotent stamceller inkludert avgjørende karakterisering og godkjenningen skritt.
Abstract
Menneskelige cortex utvides svært og viser en kompleks struktur med funksjonelle områder, gir høyere hjernefunksjon, som erkjennelse. Innsats for å studere menneskelige hjerne cortex utvikling har vært begrenset av tilgjengeligheten av modellsystemer. Oversette resultatene fra gnager studier til mennesket er begrenset av arter forskjeller og studier av menneskelig primære vev er hemmet av mangelen på vev tilgjengelighet samt visse etiske spørsmål. Siste utviklingen i menneskelig pluripotent stamceller (PSC) teknologi omfatter generering av tredimensjonale (3D) selv-organisering organotypic kultur systemer, som etterligner til en viss grad menneske-spesifikke hjernen utvikling i vitro. Foreløpig er forskjellige protokoller tilgjengelig for generering av hele hjernen eller hjernen-regionen bestemte organoids. Metoden for homogen og reproduserbar forebrain-type organoids fra indusert PSC (iPSC), som vi tidligere etablert og beskrive her, kombinerer iboende evne til PSC selv ordne med guidete differensiering mot den fremre neuroectodermal avstamning og matrix innebygging for å støtte dannelsen av en kontinuerlig neuroepithelium. Mer spesifikt, denne protokollen innebærer: (1) generasjonen av iPSC aggregat, inkludert konvertering av iPSC koloniene til en confluent monolayer kultur; (2) induksjon av fremre neuroectoderm; (3) innebygging av neuroectodermal aggregater i en matrise stillaset; (4) generasjonen av forebrain-type organoids fra neuroectodermal aggregater; og (5) fiksering og validering av forebrain-type organoids. Slik gir denne protokollen en lett anvendelig system for generering av standardiserte og reproduserbar iPSC-avledet kortikale vev strukturer i vitro.
Introduction
Den menneskelige hjernen er klart en av de mest komplekse organene og er ansvarlig for alle menneskelige intellektuelle evner. Dermed er en dypere forståelse av menneske-spesifikke hjernens utvikling en viktig forutsetning for forståelsen av menneskelige kognitive evner. Tradisjonelt transgene dyr var modell organismer å studere hjernens utvikling. Disse modellene gitt grunnleggende innsikt i prinsippene i hjernens utvikling. Vi vet nå at en vanlig funksjon i hjernens utvikling i alle pattedyr er en presis koreografi stamfar spredning, neurogenesis og neuronal migrasjon. Det er imidlertid betydelige strukturelle forskjeller mellom hjernen til modell organismer, som gnagere og mennesker, spesielt i neocortex. De primære mekanismene som har blitt foreslått å bidra til primas kortikale evolusjon er en økt spredning av stammen og stamfar celler og generering av ytre radial glia celler (oRGCs), som er bare svært sjelden funnet i Red1 ,2,3.
Metodene til modell menneskelige hjerne cortex utvikling omfatter generering av PSC-avledet telencephalic stamfar celler og hjernebarken projeksjon neurons som monolayer kulturer. Dette standardiserte differensiering protokoller spille visse aspekter av menneskelig kortikale utvikling som stereotypiske timelige rekkefølgen på kortikale neurogenesis4. De, men faller kort når det gjelder recapitulation av utviklingsprosesser av organogenesen som romlige mønstre og morphogenesis. Nyere utviklingen i stem cell biology førte til etableringen av 3D organoid kulturer fra PSCer, som er revolusjonerer forskning i vitro menneskelige organogenesen. Utnytte kapasiteten til PSCer selv ordne i organotypic strukturer, er ulike organoids, som reflekterer strukturelle og funksjonelle egenskaper organer inkludert de av nyre, gut, øyet og hjernen etablert5. Slike organoids inneholder flere organ-spesifikke mobilnettet subtyper, som grupperer og romlig organisere ligner til utvikling organer i vivo5,6. I tillegg avslørt celle komposisjon, avstamning forhold og genet nettverk studier med encellede RNA sekvensering at menneskelige hjerne organoids trofast recapitulate viktige aspekter av menneskelig føtal neocortex utvikling som gene expression programmer 7 , 8. en stor ulempe, noe som forhindret bred programmet så langt, var imidlertid de store parti til parti variasjoner og organoid-til-organoid heterogenitet9.
