Summary
Serebral organoids erken insan beyni geliştirme vitroaraştırmak için yeni bir modeli sistemi temsil eder. Bu makale verimli bir şekilde homojen dorsal ön-tipi organoids İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre de dahil olmak üzere kritik karakterizasyonu ve doğrulama adımları oluşturmak için ayrıntılı yöntembilim sağlar.
Abstract
İnsan korteks son derece genişletilir ve biliş gibi yüksek beyin fonksiyonu sağlayan belirli işlevsel alanları ile karmaşık bir yapı sergiler. İnsan Beyin korteksi geliştirme eğitim çabaları model sistemleri kullanılabilirlik tarafından sınırlı sahip. Kemirgen çalışmaları sonuçlarından insan sistemi için çeviri türler farklılıklar tarafından kısıtlanır ve insan birincil dokular üzerinde çalışmalar etik kaygılar yanı sıra doku kullanılabilirlik eksikliği tarafından engel vardır. İnsan pluripotent kök hücre (PSC) teknolojisinde son geliştirme bir belirli ölçüde insan özgü beyin geliştirme vitroiçin taklit üç boyutlu (3D) kendi kendini düzenleyen organotypic kültür sistemleri, nesil içerir. Şu anda, çeşitli protokoller için tüm beyin ya da beyin bölgesi belirli organoids nesil mevcuttur. Homojen ve tekrarlanabilir ön türü organoids nesil PSC (IPSC), biz daha önce kurulan indüklenen ve burada, açıklamak için yöntem PSC içsel yeteneği güdümlü farklılaşma doğru kendi kendine organize şekilde birleştirir anterior nöroektodermal soy ve sürekli neuroepithelium oluşumunu desteklemek için gömme matris. Daha ayrıntılı olarak, bu iletişim kuralını içerir: (1) IPSC toplamları IPSC kolonileri dönüşüm Konfluent monolayer kültürüne; de dahil olmak üzere, nesil (2) ön neuroectoderm indüksiyon; (3 nöroektodermal agrega bir matris iskele katıştırma; (4) ön-tipi organoids nöroektodermal toplamları üzerinden üretimi; ve (5) fiksasyon ve doğrulanmasını ön-türü organoids. Bu nedenle, bu iletişim kuralı standart ve tekrarlanabilir IPSC kaynaklı kortikal doku yapıları vitroüretimi için kolayca uygulanabilir bir sistem sağlar.
Introduction
İnsan beyni açıkça en karmaşık organ biridir ve tüm insan fikri yetenekleri için sorumludur. Böylece, insan özgü beyin gelişimi daha derin bir anlayış insan bilişsel yetenekleri anlayış için kritik bir önkoşuldur. Geleneksel olarak, Transjenik hayvanlar beyin gelişimi çalışmaya model organizmalar görev yaptı. Bu modeller beyin gelişimi prensipleri temel içgörü sağladı. Şimdi ortak bir özelliği tüm memeliler içinde beyin gelişiminin kesin bir koreografi progenitör yayılması, neurogenesis ve nöronal göç olduğunu biliyoruz. Ancak, model organizmalar, kemirgenler ve insanlarda, yeni korteksimiz özellikle gibi beyni arasında önemli yapısal farklılıklar vardır. Artan bir kök ve progenitör hücrelerin çoğalması yanı sıra dış Radyal glia hücreleri (oRGCs), kemirgenler1 çok nadir bulunan nesil primat kortikal evrim katkıda için önerilen birincil mekanizmaları vardır ,2,3.
