Summary
Церебральный organoids представляют собой новую модель системы расследовать раннего человеческого мозга развития в пробирке. Эта статья содержит подробные методологии эффективно генерировать однородные спинной переднего мозга тип organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, включая критические шаги характеристик и проверки.
Abstract
Человеческого мозга сильно расширяется и экспонаты сложную структуру с конкретных функциональных областях, обеспечивая выше функции мозга, таких как познания. Усилия по изучению развития человеческого головного мозга были ограничены наличием типовых систем. Перевод результатов от грызунов исследований человеческой системы ограничивается Межвидовые различия и исследования на основной ткани человека сдерживается отсутствием наличие тканей, а также этические проблемы. Последние развития в человеческих плюрипотентных стволовых клеток (PSC) технологии включают поколения систем трехмерного (3D) самоорганизации organotypic культуры, которые имитируют в определенной степени мозг человека конкретного развития в пробирке. В настоящее время доступны различные протоколы для поколения весь мозг или конкретной области мозга organoids. Метод для создания однородной и воспроизводимые переднего мозга тип organoids с индуцированной PSC (iPSC), который мы создали ранее и описать здесь, сочетает в себе внутреннюю способность PSC самостоятельно организовать с гидом дифференциация к нейроэктодермальная передней линии и матрицы, встраивание в поддержку формирования непрерывного нейроэпителия. Говоря более конкретно, этот протокол включает в себя: (1) поколения iPSC агрегаты, включая преобразование iPSC колоний вырожденная монослойном культивировании; (2) индукции передней neuroectoderm; (3 встраивание нейроэктодермальная агрегатов в леске матриц; (4 поколение переднего мозга тип organoids от нейроэктодермальная агрегатов; и (5) фиксации и проверки переднего мозга тип organoids. Таким образом этот протокол обеспечивает систему легко применимые для создания стандартизированных и воспроизводимый корковых ткани, iPSC производные структур в пробирке.
Introduction
Мозг человека безусловно является одним из самых сложных органов и отвечает за все интеллектуальные способности человека. Таким образом более глубокое понимание развития мозга человека конкретных является важнейшим условием для понимания когнитивных способностей человека. Традиционно трансгенных животных служил модельных организмов для изучения развития мозга. Эти модели представил основные понимание принципов развития мозга. Теперь мы знаем, что общей чертой развития мозга у всех млекопитающих является точным хореография прародитель распространения, нейрогенез и миграции нейронов. Есть, однако, значительные структурные различия между мозгом модельных организмов, таких как грызуны и людей, особенно в коры головного мозга. Основные механизмы, которые было предложено внести свой вклад корковых эволюции приматов являются увеличение числа стволовых и прогениторных клеток, а также поколения внешний радиальной глии клеток (oRGCs), которые лишь очень редко встречаются в грызуны1 ,2,3.
Методы разработки модели человеческого головного мозга включают поколения PSC-производные telencephalic прогениторных клеток и проекции нейронов коры головного мозга как монослоя культур. Эти стандартизированные дифференциация протоколы воспроизвести определенные аспекты развития человека корковых таких стереотипных временной порядок корковых нейрогенез4. Они, однако, отвечают, когда дело доходит до реприза развития процессы органогенеза пространственного структурирования и морфогенеза. Более недавние события в биологии стволовых клеток привели к созданию 3D органоид культур от УИК, которые революционизируют исследования в vitro человека органогенеза. Использование Чок способность самостоятельно организовать в organotypic структуры, различные organoids, которые отражают ключевые структурные и функциональные свойства органов, в том числе почки, кишечник, глаза и мозга были установленным5. Такие organoids содержат несколько органоспецифическая сотовой подтипы, которые позволяют группировать и пространственно организовать очень похож на развивающихся органов в vivo5,6. Кроме того клеточный состав, линии связи и гена сети исследований с использованием одного клеточной РНК последовательности показали, что человеческого мозга organoids добросовестно резюмировать основные аспекты развития человеческого плода Неокортекс таких программ выражение гена 7 , 8. один главный недостаток, который препятствует их широкое применение до настоящего времени, был, однако, большие партии партии вариации и неоднородность органоид органоид9.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для простых и стандартизированных переднего мозга тип органоид культуры системы. Ключевой особенностью этой системы является, что он эффективно и герметизации генерирует PSC-производные organoids почти эксклюзивные спинной telencephalic личности. Протокол основан на методах, используемых в нашей недавней Ячейки Reports бумага10. Он сочетает в себе потенциала самоорганизации iPSCs с выборочной индукции корковых нейроэпителия и энергично может генерировать однородных культур раннего спинной telencephalic ткани в течение 3 недель. Протокол основан на сообщалось ранее SMAD сигнализации и Wnt ингибирование стратегии, которая направляет дифференциацию PSC к передней нейроэктодермальная линии11,12 в сочетании с матрицей, встраивание, который способствует формированию структур крупных и непрерывной нейроэпителиальных13. Мы успешно использовали метод описан на различных линиях iPSC, с несколько клонов на единицу. Мы показали, что эта система подходит для нисходящие приложения, в которых являются большое значение таких заболеваний моделирования воспроизводимость и однородности. При применении протокола к iPSCs производным от пациентов, страдающих от тяжелых корковых мальформация, мы были в состоянии для пилки патологических признаков болезни в пробирке и выявления новых молекулярных механизмов, ведущих к фенотипические изменения10. Мы предлагаем что описанных органоид протокол могут быть использованы для сокращения разрыва между редукционистской PSC-производные корковых монослоя культур и в vivo исследований, и что он представляет собой систему надежной и стабильной модель на основе клеток для имитации рано корковых развитие человека в здоровье и болезни за пределами человеческого тела.