Her gir vi en detaljert protokoll for en enkel og standardisert forebrain-type organoid kultur-systemet. Det sentrale trekk ved dette systemet er at den effektivt og reproduserbar genererer PSC-avledet organoids nesten eksklusivt dorsal telencephalic identitet. Protokollen er basert på metoder som brukes i våre siste Celle rapporter papir10. Det kombinerer Self-Organization kapasiteten for iPSCs med selektiv induksjon av kortikale neuroepithelium og robust kan generere homogene kulturer av tidlig dorsal telencephalic vev innen 3 uker. Protokollen bygger på tidligere rapporterte SMAD signalering og Wnt hemming strategi som guider differensiering av PSC mot den fremre neuroectodermal avstamning11,12 i kombinasjon med matrix embedding, som fremmer dannelsen av store og kontinuerlig neuroepithelial strukturer13. Vi har brukt metoden beskrevet på ulike iPSC linjer, med flere kloner per person. Vi viste at dette systemet er egnet for nedstrøms applikasjoner der reproduserbarhet og homogenitet er av stor betydning som sykdom modellering. Når protokollen gjelder iPSCs avledet fra pasienter som lider av en alvorlig kortikale malformation, var vi recapitulate patologisk kjennetegnene av sykdom i vitro og identifisere nye molekylære mekanismer som fører til den fenotypiske endrer10. Vi foreslår at beskrevet organoid protokollen kan benyttes for å lukke gapet mellom reduksjonistiske PSC-avledet kortikale monolayer kulturer og i vivo studier, og at det representerer en pålitelig og stabil cellen-basert modell-system for å simulere tidlig menneskelig kortikale utvikling i helse og sykdom utenfor menneskekroppen.
Protocol
1. generasjon av iPSC aggregater
- Generasjon av encellede monolayer kulturer fra iPSC koloniene
- Forberede en kjeller membran ekstrakt (BME) belagt 6-vel plate. Tine BME på isen ved 4 ° C i 2-3 h, fortynne den med kaldt Dulbecco endret Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 1:50 fortynning), dekke plate med 1 mL/vel av utvannet BME løsningen og lagre platen overnatting på 4 ° C.
- Sug opp mediet og vask intakt iPSC kolonier av minst 2 av en 6-vel plate med 0,5 mM EDTA i fosfat bufret saltvann (PBS) før rugende kolonier med 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i PBS for 4 min ved romtemperatur (RT). Sug opp EDTA løsning og forsiktig ta koloniene ved å vaske dem av bunnen av parabolen med 5 mL av DMEM-F12 medium. Samle dem i en 15-mL tube og pellets dem med sentrifugering (4 min på 1200 x g ved RT).
Merk: iPSCs omprogrammeres fra kommersielt tilgjengelige fibroblaster har vært vellykket brukte10. - Sug opp nedbryting og Inkuber iPSC koloniene med 500 µL av celle-dissosiasjon reagensen i 6 min på 37 ° C.
- Pipetter celle suspensjon flere ganger forsiktig opp og ned med en 1 mL pipette å bryte gjenværende celle klynger i enkeltceller.
- Legge til 4 mL av DMEM-F12 celle suspensjon å fortynne celle-dissosiasjon reagensen.
- Spin cellene ned på 1200 x g for 4 min på RT.
- Resuspend cellene i 2 mL iPSC middels med 5 µM Y-27632 og seed celler i en brønn av en BME belagt 6-vel plate.
Merk: Bruke iPSC medium angitt i Tabellen for materiale for en enkeltcelle monolayer iPSC kulturer. - På den neste dagen, erstatte mediet med fersk iPSC medium mangler Y-27632. Fra dette punktet, kan du fortsette å kultur celler, endre mediet hver dag til iPSCs er 100% confluent. Avhengig av den celle linjen og confluency av Start, vil dette ta mellom 2-4 dager.
- En gang confluent, passasje i iPSCs. Sug opp middels og bruke 500 µL av celle-dissosiasjon reagensen på cellene.
- Inkuber celler for 5-10 min på 37 ° C. Forsiktig rock plate å koble cellene.
- Vask cellene fra brønnen bruker 2 mL DMEM-F12 og samle dem i en 15-mL tube. Legge til DMEM-F12 for et totalvolum på 5 mL.
- Nedspinning cellene på 1200 x g for 4 min på RT og Sug opp nedbryting.
- Frø cellene iPSC middels med 5 µM Y-27632 i et 1:2 til 1:4 ratio på en BME belagt 6-vel plate (2 mL/vel av medium).