Model insan beyin korteksi geliştirme yöntemleri, PSC kaynaklı telencephalic progenitör hücreler ve serebral korteks projeksiyon nöronlar nesil monolayer kültürler olarak içerir. Bunlar farklılaşma standart iletişim kuralları yeniden yürütme kortikal neurogenesis4klişeleşmiş zamansal sırasını gibi insan kortikal geliştirme bazı yönlerini. Organogenesis kayma desenlendirme ve morfogenetik gibi gelişimsel süreçleri Rekapitülasyon gelince onlar, ancak, yetersiz kalmaktadır. 3D organoid kültürler için kök hücre biyolojisi daha yeni gelişmeler vitro insan organogenesis araştırma devrim PSC'ler yol açtı. Organotypic yapıları kendi kendine organize etmek PSC'ler kapasitesini kullanan, organların böbrek, bağırsak, göz ve beyin de dahil olmak üzere önemli yapısal ve işlevsel özellikleri yansıtan çeşitli organoids kurulan5olmuştur. Böyle organoids birlikte gruplamak ve dağınık şekilde gelişen organlar vivo içinde5,-6çok benzer düzenlemek birden fazla organ özgü hücresel alt türlerinden birini içerir. Buna ek olarak, hücre kompozisyon, lineage ilişki ve gen ağ çalışmaları tek hücreli RNA sıralama kullanarak insan beyin organoids sadakatle gen ifade programları gibi insan cenin yeni korteksimiz gelişiminin önemli yönü özetlemek ortaya 7 , 8. defa geniş uygulama engelledi, önemli bir dezavantajı olduğunu, ancak, büyük toplu iş toplu iş varyasyonları ve organoid organoid heterojenlik9.
Burada, bir basit ve standart ön-tipi organoid kültür sistemi için detaylı bir protokol sağlar. Anahtar özellik bu sistemin bu PSC kaynaklı organoids neredeyse özel dorsal telencephalic kimlik verimli ve tekrarlanarak oluşturur olduğunu. Protokol yöntemleri bizim son Hücre raporları kağıt10içinde kullanılan temel alır. İPSCs kendi kendine organizasyon kapasitesini kortikal neuroepithelium seçici indüksiyon ile birleştirir ve homojen erken dorsal telencephalic doku kültürleri 3 hafta içinde. sağlam oluşturabilir Daha önce raporlanmış SMAD sinyal ve PSC farklılaşma birlikte ön nöroektodermal lineage11,12 doğru katıştırma, hangi matrisiyle kılavuzları Wnt inhibisyon stratejisi Protokolü oluşturur büyük ve sürekli neuroepithelial yapıları13oluşumu teşvik etmektedir. Bağımsız başına birkaç klonlar ile çeşitli IPSC satırlarındaki açıklanan yöntemi başarıyla kullanmıştır. Biz bu sistemi tekrarlanabilirlik ve homojenliği hastalığı modelleme gibi büyük öneme sahip olan aşağı akım uygulamaları için uygun olduğunu gösterdi. Hastalarda şiddetli bir kortikal malformasyon elde iPSCs için iletişim kuralı uygulamak zaman hastalık vitro patolojik işaretlerinden özetlemek ve fenotipik için önde gelen yeni moleküler mekanizmalar belirlemek için başardık 10değiştirir. Açıklanan organoid Protokolü indirgemeci kortikal monolayer PSC elde edilen kültür ve in vivo çalışmalar arasındaki boşluğu kapatmak için kullanılması gereken ve bu erken benzetimini yapmak için bir güvenilir ve istikrarlı hücre tabanlı modeli sistemi temsil öneririz Sağlık ve hastalık insan vücudu dışında insan kortikal geliştirme.
Protocol
1. nesil IPSC toplamları
- Tek hücreli monolayer kültürler IPSC kolonilerden nesil
- Bir membran kaplı özü (BME) 6-şey tabak hazırlamak. BME buz için 2-3 h 4 ° C'de erimek, soğuk Dulbecco'nın modifiye kartal orta F12 ile seyreltik (DMEM-F12; 1:50 seyreltme), 1 mL/seyreltilmiş BME çözümün de plaka kapak ve plaka gecede 4 ° C'de depolayın
- Orta Aspire edin ve bozulmamış IPSC kolonileri 6-şey plaka ile 0,5 mM EDTA fosfat tamponlu tuz (PBS) en az 2 Wells önce iki kez kuluçka kolonileri 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) PBS (RT) oda sıcaklığında 4 dk ile yıkayın. EDTA çözüm Aspire edin ve yavaşça koloniler çanak alt 5 mL DMEM-F12 orta ile kapalı yıkayarak ayır. Onları bir 15 mL tüp içinde toplamak ve onları Santrifüjü (1200 x g , RT, 4 dk) tarafından cips.