Protocol
1. поколение iPSC агрегатов
- Поколение одноклеточных монослоя культур от колоний iPSC
- Подготовьте тарелку 6-ну экстракт (BME) покрытием базальной мембраны. Оттепель BME на льду на 4 ° C на 2-3 ч, разбавляют холодной Дульбекко орла изменения среднего F12 (DMEM-F12; 1:50 разрежения), крышка с 1 мл/хорошо разбавленный раствор БМЭ и хранить пластину на ночь при 4 ° C.
- Аспирационная среднего и мыть нетронутыми iPSC колоний по крайней мере 2 скважин 6-ну плиты с 0,5 мм ЭДТА в-фосфатный буфер (PBS) дважды, прежде чем инкубации колоний с 0,5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS на 4 мин при комнатной температуре (RT). Аспирационная раствора ЭДТА и аккуратно отсоединить колоний, стиркой в нижней части блюдо с 5 мл среде DMEM-F12. Собрать их в 15 мл и pellet они с центрифугированием (4 мин на 1200 x g на RT).
Примечание: iPSCs, перепрограммировать из коммерчески доступных фибробластов был успешно используется10. - Аспирационная супернатант и инкубировать iPSC колоний с 500 мкл Реагента диссоциации клеток для 6 минут при 37 ° C.
- Накапайте несколько раз осторожно вверх и вниз с 1 мл пипетки сломать остальные кластеры клеток в одиночных клетках суспензию клеток.
- Добавьте 4 мл DMEM-F12 суспензию клеток разбавлять клетки диссоциации реагента.
- Спиновые клетки вниз на 1200 x g 4 мин на RT.
- Ресуспензируйте клетки в 2 мл среды iPSC дополнена 5 мкм Y-27632 и семян ячеек в одну скважину пластины 6-ну BME покрытием.
Примечание: Используйте средство iPSC, указанные в Таблице материалы для одной ячейки монослоя iPSC культур. - На следующий день замените средство свежий iPSC среднего не хватает Y-27632. С этого момента по-прежнему культуры клетки, изменив носитель каждый день до тех пор, пока iPSCs являются 100% притока. В зависимости от линии клетки и confluency начала скважин это займет от 2-4 дней.
- После того, как вырожденная, проход iPSCs. Аспирационная среднего и применить 500 мкл Реагента клеток диссоциация на клетки.
- Инкубировать клетки для 5-10 мин при температуре 37 ° C. Осторожно покачайте пластину для отсоединения клетки.
- Вымыть клетки из скважины с использованием 2 мл DMEM-F12 и собирать их в 15 мл. Добавьте DMEM-F12 для общего объема 5 мл.
- Спин вниз клетки на 1200 x g 4 мин на RT и удалить супернатант.
- Заполнение ячеек в iPSC среднего дополнена 5 мкм Y-27632 1:2 до 1:4 соотношение на BME покрытием 6-ну пластины (2 мл/хорошо среды).
- Продолжайте культуры клетки для 2-5 дней и изменить iPSC среднего хватает Y-27632 каждый день. Однажды вырожденная, iPSCs проход (шаги 1.1.4-1.1.8).