- Fortsette å kultur cellene i 2-5 dager og endre iPSC medium mangler Y-27632 hver dag. En gang confluent, passasje iPSCs (trinn 1.1.4-1.1.8).
Merk: Kultur iPSCs for minst 2 passasjer som en monolayer i iPSC medium angitt i Tabellen for materiale før du bruker dem for generering av iPSC aggregater til at cellene å tilpasse kultur forhold.
- Bruk monolayer iPSC kulturer når de 70-90% confluent for generering av iPSC aggregat.
Merk: iPSC tilpasset kultur forhold som enkeltceller er mindre utsatt for stress som fører til celledød under dissosiasjon og aggregering prosedyren. Monolayer iPSC kulturer må vise typiske pluripotent morfologi med bevis for differensiering. Teste kulturer regelmessig for mycoplasma forurensning. Fungerer bare med mycoplasma-fri iPSC kulturer.- Sug opp kultur medium fra en brønn av en 6-vel plate og bruke 500 µL av celle-dissosiasjon reagensen på cellene.
- Inkuber celler for 5-10 min på 37 ° C. Forsiktig rock plate å koble cellene.
- Vask celler fra brønnen bruker 2 mL DMEM-F12 og samle dem i en 15-mL tube. Legge til DMEM-F12 for et totalt volum på 10 mL.
- For cellen opptelling, ta 25 µL fra cellen suspensjon og bland det med 25 µL av trypan blå merke døde celler. Telle levende celler ved hjelp av en telling kammer.
- Samle nok celler (4500 celler per iPSC samlet) fra cellen suspensjon i en 15 mL tube.
- Nedspinning cellene på 1200 x g for 4 min på RT og Sug opp nedbryting.
- Resuspend cellene i en passende mengde iPSC medium med 50 µM Y-27632 å få 4500 levende celler per 150 µL.
Merk: Bruke en høy konsentrasjon av Y-27632 (50 µM) er avgjørende for overlevelsen av iPSCs. - Plate 150 µL i hver brønn av en lav-vedlegg 96-brønns U-bunn plate og plasser den i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Når du genererer iPSC aggregater, vurdere at minst 6 organoids er nødvendig for kvalitetskontroll på dag 20 (se seksjon 5).
2. induksjon av fremre Neuroectoderm
- Nøye overvåke morfologi endringer av iPSC aggregater hver dag under vev kultur mikroskopet ved hjelp av 4 X eller 10 X makt linsen. Observere på dag 1, celle aggregat med klare grenser. Fortsette å kultur iPSC aggregater i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Et visst antall døde celler/vel er normalt og påvirker ikke organoid generasjon. - Mate iPSC aggregater fra dag 2 og fortsetter med hver andre dag av forsiktig aspirating ca 2/3 av mediet uten å forstyrre de cellen aggregatene nederst. Legge til en ekstra 100 µL av iPSC medium mangler Y-27632.
Merk: Innen 4-6 dager celle aggregater er 350-450 µm i diameter og utstillingen kantutjevning. - På dette stadiet samler bassenget cellen med kutt 100 µL pipette tips til en lav-vedlegg 6 cm rett (maksimalt 20 aggregater/parabol) i kortikale induksjon medium med DMEM-F12 N2 supplement (1:200), B27 supplement (1: 100), glukose (0,2 mg/mL), syklisk adenosin monofosfat (cAMP, 0,15 µg/mL), 0,5% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1% L-alanyl-L-glutamin, heparin (10 µg/mL) og forbindelsene LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM), og hemmer Wnt Svar-1 (IWR-1) (10 µg/mL). Mate aggregater celle ved å endre kortikale induksjon mediet 3 dager etter overføre dem til 6 cm parabolen.
- Nøye overvåke morfologiske endringer under kortikale induksjon under vev kultur mikroskop med en 4 X makt linsen.
Merk: Etter 4-5 dager i kortikale induksjon medium, bør kantene av cellen aggregater begynne å lyse på overflaten, som angir neuroectodermal differensiering. På dette stadiet kommer radial organiseringen av en pseudostratified epitel. Videre til del 3 bygge inn celle aggregat i en BME-matrise.
3. innebygging av Neuroectodermal samler i en Matrix-stillaset
- Tine BME på isen ved 4 ° C i 2-3 h. Aliquot ufortynnet BME i tilstrekkelige mengder.