Not: iPSCs piyasada bulunan fibroblast yeniden programlanan başarıyla kullanılan10oldu. - Süpernatant Aspire edin ve hücre-ayrılma reaktif 6 dk. 37 ° C'de için 500 µL ile IPSC kolonileri kuluçkaya
- Damlalıklı hücre süspansiyon kalan hücre kümeleri tek hücrelere kırmak için 1 mL pipet ile birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı.
- DMEM-F12 4 mL hücre-ayrılma reaktif sulandırmak için hücre süspansiyon ekleyin.
- Hücreleri aşağı vasıl 1200 x g 4 dk RT. az için spin
- 5 mikron ile desteklenmiş IPSC orta 2 mL hücrelerde resuspend Y-27632 ve tohum hücreleri kaplı BME 6-şey plaka bir kuyunun içine.
Not: Bir tek hücreli monolayer IPSC kültürler için Malzemeler tablo belirtilen IPSC aracı kullanın. - Ertesi gün, orta Y-27632 eksik taze IPSC orta ile değiştirin. Bu noktadan sonra orta iPSCs % 100 birleşmesi kadar her gün değişen hücreler kültür devam. Hücre ve başlangıç Wells confluency bağlı olarak, bu 2-4 gün arasında sürer.
- Bir kez Konfluent geçiş iPSCs. Orta Aspire edin ve hücre-ayrılma reaktif 500 µL hücreleri üzerinde uygulayın.
- 5-10 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya Yavaşça hücreleri ayırmak için plaka rock.
- Kuyu hücrelerden yıkayın ve onları bir 15 mL tüp içinde toplamak 2 mL DMEM-F12 kullanma. DMEM-F12 toplam hacmi 5 mL için ekleyin.
- Spin aşağı vasıl 1200 x g RT, 4 dk için hücreleri ve süpernatant Aspire edin.
- Hücreleri tohum 5 mikron ile desteklenmiş IPSC orta Y-27632 bir 1:2.1: 4 oranı bir BME tarih 6-şey plaka (2 mL/iyi orta) kaplı.
- 2-5 gün için hücreleri kültür ve Y-27632 her gün eksik IPSC orta değiştirmek devam edin. Bir kez Konfluent geçit iPSCs (adımları 1.1.4-1.1.8).
Not: Bir monolayer IPSC agrega üretimi için hücrelere kültür koşullarına uyum sağlamak için kullanmadan önce Malzemeler tablo belirtilen IPSC Orta olarak iPSCs en az 2 pasajlar için kültür.
- IPSC agrega üretimi için % 70-90 birleşmesi olduklarında monolayer IPSC kültürler kullanın.
Not: tek hücreleri vurgulamak daha az eğilimli olduğu gibi kültür şartlarına adapte IPSC ayrılma ve toplama işlemi sırasında hücre ölümüne yol açar. Monolayer IPSC kültürler tipik pluripotent Morfoloji farklılaşma hiçbir kanıt ile görüntülemeniz gerekiyor. Kültürler Mikoplazma kirlenme için düzenli olarak sınayın. Sadece Mikoplazma ücretsiz IPSC kültürleri ile çalışır.- 6-şey plaka bir kuyu kültür ortamından Aspire edin ve hücre-ayrılma reaktif 500 µL hücreleri üzerinde uygulayın.
- 5-10 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya Yavaşça hücreleri ayırmak için plaka rock.