Примечание: Культура iPSCs для по крайней мере 2 проходы как монослоя в iPSC среде, указанной в Таблице материалов перед их использованием для поколения iPSC агрегаты позволяют адаптироваться к условиям культуры клетки.
- Используйте монослоя iPSC культур, когда они 70-90% притока для поколения iPSC агрегатов.
Примечание: iPSC, адаптированных к условиям культуры, как отдельные клетки, менее подвержены подчеркнуть, что приводит к гибели клеток в процессе диссоциации и агрегации. Однослойная iPSC культур должны отображать типичных плюрипотентных морфология никаких доказательств дифференциации. Тестирование культур на регулярной основе для загрязнение микоплазмы. Работать только с микоплазмы бесплатно iPSC культур.- Аспирационная питательной среды из одной скважины 6-ну плиты и применить 500 мкл Реагента клеток диссоциация на клетки.
- Инкубировать клетки для 5-10 мин при температуре 37 ° C. Осторожно покачайте пластину для отсоединения клетки.
- Вымыть клетки из скважины с использованием 2 мл DMEM-F12 и собирать их в 15 мл. Добавьте DMEM-F12 для общим объемом 10 мл.
- Для подсчета клеток, взять 25 мкл из суспензии клеток и смешать его с 25 мкл Трипановый синий знак мертвые клетки. Количество живых клеток с помощью Счетной палаты.
- Соберите достаточно клетки (4500 в iPSC совокупных) от суспензии клеток в 15 мл.
- Спин вниз клетки на 1200 x g 4 мин на RT и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в соответствующий объем iPSC среды дополняется 50 мкм Y-27632 для получения 4500 живых клеток на 150 мкл.
Примечание: Используя высокую концентрацию Y-27632 (50 мкм) имеет решающее значение для выживания iPSCs. - Пластина 150 мкл в каждом и низкий насадку 96-Ну U-нижней пластины и поместите его в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
Примечание: При генерации iPSC агрегатов, считают, что по крайней мере 6 organoids необходимы для контроля качества на день 20 (см. раздел 5).
2. индукция передней Neuroectoderm
- Внимательно следить за изменениями Морфология агрегатов iPSC каждый день под микроскопом культуры тканей, с использованием 4 X или 10 X мощность объектив. Соблюдайте в день 1, агрегаты клеток с четкой границы. Продолжать культуры iPSC агрегатов в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
Примечание: Определенное количество мертвых клеток/хорошо это нормально и не влияет на органоид поколения. - Кормите iPSC агрегатов, начиная с 2 день и продолжает с каждым днем, нежно аспирационных около 2/3 среды не нарушая агрегаты клеток в нижней части. Добавьте дополнительные 100 мкл iPSC среды не хватает Y-27632.
Примечание: В течение 4-6 дней агрегаты клеток будет 350-450 мкм в диаметре и выставку ровные края. - На данном этапе бассейн ячейка объединяет с кончиком пипетки отрезок 100 мкл в низкий насадку 6 см блюдо (максимум 20 агрегатов/блюдо) в среде корковых индукции, содержащие DMEM-F12 с N2 дополнение (1: 200), B27 дополнение (1: 100), глюкозы (0,2 мг/мл), циклический аденозин монофосфат (лагерь; 0,15 мкг/мл), 0,5% несущественные аминокислот (NEAA), 1% L-аланил L-глютамина, гепарин (10 мкг/мл) и соединений LDN-193189 (180 Нм), A83-01 (500 Нм) и АБС битор Wnt ответ-1 (ИУВР-1) (10 мкг/мл). Кормить агрегатов ячейки путем изменения среднего корковых индукции 3 дней после передачи их на блюдо 6-см.
- Внимательно следить за морфологических изменений во время корковых индукции под микроскопом культуры ткани, используя объектив мощность 4 X.
Примечание: После 4-5 дней в среде корковых индукции края ячейки агрегатов должны начать украсить на поверхности, указывающее нейроэктодермальная дифференциации. На данном этапе возникает радиальные Организации псевдомногослойный эпителия. Перейдите к разделу 3 для встраивания агрегатов ячейку в матрице BME.
3. Внедрение нейроэктодермальная агрегатов в леске матриц
- Оттепель BME на льду на 4 ° C на 2-3 ч. аликвота неразбавленном BME в достаточных количествах.