- Forberede en plast parafin filmen ark innebygging prosedyren. Cut plast parafin filmen bruker sterilt saks i 4 cm x 4 cm store stykker, satt et stykke plast parafinen film over en tom 100 µL tips skuffen for 100 µL tips, og trykk med fingeren hansker slik at små gropene i plast parafin filmen arket opprettes (1 di mple/cell samlet nødvendig). Rengjøre plast parafin filmen med 70% etanol og irradiate det med UV lys (strøm: 15 watt, bølgelengde: 435 nm) under lukkede sterilt benken for 30 min.
- Overføre hver celle samlet til ett smilehull av plast parafin filmen arket med et 100 µL kuttet tips med 1,5-2 mm åpning i diameter. I tilfelle at to celle aggregater er smeltet, atskilt ikke, men overføre dem sammen til én smilehull.
- Forsiktig Sug opp mediet rundt celle aggregater bruker en uklippet 100 µL pipette tips.
Merk: Vær forsiktig med å suge de celle aggregatene i spissen, da dette vil skade aggregatene. - Legge til 40 µL av ufortynnet BME hver celle samlet.
- Plasser hver celle samlet i BME slipp ved hjelp av en uklippet 100 µL pipette tips.
Merk: Vær svært forsiktig for ikke å skade den utvikle neuroepithelium med Pipetter spissen. - Nøye overføre plast parafin filmen arket bruker sterilt tang i en 10 cm Petriskål (eller en annen tilstrekkelig celle kultur parabol) og plasser rett i inkubator i 15-20 min til å tillate BME å stivne.
- I mellomtiden Forbered en lav-vedlegg 6 cm rett som inneholder 5 mL av kortikale induksjon medium.
- Etter polymerisasjon av BME, fjerne dråpestørrelse inneholder cellen aggregater fra plast parafin filmen ark. Snu plast parafin filmen bruker sterilt tang og forsiktig presse celle aggregater i den litt skråstilt (ca 30 °) lav-vedlegg 6 cm rett før dråpene faller av plast parafin filmen arket. Overføre maksimalt 16 celle aggregat i en 6 cm rett.
- Fortsette å ruge celle tilslag på 37 ° C.
4. generasjon Forebrain-type Organoids fra Neuroectodermal samler
- En dag etter innebygging i en BME matrise, plassere organoid kultur retter på en rocking celle kultur shaker med en tilting vinkel på 5 ° og 14 rpm, installert i en celle kultur inkubator.
- Overvåke organoids hver dag. Homogen neuroepithelial loop-lignende strukturer utvikle gradvis etter innebygging i BME matrise.
- Når neuroepithelial loop strukturer er synlig, kan du endre mediet til organoid differensiering middels som inneholder DMEM-F12 N2 supplement (1:200), B27 supplement (1: 100), glukose (0,2 mg/mL), leiren (0,15 µg/mL), 0,5% NEAA, 1% L-alanyl-L-glutamin, insulin (2,5 µg/mL)
- Erstatte organoid differensiering medium hver 3-4 dager før tidspunktet ønsket differensiering er nådd. Deretter ordne organoids (se avsnitt 5).
Merk: Noen ganger kan vevet utvise knopper av optisk gjennomskinnelig vev uten loop strukturer. Selv om dette ikke er ideelt, er dette ikke påvirker utviklingen av kortikale strukturer. Organoids kan kultivert i organoid differensiering medium for opptil 40 dager. For utvidet kultur perioder (40-100 dager) organoid differensiering mediet kan suppleres med 1:50 BME å øke vev kompleksiteten BDNF og GDNF å tillate neuronal overlevelse og modning14,15.
5. fiksering og validering av Forebrain-type Organoids
- Innhente 6 organoids i dag 20 for godkjenningen. Bruk 3 organoids for mRNA isolasjon og PCR analyser. Overføre de ytterligere 3 organoids til en 24-vel plate inneholder PBS med et kutt 1 mL pipette tips med en åpning på 3-3,5 mm for fiksering og sekvensiell immunocytochemical analyser.
- Vask organoids to ganger av nøye aspirating PBS og erstatte den med ferske PBS bruker en 5-mL pipette. Fastsette organoids i 15 min i kalde 4% paraformaldehyde (PFA) (pH 7.4).
Forsiktig: Pass på at PFA er et kjent menneskelig karsinogen. Alt arbeid må gjøres i kjemisk avtrekksvifte iført nitrilhansker. Det anbefales å bruke vernebriller. Formaldehyd kan forårsake irreversibel skade på hornhinnen. - Sug opp PFA nøye og vask tre ganger med romtemperatur PBS for 10 min.