- Kuyu hücrelerden yıkayın ve onları bir 15 mL tüp içinde toplamak 2 mL DMEM-F12 kullanma. DMEM-F12 toplam hacmi 10 mL için ekleyin.
- Hücre sayımı için 25 µL hücre süspansiyon üzerinden alıp trypan ölü hücreleri işaretlemek için mavi 25 µL ile karıştırın. Bir sayım odası kullanarak yaşayan hücreleri saymak.
- Yeterince hücre (IPSC toplama başına 4.500 hücreleri) hücre süspansiyon 15 mL tüp içinde toplamak.
- Spin aşağı vasıl 1200 x g RT, 4 dk için hücreleri ve süpernatant Aspire edin.
- 50 µM ile desteklenmiş IPSC orta uygun bir cilt hücrelerinde resuspend 150 µL başına 4.500 canlı hücre elde etmek için Y-27632.
Not: Y-27632 yüksek konsantrasyon kullanarak (50 µM) iPSCs yaşam için önemlidir. - Her 150 µL plaka iyi bir düşük-eki 96-şey U-alt plaka ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka yerleştirin.
Not: IPSC toplamları oluşturma sırasında en az 6 organoids (bkz: Bölüm 5) 20 gün kalite kontrol için gerekli olan göz önünde bulundurun.
2. indüksiyon ön Neuroectoderm
- Yakından IPSC toplamları Morfoloji değişikliklerini her gün bir 4 X veya 10 X güç lens kullanarak doku kültürü mikroskop altında izlemeye. Günde 1, hücre toplamları açık sınırları ile gözlemlemek. Kültür IPSC toplamları kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2devam ediyor.
Not: Ölü hücreler/iyi belirli sayıda normal ve organoid üretimi etkilemez. - 2 gün'den başlayan ve her geçen gün ile yavaşça yaklaşık 2/3 orta alt hücre toplamları bozmadan alıyorum tarafından devam IPSC toplamları besleme. Y-27632 eksik IPSC orta ek bir 100 µL ekleyin.
Not: 4-6 gün içinde hücre toplamları çapı 350-450 µm olmak ve düzgün kenarlara sergilemek. - Bu aşamada, havuzu hücre bir kesim 100 µL pipet ucu ile bir düşük-eki 6 cm tabak (en fazla 20 toplamları/çanak) içine DMEM-F12 içeren N2 ek (1: 200), B27 ek (1: 100), glikoz (0.2 mg/mL), döngüsel kortikal indüksiyon ortamda toplar Adenozin monofosfattır (kampı; 0.15 µg/mL), %0,5 non-gerekli amino asitler (NEAA), % 1'l-alanyl-L-glutamine, heparin (10 µg/mL) ve bileşikleri LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) ve inhibitörü Wnt yanıt-1 (IWR-1) (10 µg/mL). 6-cm çanak aktarmadan sonra 3 gün kortikal indüksiyon orta değiştirerek hücre toplamları besleme.
- Yakından bir 4 X güç lens ile doku kültürü mikroskop altında kortikal indüksiyon sırasında morfolojik değişiklikleri izlemek.
Not: Kortikal indüksiyon ortamda 4-5 gün sonra hücre toplamları kenarlarını nöroektodermal farklılaşma gösteren yüzeyde aydınlatmak başlamalıdır. Bu aşamada, Radyal pseudostratified epitel organizasyonu ortaya çıkıyor. Bölüm 3 hücre toplamları BME dizey içinde katıştırmak için devam edin.
3. nöroektodermal gömme bir matris iskele toplar
- BME 4 ° c için 2-3 h. Aliquot su katılmamış BME yeterli miktarda buz çözme.
- Bir plastik parafin film sayfası katıştırma işlemi için hazırlanın. 4 cm x 4 cm büyük steril makas kullanarak plastik parafin film parçaları, plastik bir parça koy, 100 µL ipuçları için bir boş 100 µL ipucu tepsi üzerinde film alkol ve plastik parafin film sayfasında küçük Gamze (1 di oluşturulur eldivenli bir parmak ile basın kesim mple/gerekli hücre toplama). Plastik parafin film % 70 etanol ile temiz ve UV ışığı ile ışınlatayım (güç: 15 Watt, dalga boyu: 435 nm) 30 dk için kapalı steril tezgah altında.