- Подготовьте лист пленки пластиковые парафин для внедрения процедуры. Вырезать стерильными ножницами в 4 x 4 см большой фильм пластиковые парафин кусочки, кладут кусок пластика парафин фильм за кончик лоток пустой 100 µL 100 мкл советы и пресс с пальца в перчатке, так, что небольшие ямочки в лист пленки пластиковые парафин создаются (1 ди MPLE/ячейка совокупных требуется). Очистить Пластиковые парафин фильм с 70% этанола и облучение УФ светом (мощность: 15 Вт, длина волны: 435 Нм) под закрытой стерильные скамейке за 30 мин.
- Передачи каждой ячейки совокупности одной лунки пластиковых парафин фильм листа с помощью 100 мкл среза кончика с 1,5-2 мм в диаметре. В случае, что два мобильных агрегатов сплавлены, не разделить их, но передавать их вместе на одной лунки.
- Аккуратно аспирационная среднего, окружающие клетки агрегатов с помощью режиссерский кончика пипетки 100 мкл.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не сосать агрегаты клеток в наконечник, как это может повредить агрегатов. - 40 мкл неразбавленном BME, для каждой ячейки агрегата.
- Положение каждой ячейки агрегатные в середине BME падение с использованием режиссерский наконечник пипетки 100 мкл.
Примечание: Будьте очень осторожны, чтобы не нанести ущерба развивающихся neuroepithelium кончиком пипетки. - Тщательно передачи листа фильм пластиковые парафин, используя стерильный пинцет в 10 см Петри (или другое блюдо достаточно культуры клеток) и поместите блюдо в инкубаторе для 15-20 минут позволить BME затвердеть.
- Тем временем Подготовьте блюдо Низкий насадку 6 см, содержащие 5 мл среды корковых индукции.
- После полимеризации BME удалите капли, содержащие агрегаты клеток из листа пленки пластиковые парафина. Переверните пластиковые парафин фильм с помощью стерильный пинцет и осторожно выжмите агрегаты клеток в слегка наклонена (около 30 °) Низкий насадку 6 см блюдо до капли падают лист пленки пластиковые парафина. Перевести максимум 16 клеток агрегатов в одно блюдо 6 см.
- Далее для инкубации клеток агрегатов при 37 ° C.
4. поколение переднего мозга тип Organoids от нейроэктодермальная агрегатов
- Один день после внедрения в матрице BME, место органоид культуры блюда на качалки шейкер культуры клеток с углом наклона 5 ° и 14 об/мин, установленных в инкубатор культуры клеток.
- Organoids монитор каждый день. Однородная нейроэпителиальных цикл как структуры постепенно развиваться после внедрения в БМЭ матрицы.
- Когда нейроэпителиальных циклические структуры являются видимыми, изменить носитель органоид дифференциация носитель, содержащий DMEM-F12 с N2 дополнение (1: 200), B27 дополнение (1: 100), глюкозы (0,2 мг/мл), лагеря (0,15 мкг/мл), 0,5% NEAA, 1% L-аланил L-глютамином, инсулин (2,5 мкг/мл)
- Замените органоид дифференциации среднего каждые 3-4 дня, пока не будет достигнут желаемый дифференциации времени точка. Тогда исправьте organoids (см. раздел 5).
Примечание: Иногда ткани могут проявлять бутоны оптически полупрозрачные ткани без циклические структуры. Хотя это не идеальное решение, это не влияет на развитие корковых структур. Organoids может быть культивировали в органоид дифференциации среднего до 40 дней. Для расширенных культуры периодов (40-100 дней) органоид дифференциации среднего могут быть дополнены 1:50 BME увеличить сложность ткани и BDNF и GDNF, чтобы позволить нейрональных выживания и созревания14,15.
5. Фиксация и проверка Organoids переднего мозга тип
- Для проверки Соберите в день 20 6 organoids. Используйте 3 organoids мРНК изоляции и ПЦР анализа. Передать дополнительные 3 organoids 24-ну пластины, содержащие PBS с помощью кончика пипетки вырезать 1 мл с открытием 3-3,5 мм для фиксации и анализа последовательных иммуноцитохимическое.
- Вымойте organoids дважды, тщательно аспирационных PBS и заменив его с свежими PBS с помощью пипетки 5-мл. Исправьте organoids 15 мин в холодной параформальдегида 4% (PFA) (рН 7,4).
Осторожностью: Помните, что ПФА известный канцероген человека. Необходимо все работу в химической Зонта носить перчатки нитриловые. Рекомендуется носить защитные очки. Формальдегид может вызвать необратимые повреждения роговицы. - Аспирационная PFA тщательно и мыть, три раза с помощью PBS комнатной температуре втечение 10 мин.