- Erstatte PBS med en 30% sukrose løsning (wt/vol, PBS-basert) og lagre prøvene på 4 ° C å tillate organoids å tørke. Organoids kan lagres i opptil 7 dager før videre behandling.
- En dag etter fiksering, beis pre dehydrert organoids ved å legge trypan blå på ca 1:50 på 10 min å tillate effekten av organoids under prosedyren og kryosnitt.
- Forberede innebygging mediet som inneholder 10% sukrose, 7,5% gelatin wt/vol i PBS, og varme den 75 ° c før det er flytende.
- Erstatte 30% sucrose løsning med innstøpingsmiddel og overføre 24-vel platen på en oppvarming plate (60 ° C) i 15 min til equilibrate på organoids.
- Dekke bunnen av innebygging formene med et lag av innebygging media og plassere dem på is til danner.
- Overføring av organoids fra 24-vel platen til innebygging former som inneholder den polymerized innebygging mediet, legge til ekstra innstøpingsmiddel på toppen slik at organoids er dekket, og sett mugg raskt i en 100% etanol/tørr is fryser bad ( temperaturen bør være mellom 30 til-50 ° C) for minst 1 min til sjokk-fryse.
- Sett mugg med tang på tørris midlertidig og enten lager dem ved-80 ° C eller direkte fortsette med og kryosnitt.
- Cryosection organoids på 20 µm tykkelse og hente delene på objektglass, holde spor av delene på lysbildene (sekvensiell opptak). Tillat å tørke på lysbilder i flere timer, før du lagrer dem på-80 ° C eller direkte utføre immunocytochemical flekker.
Representative Results
Standardisert forebrain-type organoid protokollen beskrevet her vanligvis genererer svært homogen organoid kulturer nesten utelukkende dorsal kortikale identitet fra menneskelige iPSCs innen 20 dager dyrking (protokoll beskrevet i figur 1 A). det anbefales å utføre flere trinn for kvalitetskontroll i gang løpet av protokollen, definert som: "gå" (fortsette differensiering prosessen) og "no-go" (suboptimal kulturer, det anbefales å avslutte satsvis) (figur 1 ). Det er også lurt å dokumentere steg kvalitetskontroll godt av å ta bilder og notater.
Det første kritiske trinnet genererer forebrain-type organoids er å starte med høy kvalitet iPSC kulturer. Det er viktig at iPSCs ikke inneholder større deler av differensierte celler. Bare bruk iPSC kulturer som presenterer som en homogen monolayer av udifferensierte celler på Start befolkningen (tall 1B, C). I tillegg er det viktig å starte med gitt celle nummer for iPSC aggregering. Første detaljert inspeksjon av iPSC aggregater skal utføres på dag 2. På dette stadiet, bør aggregatene har dannet kompakt celle knopper med jevne kanter ('gå') mens uregelmessig vises aggregat, eller aggregat med hulrom bør være kasserte ("no-go") (tall 1 d, E). Neste kvalitetskontroll trinn skal utføres på dag 10 i protokollen. På dette tidspunkt, celle aggregater skal vise glatt og optisk gjennomskinnelig vev på den ytre overflaten representerer induksjon av neuroectoderm ('gå') mens fravær av slike vev angir suboptimal neural induksjon ("no-go") (tall 1F, G ). Bare de aggregatene som viser en gjennomsiktig overflate (figur 1F) bør bygges inn BME matrise. Når innebygd, vil kortikale organoids utvikle kontinuerlig neuroepithelial loop-lignende strukturer, som vil utvide raskt. Analysere effektiviteten av kortikale induksjon dag 15 og dag 20 ved å undersøke om organoids har utviklet polarisert nevrale ektoderm som vist i figur 1H, J ("go"). Endre utført kvalitetskontroll fremgangsmåten for feilsøking i tilfelle at organoids ikke har utviklet slike neuroepithelial knopper ("no-go" som vist i figur 1jeg, K), kritisk. Når tett følge protokollen, svært standardiserte organoid grupper vil bli generert (tall 2A, B), som vil vise ≥ 90% homogenitet i polarisert nevrale ektoderm formasjon innen og over bunker (figur 2C). En vanlig feil fører til variabel effektiviteten av polarisert nevrale ektoderm formasjon er å øke celle startnummeret for iPSC aggregering, eller med lav kvalitet iPSC kulturer som mycoplasma forurenset kulturer eller kulturer som inneholder atskilte celler.