- Her hücre toplama 1.5-2 mm çapında açılış ile 100 µL kesme ucu kullanarak plastik parafin film sayfasının bir çukur aktarın. İki toplamları hücre durumda erimiş, onları ayrı değil ama onları birlikte bir çukur için transfer.
- Yavaşça kesilmemiş bir 100 µL pipet ucu kullanarak hücre toplamları çevreleyen orta Aspire edin.
Not: Bu agrega zarar verir gibi içine belgili tanımlık uç, hücre toplamları değil emmek için dikkatli olun. - Su katılmamış BME 40 µL her hücre toplamak için ekleyin.
- Her hücrenin ortasında BME toplama bırakın kesilmemiş bir 100 µL pipet ucu kullanarak konum.
Not: Pipet ucu ile gelişmekte olan neuroepithelium zarar vermeyecek çok dikkatli olun. - Dikkatle plastik parafin film sayfası içine 10 cm Petri kabına steril forseps (veya başka bir yeterli hücre kültür tabak) kullanarak transfer ve 15-20 dk BME kuvvetlendirmek izin vermek için kuluçka çanak yerleştirin.
- Bu arada, kortikal indüksiyon orta 5 mL içeren bir düşük-eki 6 cm yemek hazırlamak.
- BME polimerizasyon sonra plastik parafin film sayfasından hücre toplamları içeren damlacıklar kaldırın. Steril forseps kullanarak üzerinden plastik parafin film çevirmek ve hafifçe sıkmak hücre toplamları içine biraz eğik (yaklaşık 30 °) damlacıkları plastik parafin film sayfası düşmek kadar düşük-eki 6 cm çanak. En fazla 16 hücre toplamları bir 6 cm çanak içine aktarın.
- Hücre toplamları 37 ° C'de kuluçkaya devam
4. nesil nöroektodermal toplamları üzerinden ön-türü Organoids
- Bir gün sonra BME dizey içinde katıştırma organoid kültür yemekleri eğme açısını 5 ° ve 14 d/d, bir hücre kültür kuluçka makinesine yüklü, sallanan bir hücre kültür shaker yerleştirin.
- Organoids her gün izlemek. Homojen neuroepithelial döngü benzeri yapıları BME matris içinde katıştırma sonra yavaş yavaş geliştirmek.
- Neuroepithelial döngü yapıları görünür olduğunda, orta DMEM-F12 N2 ek (1: 200), B27 ek (1: 100), glikoz (0.2 mg/mL), kamp (0.15 µg/mL), %0,5 içeren organoid farklılaşma Orta olarak değiştirin NEAA, % 1'l-alanyl-L-glutamine, insülin (2,5 µg/mL)
- Organoid farklılaşma orta yerine 3-4 istenen ayırt etme süresi noktası ulaşılana kadar günde. Sonra (bkz Bölüm 5) düzeltme organoids.
Not: Zaman zaman, doku tomurcukları optik yarı saydam doku döngü yapıları olmadan sergileyebilirler. Bu ideal olmasa da, bu kortikal yapılar gelişimi etkilemiyor. Organoids organoid farklılaşma ortamda 40 güne kadar kültürlü. Bir süre organoid farklılaşma orta 1:50 ile desteklenen genişletilmiş kültür (40-100 gün) BME doku karmaşıklığı artırmak ve nöronal hayatta kalma ve olgunlaşma14,15izin veren BDNF ve GDNF ile.