- Заменить PBS с 30% раствором сахарозы (wt/vol, PBS-основе) и хранить образцы на 4 ° C, чтобы позволить organoids к обезвоживанию. Organoids может храниться до 7 дней до дальнейшей обработки.
- Один день после фиксации, предварительно пятно обезвоженной organoids путем добавления Трипановый синий приблизительно 1:50 10 минут позволить визуализации organoids во время процедуры cryosectioning.
- Подготовить внедрения среды, содержащие 10%-ая сахароза, 7,5% желатина wt/vol в PBS и тепло его до 75 ° C, до тех пор, пока жидкость.
- Заменить 30% раствора сахарозы с внедрения среднего и передачи 24-ну пластину на нагревательной пластинки (60 ° C) на 15 минут, чтобы сбалансировать organoids.
- Покрыть дно встраивание формы слоем вложения средств массовой информации и разместить их на льду для полимеризации.
- Передачи, organoids от 24-ну пластины для встраивания формы, содержащие полимеризованной внедрения среды, добавьте дополнительные вложения среднего на вершине, чтобы organoids покрыты и быстро место плесень в 100% этанола/сухого льда замораживания (ванна Температура должна быть от -30 до-50 ° C) для по крайней мере 1 мин для шоковой заморозки.
- Место плесень с щипцы на сухой лед временно и либо хранить их при температуре-80 ° C или непосредственно приступить к cryosectioning.
- Cryosection organoids 20 мкм толщина и собирать разделы на скольжениях микроскопа, сохраняя трек ордена разделы на слайдах (последовательного поглощения). Разрешить секций сушиться на слайды на несколько часов, прежде чем их хранение при температуре-80 ° C или непосредственно выполняет иммуноцитохимическое окрашивание.
Representative Results
Протокол органоид стандартизированных переднего мозга тип, описанный здесь обычно создает весьма однородной органоид культур почти исключительно спинной корковых личности из человека iPSCs в течение 20 дней культивирования (протокол, изложенные на рисунке 1 A). рекомендуется выполнять несколько этапов контроля качества в ходе время протокол, определяется здесь как: «идти» (продолжить процесс дифференциации) и «закрытых» (субоптимальные культур, рекомендуется прекратить пакете) (Рисунок 1 ). Это также целесообразно документировать каждый шаг контроля качества хорошо, принимая фотографии и заметки.
Первым важным шагом в формировании organoids переднего мозга тип — начать с высокого качества iPSC культур. Важно, что iPSCs не содержат крупных фракций дифференцированных клеток. Используйте только iPSC культур, которые представляют как однородные монослоя недифференцированных клеток в начальной населения (цифры 1B, C). Кроме того важно начать с номером данной ячейки для iPSC агрегации. Первый подробный осмотр iPSC агрегатов должны выполняться на день 2. На данном этапе агрегаты должны сформировали компактный клеток почки с гладкими краями («go») тогда как нерегулярные появляясь агрегаты или агрегаты с полости должны быть отбрасываются («бесполезное») (цифры 1 d, E). Следующий этап контроля качества должны быть выполнены на день 10 протокола. В этот момент времени, клетки агрегатов должна показать гладкой и оптически прозрачных тканей на внешней поверхности, представляющие индукции neuroectoderm («перейти»), тогда как отсутствие таких тканей указывает субоптимальные нейронной индукции (закрытых) (цифры 1F, G ). Только те агрегаты, которые демонстрируют полупрозрачные поверхности (рис. 1F) должен быть встроен в БМЭ матрицы. После того, как встроенные, корковые organoids разработает непрерывной нейроэпителиальных цикл как структуры, которые будут быстро расширяться. Анализировать эффективность корковых индукции на 15 и 20 день исследуя ли organoids у развитых поляризованные нейронных эктодермы, как показано в рисунке 1H, J («go»). В случае, что organoids не разработали такие нейроэпителиальных почки («запретной» как показано на рисунке 1,I, K), критически пересмотрите осуществляется контроль качества шаги для устранения неполадок. Когда плотно после протокол, высоко стандартизированных органоид пакетов будет создан (цифры 2а, Б), который покажет ≥ 90% однородность в поляризованных нейронных эктодермы формирования внутри и между партиями (рис. 2C). Распространенная ошибка приводит к различной эффективности формирования поляризованные нейронных эктодермы является увеличить начальный номер ячейки для iPSC агрегации, или начать с низкого качества iPSC культур, таких как микоплазмы загрязненных культур или культур, которые содержат дифференцированных клеток.