En detaljert validering av dorsal telencephalic identiteten til den genererte organoids skal utføres på dag 20. Derfor, bør 3 organoids være fast og brukes ved immunofluorescence analyser. Lagdelt neuroepithelial looper (Figur 3A) express nevrale stamceller markøren Sox2 (Figur 3B, D), forebrain markørene Pax6 og Otx2 (tall 3 c, E), og dorsal kortikale markøren Emx1 (Figur 3 F). disse kortikale løkkene er mer preget av en apikale lokalisering av N-cadherin og ZO-1 (tall 3 g, H), ventrikkel sonen radial glia celle (vRGC)-avledet microtubule, som strekker seg fra apikale på basale siden av strukturer ( Figur 3 jeg), og apikale ligger dele celler som flekken positivt for fosforylert vimentin (p-Vimentin, Figur 3J). Celledød kanskje finnes inne organoid strukturer. Sentrale apoptose er normalt og påvirker ikke utviklingen av kortikale vev. I tillegg skal 3 organoids brukes til å vurdere homogenitet av protokollen av gene expression analyser. Forebrain-type organoids Vis uttrykk for dorsal forebrain markører (FoxG1, Otx2, Emx1) mens uttrykk for mellomhjernen (FoxA2, Pax5) og hindbrain (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) markørene er ikke synlig (Figur 3K).
Grupper av kvalitetssikrede organoids kan brukes for ulike programmer som analysene av divisjon flyet av apikale radial gliacellene. Derfor, foreslår vi utfører dobbel flekker bruker antistoffer mot p-Vimentin og Tpx2 (Figur 3J). P-Vimentin er fosforylert av CDK1 under mitose og ligger i kjernen, dermed merking alle atomkjerner i mitotisk fase16. Tpx2 er et microtubule forbundet protein som kan visualisere mitotisk spindelen og apikale prosesser under interkinetic kjernefysiske migrasjon17,18. Bruker disse markørene, tre aspekter av vRGC divisjon kan i prinsippet analyseres: (I) om cellen divisjon foregår på apikale side, (II) om divisjon flyet er justert loddrett (som angir symmetrisk celledeling), horisontale og skrå ( Angir asymmetrisk celledeling) til apikale overflaten og (III) om microtubule organisering sentre er dannet normalt.
Organoids kan også differensieres i mer komplekse organisert og lagdelt kortikale vev strukturer. Kortikale strukturer i dag 35 ± 2 organoids består av en ventrikkel sone (VZ) - en indre og ytre subventricular sone (SVZ), samt en kortikale plate (CP) - som område. Innenfor VZ og den indre og ytre SVZ, kan vRGCs, middels progenitors (IPs) og celler som minner om oRGCs identifiseres. I tillegg første dannelsen av et lagdelt cortex kan observeres i CP-lignende området med dypt kortikale neurons uttrykke Tbr1 og Ctip2 inne og øvre kortikale nevroner uttrykke Satb2, samt Reelin-uttrykke celler i den ytre regioner10.
Figur 1 : Skjematisk oversikt over organoid protokollen og illustrasjon av 'gå' og "no-go" kriterier. (A) skjematisk oversikt over protokollen. CI medium: kortikale induksjon medium; CD: kortikale differensiering medium. (B-C) Bilde av en optimal 90% confluent iPSC monolayer kultur (B) og en ikke-passer iPSC kultur viser differensiering (C). (D--E) En iPSC samlet optimal størrelse, celle tetthet, og overflateutseendet (D) og to "no-go" celle aggregater viser enten celle reservedeler hulrom (E, øvre samlet) eller uregelmessig kanter (E, lavere samlet) to dager følgende celle aggregering. (F-G) Cellen aggregater viser gjennomsiktig og glatt kantene (F) og celle aggregater mangler optisk fjerne (G). Den gule linjen