5. fiksasyon ve ön-tipi Organoids doğrulama
- Doğrulama için gün 20 6 organoids toplamak. 3 organoids mRNA yalıtım ve PCR analizleri için kullanın. Ek 3 organoids PBS fiksasyon ve sıralı immunocytochemical analizleri için bir açılış 3-3.5 mm kesim 1 mL pipet ucu kullanarak içeren bir 24-şey plaka aktarın.
- Organoids dikkatle PBS aspirating ve taze PBS ile 5 mL pipet kullanarak yerine tarafından iki kez yıkayın. Organoids 15 dakika soğuk %4 paraformaldehyde (PFA) (pH 7,4) düzeltmek.
Uyarı: İngiltere'de yılın bilinen bir insan kanserojen olduğunu dikkatli olun. Tüm iş nitril eldiven giymiş bir kimyasal duman mahallede yapılmalıdır. Bu koruyucu gözlük giymek için tavsiye edilir. Formaldehit korneanın geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. - PFA dikkatle Aspire edin ve oda sıcaklığında PBS 10 dakikadır kullanarak yıkama üç kez.
- PBS yerine koymak ile % 30 Sükroz eriyik (wt/vol, PBS tabanlı) ve örnekleri 4 ° C'de organoids kurutmak izin vermek için saklayın. Organoids için daha fazla alay kadar 7 gün saklanabilir.
- Fiksasyon sonra bir gün susuz organoids yaklaşık 1:50 10 dk organoids görselleştirme cryosectioning işlemi sırasında izin vermek için trypan mavi ekleyerek önceden leke.
- % 10 sukroz, % 7.5 jelatin wt/vol PBS, içeren gömme orta hazırlamak ve sıvı kadar 75 ° C sıcak.
- % 30 Sükroz çözüm ile gömme orta yerine ve ısıtma yüzeyi (60 ° C) 24-şey tabağa 15dk için organoids equilibrate transfer.
- Gömme media tabakası ile gömme kalıp alt kapak ve polimerize Buza koyun.
- Transfer polimerli gömme orta içeren gömmenin organoids 24-şey plaka Kalıpları ekle ek gömme orta üstte böylece organoids kaplıdır ve kalıp hızla dondurma banyo () % 100 etanol/kuru buzun içinde yer Sıcaklık -30-50 ° c arasında olmalı) şok dondurma için en az 1 dakika için.
- Kuru buz geçici olarak üzerinde Pensler ve onları-80 ° C'de veya doğrudan cryosectioning ile devam ya da mağaza ile kalıp yerleştirin.
- Cryosection organoids 20 µm kalınlık ve toplamak tutmak mikroskop slaytlardaki bölümler slaytlarda (sıralı uptake) bölümleri sipariş izlemek. Bunları-80 ° C'de saklamak veya doğrudan immunocytochemical boyama gerçekleştirmeden önce slaytlar üzerinde birkaç saat boyunca kurumaya bölümler de olanak sağlar.
Representative Results
Burada tipik olarak açıklanan standart ön-türü organoid Protokolü neredeyse sadece dorsal kortikal kimlik kültürleri son derece homojen organoid insan iPSCs ekimi ( şekil 1 ' de özetlenen Protokolü 20 gün içinde oluşturur A). bu tanımlanan protokolü, saat süresince çeşitli kalite kontrol adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir burada olarak: '(farklılaşma süreci devam) git' ve 'No' (suboptimal kültürler, tavsiye edilir toplu işlem sona erdirme) (Resim 1 ). İyi resimler ve notlar alarak her kalite kontrol adım belgelemek için önerilir.