Подробная проверка спинной telencephalic личности сгенерированный organoids должны выполняться на 20-й день. С этой целью 3 organoids следует исправлено и используется для анализа иммунофлюоресценции. Слоистых нейроэпителиальных петель (рис. 3А) Экспресс нервных стволовых клеток маркер Sox2 (рис. 3B, D), маркеры переднего Pax6 и Otx2 (цифры 3 c, E) и спинной корковых маркер Emx1 (рис. 3 F). Эти корковых петли также характеризуется апикальной локализации N-Кадгерины и ZO-1 (цифры 3 g, H), клеток радиальной глии Вентрикулярная зона (vRGC)-производных микротрубочек, который охватывает от апикального в сторону базальных структур ( Рисунок 3 , я), и апикального расположен деления клеток, которые окрашивают позитивные для фосфорилированных виментин (p-виментин, Рисунок 3J). Смерть клетки могут присутствовать внутри органоид структур. Центральный апоптоз является нормальным и не влияет на развитие кортикального слоя ткани. Кроме того 3 organoids должны использоваться для оценки однородности протокола путем анализа выражения гена. Шоу, organoids переднего мозга тип выражения маркеров спинного мозга (FoxG1, Otx2, Emx1), а выражение мозга (FoxA2, Pax5) и маркеры задний мозг (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) не является обнаруживаемой (рис. 3K).
Партии под контролем качества organoids может использоваться для различных приложений, таких как анализ отдел плоскости апикальной радиальные глиальных клеток. С этой целью, мы предлагаем выполнение двойной окрашивание с использованием антител против p виментин и Tpx2 (рис. 3J). P-виментин фосфорилированных по CDK1 во время митоза и расположен в ядре, таким образом маркировки всех ядер в фазе митотического16. Tpx2 это микротрубочки связанный белок, который может визуализировать митотическая шпинделя и апикального процессов во время interkinetic ядерных миграции17,18. С помощью этих маркеров, три отдела vRGC может в принципе быть проанализированы аспекты: (I) ли ячейка разделение происходит в апикальной части, (II) является ли Отдел плоскости выравнивания вертикальных (Указывает симметричный деление клеток), горизонтальное или наклонное ( Указывает асимметричный деление клеток) в апикальной поверхности, и (III) ли организации микротрубочек центров формируются нормально.
Organoids можно также продифференцировать в более сложные структуры организованной и стратифицированной кортикального слоя ткани. Корковых структур в день 35 ± 2 organoids состоят из желудочков зоны (VZ)-, внутренний и внешний Субвентрикулярная зона (SVZ), а также кортикального слоя плиты (CP) - как области. В рамках VZ и внутренний и внешний SVZ vRGCs, промежуточные прародителями (IPs) и напоминает oRGCs клетки могут быть определены. Кроме того, начальное образование слоистых коры можно наблюдать в районе CP-как с глубоким корковых нейронов, выражая Tbr1 и Ctip2 внутри и верхняя корковых нейронов, выражая Satb2, а также рилин-клетки в наружной регионах10.