er visualisere området av interesse. (H-K) En optimal organoid med kontinuerlig neuroepithelial looper (H, J) og en organoid som kunne utvikle radielt organisert neuroectoderm (jeg, K) avbildet på 15 og dagen 20, henholdsvis. Skala barer, ABC 500 µm; D-K 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Homogenitet og reproduserbarhet forebrain-type organoid protokollen. (En-B) Representant lyse-feltet bilder av organoids fra ett parti på dag 15 (A) og dag 26 (B). (C) kvantitative analyser av organoids på dag 20. Organoids som vises på den ytre overflaten en neuroepithelium, gjenkjennelig i lyse-feltet som optisk klart overfladisk vev med en klar ramme og bevis på radial mobilnettet arkitektur kvantifisert (n = 3 per iPSC linje med minst 16 organoids per eksperiment). Skala barer, A-B: 500 µm. feil barer ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Validering av forebrain-type organoids på dag 20. (En-J) Immunocytochemical karakterisering av organoids. Organoids organisere i flere neuroepithelial ledd (A, counterstained med DAPI). Lagdelte organisert celler innenfor neuroepithelial looper express nevrale stamceller markøren Sox2 (B, D), forebrain markører Pax6 (C, D) og Otx2 (E), og dorsal forebrain markøren Emx1 (F). Kortikale loop strukturer utstilt en fin tilhenger krysset belte på de apikale side med opphopning av N-cadherin (G) og zona occludens protein 1 (ZO-1; H). ventrikulær RGCs' microtubule nettverk (farget av acetylated α-tubulin, Ac-badekar) strekker seg fra apikale på basale siden av loop strukturer (jeg). Voksende celler uttrykke p-vimentin (p-Vim) er plassert på apikale overflaten. Mitotisk spindler er farget av Tpx2. representativt høyere forstørrelse bilde av en loddrett og en vannrett divisjon flyet vises til høyre (J). (K) RT PCR analyse for regionspesifikke transkripsjonsfaktorer på dag 20 uavhengige sett med organoids avledet fra 2 ulike iPSC linjer. FB: fosterets hjerne kontroll; AB: voksen hjernen kontroll. Skala barer, AD 200 µm; E-I 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Epitope | Fortynning |
| Sox2 | 1 - 300 |
| Pax6 | 1 - 500 |
| Otx2 | 1 - 500 |
| Emx1 | 1 - 50 |
| N-cadherin | 1 - 500 |
| ZO-1 | 1 - 100 |
| P-Vimentin | 1 - 1000 |
| Tpx2 | 1 - 500 |
| Acetylated α-tubulin | 1 - 500 |
| Alexa488 anti ms | 1 - 1000 |
| Alexa488 anti rb | 1 - 1000 |
| Alexa555 anti ms | 1 - 1000 |
| Alexa555 anti rb | 1 - 1000 |
Tabell 1: Antistoffer for kvalitetskontroll av organoids på dag 20.
| Primer | Sekvens |
| Otx2 fremover | tgcaggggttcttctgtgat |
| Otx2 omvendt | agggtcagagcaattgacca |
| FoxG1 fremover | ccctcccatttctgtacgttt |
| FoxG1 omvendt | ctggcggctcttagagat |
| Emx1 fremover | agacgcaggtgaaggtgtgg |
| Emx1 omvendt | caggcaggcaggctctcc |
| FoxA2 fremover | ccaccaccaaccccacaaaatg |
| FoxA2 omvendt | tgcaacaccgtctccccaaagt |
| Pax5 fremover | aggatgccgctgatggagtac |
| Pax5 omvendt | tggaggagtgaatcagcttgg |
| HoxB2 fremover | tttagccgttcgcttagagg |
| HoxB2 omvendt | cggatagctggagacaggag |
| HoxA4 fremover | ttcagcaaaatgccctctct |
| HoxA4 omvendt | taggccagctccacagttct |
| HoxB4 fremover | acacccgctaacaaatgagg |
| HoxB4 omvendt | gcacgaaagatgagggagag |
| HoxB6 fremover | gaactgaggagcggactcac |
| HoxB6 omvendt | ctgggatcagggagtcttca |
| 18s frem | ttccttggaccggcgcaag |
| 18s omvendt | gccgcatcgccggtcgg |
Tabell 2: Primer og primer sekvenser for profilen for gene expression.