Рисунок 1 : Схематичный обзор органоид протокола и иллюстрации «идти» и «запретной» критериев. (A) Схематический обзор Протокола. CI средний: корковых индукции среднего; CD: корковых дифференциации среднего. (CB–) Изображение-подходит iPSC культуры, экспонируется дифференциации (C) и оптимального монослойном культивировании 90% вырожденная iPSC (B). (ED–) Агрегированный iPSC, оптимальный размер, плотность ячеек, и внешний вид поверхности (D) и двух агрегатов «закрытых» клеток, экспонируется либо ячейки запчасти полостей (E, верхняя агрегат) или нерегулярные края (E, Нижняя агрегат) два дня После агрегации клеток. (GF–) Агрегатов ячейки полупрозрачные и гладких краев (F) и клеток агрегатов отсутствуют оптические очистка (G). Желтая линия является визуализация области интересов. (KH–) Оптимальное органоид с непрерывной нейроэпителиальных петли (H, J) и органоид, которая смогла разработать радиально организовали neuroectoderm (я, K), отображаемого на 15 и 20, соответственно. Масштаб бары, B-C 500 мкм; D-K 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Однородность и воспроизводимость переднего мозга тип протокола органоид. (BA–) Представитель светлые области изображения organoids из одной партии в день 15 (A) и день 26 (B). (C) количественный анализ organoids на 20-й день. Organoids, отображающие на внешней поверхности neuroepithelium, узнаваемых в ярко поле как оптически ясно поверхностные ткани с четкой границы и доказательства радиальные сотовой архитектуры были количественно (n = 3 в iPSC линию с по крайней мере 16 organoids за эксперимент). Масштаб бары, A-B: 500 мкм. Ошибка бары ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Проверка переднего мозга тип organoids на день 20. (JA–) Иммуноцитохимическое характеристика organoids. Organoids организовать в нескольких нейроэпителиальных петли (A, counterstained с DAPI). Стратифицированная организованной клетки в пределах нейроэпителиальных петли Экспресс нервных стволовых клеток маркер Sox2 (B, D), переднего маркеры Pax6 (C, D) и Otx2 (E), а также маркер спинного мозга Emx1 (F). Корковых циклические структуры выставлены штраф адэрентных Джанкшен пояса на наиболее апикальной стороне с накоплением N-Кадгерины (G) и zona occludens белок 1 (ZO-1; H). желудочковая РГК микротрубочек сетей (запятнана ацетилированный α-тубулина, Ac-ванна) простираются от апикального в сторону базальных структур петли (я). Пролиферирующих клеток, выражая p виментин (p-Vim) расположены на апикальной поверхности. Митотического веретена запятнана Tpx2. Представитель высокое увеличение изображения вертикальной и горизонтальное разделение плоскости показываются на правой (J). (K) ПЦР-анализа для конкретного региона транскрипционных факторов на 20-й день два независимых наборов organoids производным от 2 линий разных iPSC. FB: мозг плода управления; AB: взрослого мозга управления. Масштаб бары, A-D 200 мкм; E-я 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Эпитоп | Разбавление |
| Sox2 | 1 - 300 |
| Pax6 | 1 - 500 |
| Otx2 | 1 - 500 |
| Emx1 | 1 - 50 |
| N-Кадгерины | 1 - 500 |
| ZO-1 | 1 - 100 |
| P-виментин | 1 - 1000 |
| Tpx2 | 1 - 500 |
| Ацетилированный α-тубулина | 1 - 500 |
| Alexa488 анти-ms | 1 - 1000 |
| Alexa488 анти-rb | 1 - 1000 |
| Alexa555 анти-ms | 1 - 1000 |
| Alexa555 анти-rb | 1 - 1000 |
Таблица 1: Антитела для контроля качества organoids на 20-й день.
| Грунтовка | Последовательность |
| Otx2 вперед | tgcaggggttcttctgtgat |
| Otx2 обратный | agggtcagagcaattgacca |
| FoxG1 вперед | ccctcccatttctgtacgttt |
| FoxG1 обратный | ctggcggctcttagagat |
| Emx1 вперед | agacgcaggtgaaggtgtgg |
| Emx1 обратный | caggcaggcaggctctcc |
| FoxA2 вперед | ccaccaccaaccccacaaaatg |
| FoxA2 обратный | tgcaacaccgtctccccaaagt |
| Pax5 вперед | aggatgccgctgatggagtac |
| Pax5 обратный | tggaggagtgaatcagcttgg |
| HoxB2 вперед | tttagccgttcgcttagagg |
| HoxB2 обратный | cggatagctggagacaggag |
| HoxA4 вперед | ttcagcaaaatgccctctct |
| HoxA4 обратный | taggccagctccacagttct |
| HoxB4 вперед | acacccgctaacaaatgagg |
| HoxB4 обратный | gcacgaaagatgagggagag |
| HoxB6 вперед | gaactgaggagcggactcac |
| HoxB6 обратный | ctgggatcagggagtcttca |
| 18s вперед | ttccttggaccggcgcaag |
| 18s обратный | gccgcatcgccggtcgg |
Таблица 2: Грунтовка и последовательностей праймера для профиля выражение гена.