Discussion
Hjernen organoids representerer et kraftig verktøy for å studere menneskelige hjerne utviklingen i vitro som de gir aktuelle arten bakgrunnen og komplekse 3D arrangementet i celler i en vev sammenheng. Med det bygge de bro mellom ikke-menneskelige dyr modeller og reduksjonistiske menneskelige todimensjonal monolayer celle kultur teknikker. Programmene er imidlertid hemmet av mangel på reproduserbarhet9. Vi har utviklet en forebrain-type organoid-protokollen, som overvinner stor prøve å sample variasjon ved å kombinere den selv-organisering kapasiteten til iPSC med sine amenability til mønster faktorer. Spesielt iPSCs var samlet for å fremme selvstendig organisasjon og senere hemme TGF-ß/SMAD signalering å fremme dorsal cortex differensiering ved å utsette kulturer til BMP (LDN-193189) og en TGF-β type I-reseptor hemmere (A83-01). I tillegg, ble et stoff som hemmer Wnt veien (IWR) for å forhindre posteriorization brukt. I motsetning til "intrinsic" hjerne organoid protokoller19, som baseres på selvstendig montering uten ekstern kontroll gir opphav til heller heterogen hjernen organoids og viser stor variasjoner (målt ved effektiviteten av polarisert nevrale ektoderm formasjon15), protokollen beskrevet her reproduserbar genererer homogen forebrain-spesifikke organoids fra menneskelige iPSCs.
Disse forebrain-type organoids kan brukes til en rekke programmer som neurodevelopmental studier, evolusjonære studier inkludert gen funksjon studier, sykdom modellering og mulig narkotika testing og terapeutiske formål. Protokollen er best egnet til å undersøke tidlig aspekter av menneskelig kortikale utvikling. Vi har for eksempel brukt forebrain-type organoids undersøke menneske-spesifikke deler av vRGC atferd. Mer spesifikt, patofysiologiske filendringer tilknyttet en alvorlig form for lissencephaly, en menneskelig kortikale misdannelse preget av en nærheten fravær av kortikale folding, ble behandlet. Bare visse aspekter av denne sykdommen kan modelleres i mus som musen hjernen er naturlig lissencephalic. Når du bruker organoid systemet på lissencephaly pasient-avledede iPSCs, kunne vi pålitelig recapitulate menneske-spesifikke aspekter av sykdommen og identifisere underliggende mekanismene. Mer spesifikt, kunne vi vise at pasient-avledede organoids viser en betydelig reduksjon i størrelse forårsaket av brytere fra symmetrisk asymmetrisk celledeling av vRGCs. Denne bryteren ble knyttet til endringer i organiseringen av vRGCs' microtubule nettverk, en forstyrrelse av arkitektur VZ nisje og endret uttrykk for celle vedheft molekyler, fører til svekket aktivering av N-cadherin/β-catenin signalering aksen10. Merke: β-catenin-avhengige regulering av vRGC divisjon moduser ble foreslått for å være menneske-spesifikke som overuttrykte β-catenin i mus fører til tangentiell cortex ekspansjon og senere kortikale folding20. Dermed markere våre data at forebrain-type organoid systemet representerer et lovende verktøy for å studere på en målbar måte human-spesifikke aspekter av tidlig kortikale utvikling i vitro.
En stor utfordring for fremtiden er å opprettholde homogenitet av organoids over lengre tidsperioder for å oppnå mer moden neuronal fenotyper. Dette kan realiseres av ett eller flere av følgende: dyrking organoids i en bioreactor systemet14, bruke flytende stillaser15, supplere differensiering mediet med nevrale vekst eller neuronal overlevelse faktorer. Endelig kan en kontrollert økning i hjernen kompleksitet oppnås ved fusing forebrain-type organoids med cerebral organoids ulike regionale identitet21,22.
Samlet tilbyr forebrain-type organoid protokollen presenteres her en lett anvendelig og pålitelig verktøy for generering av tidlig kortikale strukturer i vitro. Den protokoll gir stige til svært homogen tidlig kortikale vev over flere iPSC linjer og kan brukes til å generere pålitelig person-spesifikke kortikale vev. Dermed er systemet spesielt egnet for programmer som krever en høy grad av homogenitet og reproduserbarhet som sykdom modellering.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av departementet for innovasjon vitenskap og forskning av Nordrhein-Westfalen (Junior Research Group) og av ERA-NET NEVRON, JTC 2015 Neurodevelopmental lidelser, STEM-MCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
| Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
| Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
| Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
| Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
| D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
| DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
| Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
| Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
| Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
| IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
| L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
| Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
| Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
| Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
| Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
| Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
| Antibodies | |||
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
| Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
| Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
| Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
| N-cadherin | BD | 610921 | |
| ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
| P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
| Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
| Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
| Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |
References
- Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size. Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Iefremova, V., et al. An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome. Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. , (2017).
- Yamaguchi, T., et al. Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis. J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).
- Heidebrecht, H. J., et al. p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood. 90 (1), 226-233 (1997).
- Kosodo, Y., et al. Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain. EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Chenn, A., Walsh, C. A. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. , (2017).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