Discussion
Мозг organoids представляют собой мощный инструмент для изучения человеческого мозга развития в пробирке , как они обеспечивают на фоне соответствующих видов и сложные 3D расположение ячеек в контексте ткани. С этим они преодолеть разрыв между не человеком животных моделей и редукционистской человека двумерных монослоя клеток культуры техники. Их приложения однако, сдерживается отсутствием воспроизводимость9. Мы разработали протокол органоид переднего мозга тип, который преодолевает большой изменчивости в образец путем объединения потенциала самоорганизации iPSC с их ответственностью кучность факторов. В частности iPSCs были суммированы для поощрения самоорганизации и впоследствии подавляют TGF-β/SMAD сигнализации содействовать дифференциации спинной коры, подвергая культур в BMP (LDN-193189) и TGF-β типа ингибитор рецепторов (A83-01). Кроме того соединение, ингибирующих путь Wnt (ИУВР) для предотвращения posteriorization был применен. В отличие от «встроенный» мозгового органоид протоколы19, которые основаны на самостоятельной сборки без внешнего контроля, рождая organoids довольно неоднородная мозга и экспонирования большого пакета вариации (измеряется эффективность поляризованные Нейронные эктодермы формирования15), протокол, описанные здесь можно воспроизвести генерирует однородной переднего конкретных organoids из человека iPSCs.
Эти organoids переднего мозга тип может использоваться для различных приложений, таких как исследования неврологического, эволюционные исследования, включая исследования функции гена, моделирование болезней и, потенциально, наркотиков испытания и лечебных целях. Протокол, однако, является наиболее подходящим для изучения ранних аспектов развития человека корковых. Например, мы использовали organoids переднего мозга тип для изучения человека специфические аспекты поведения vRGC. Говоря более конкретно патофизиологические изменения, связанные с тяжелой формой Лиссэнцефалия, человека корковых мальформация, характеризуется почти полное отсутствие корковых складывания, был рассмотрен. Только некоторые аспекты этого заболевания могут быть смоделированы в мышей, как мозг мыши естественно lissencephalic. При применении системы органоид Лиссэнцефалия пациента производные iPSCs, мы могли бы надежно пилки человека специфические аспекты этого заболевания и выявления основных механизмов. Говоря более конкретно мы смогли продемонстрировать, что пациент производные organoids показывают значительное сокращение в размер, вызванные переключатель от симметричного асимметричным разделением клетки vRGCs. Этот переключатель был связан с изменениями в Организации vRGCs микротрубочек сети, нарушение архитектуры VZ ниши и экспрессию молекул адгезии клеток, приводит к ослабленным активации N-Кадгерины/β-Катенин сигнализация оси10. Примечания: β-катенина зависимой регулирование режимов vRGC отдела было предложено конкретного человека как гиперэкспрессия β-катенина мышей приводит к расширению тангенциальная коры и впоследствии корковых складывания20. Таким образом наши данные подчеркивают, что система органоид переднего мозга тип является перспективным инструментом для изучения в количественной форме человека специфические аспекты раннего корковых развития в пробирке.
Основной задачей на будущее является для поддержания однородности organoids через длительного времени для того, чтобы достичь более зрелых нейронов фенотипов. Это могут быть реализованы одним или несколькими из следующих: культивирование organoids в биореакторе системы14, применяя плавающей помостами15, дополняющего дифференциации среднего с нейронных роста, или выживаемость нейронов факторов. Наконец контролируемых увеличение сложности мозга может быть достигнуто путем сплавления переднего мозга тип organoids с церебральной organoids различных региональных личности21,22.
Вместе взятые, протокол органоид переднего мозга тип, представленные здесь предлагает легко применимы и надежный инструмент для генерации ранних корковых структур в пробирке. Протокол дает расти весьма однородной ранних кортикального слоя ткани по нескольким строкам iPSC и может быть использован для надежно вырабатывают отдельных конкретных кортикального слоя ткани. Таким образом система особенно подходит для приложений, которые требуют высокой степенью однородности и воспроизводимость таких заболеваний моделирования.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работы было поддержано Министерством науки инноваций и исследований Северный Рейн-Вестфалия (младший исследовательская группа) и ERA-NET нейрон, JTC 2015 нервной расстройств, стволовые-мкр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
| Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
| Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
| Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
| Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
| D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
| DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
| Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
| Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
| Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
| IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
| L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
| Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
| Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
| Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
| Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
| Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
| Antibodies | |||
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
| Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
| Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
| Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
| N-cadherin | BD | 610921 | |
| ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
| P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
| Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
| Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
| Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |
References
- Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size. Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Iefremova, V., et al. An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome. Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. , (2017).
- Yamaguchi, T., et al. Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis. J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).
- Heidebrecht, H. J., et al. p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood. 90 (1), 226-233 (1997).
- Kosodo, Y., et al. Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain. EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Chenn, A., Walsh, C. A. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. , (2017).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