Ön-tipi organoids üreten ilk kritik adım yüksek kaliteli IPSC kültürleri ile başlamaktır. İPSCs farklılaştırılmış hücrelerin büyük kesir içermeyen önemlidir. Sadece mevcut IPSC kültürler (1B, C rakamlar) başlangıç nüfus farklılaşmamış hücreleri homojen bir monolayer olarak kullanın. Buna ek olarak, IPSC toplama için belli bir hücre numarası ile başlamak çok önemlidir. 2 günde IPSC toplamları ilk detaylı bir incelemesi gerçekleştirilmelidir. Düzensiz görünen toplamları veya toplamları ile boşluklar atılır ('vazgeçtik') (rakamlar 1 d, E) olmalıdır, ancak bu aşamada agrega kompakt cep tomurcukları düzgün kenarlara ('Git') ile oluşmuş. Kalite kontrol bir adım Protokolü'nün 10 gün yapılmalıdır. Zaman bu noktada, hücre toplamları pürüzsüz ve optik yarı saydam doku Dış yüzeyde suboptimal sinirsel indüksiyon böyle dokusu yokluğu gösterir, ancak indüksiyon neuroectoderm ('Git') temsil eden ('No') göstermelidir (rakamlar 1F, G ). Sadece yarı saydam yüzey (şekil 1F) sergi toplamları BME matris gömülü olması. Katıştırıldıktan sonra kortikal organoids hızlı bir şekilde genişleyecektir sürekli neuroepithelial döngü benzeri yapılar gelişecektir. Organoids şekil 1H, J ' ('Git') gösterildiği gibi gelişmiş polarize sinirsel ektoderm olsun 15 gün ve gün 20 kortikal indüksiyon verimliliğini inceleyerek analiz. Organoids böyle neuroepithelial tomurcukları ( 'Resim 1ben Kiçinde gösterildiği gibi No'), eleştirel gelişmiş değil bu durumda sorun giderme için gerçekleştirilen kalite kontrol adımları gözden geçirin. Ne zaman sıkı bir şekilde takip protokolü, yüksek standart organoid toplu işlemleri olacak oluşturulan (2A, B rakamlar), hangi-ecek göstermek ≥ % 90 homojenliği polarize sinirsel ektoderm oluşumu içinde ve toplu işlemler (Şekil 2C) arasında. Polarize sinirsel ektoderm oluşumu değişken verimliliği için önde gelen bir yaygın hata IPSC toplama başlangıç cep numarasını artırmaktır veya kültürler veya içeren kültürleri ile başlamak için düşük kaliteli IPSC kültürler Mikoplazma gibi kontamine hücreleri ayrıştırılan.
Oluşturulan organoids dorsal telencephalic kimlik detaylı bir doğrulama 20 gün yapılmalıdır. Bu amaçla, 3 organoids sabit ve ayirt analizleri için kullanılan gerekir. Tabakalı neuroepithelial döngüler (şekil 3A) hızlı nöral kök hücre işaretçisi Sox2 (şekil 3B, D), Pax6 ve Otx2 ön işaretleri (rakamlar 3 c, E) ve dorsal kortikal marker Emx1 (Resim 3 F). kortikal bu döngü daha fazla N-cadherin ve ZO-1 (rakamlar 3 g, H), ventrikül bölge Radyal glia hücre (vRGC) bir apikal yerelleştirme tarafından karakterize edilmektedir-apikal yapıları (Bazal tarafına yayılan Mikrotubul türetilmiş Şekil 3 ben), ve apikal için fosforile vimentin olumlu leke hücre bölünmesi bulunmaktadır (p-Vimentin, şekil 3J). Hücre ölümü organoid yapıları içinde bulunabilir. Merkez apoptosis normaldir ve kortikal doku gelişimini etkilemez. Ayrıca, 3 organoids protokol polimerlerin değerlendirmek için gen ifade analizleri tarafından kullanılmalıdır. Ön-tipi organoids ifadesi dorsal ön işaretleri (FoxG1, Otx2, Emx1), orta (FoxA2, Pax5) ifade göster ve arka beyin (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) işaretleri tespit (şekil 3K) değil.
Kalite kontrol organoids toplu halde apikal Radyal gliyal hücreler bölünme boyutunda analizleri gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu amaçla, biz Çift Kişilik p-Vimentin ve Tpx2 karşı antikor kullanarak boyama yapmak öneririz (şekil 3J). P-Vimentin CDK1 tarafından mitoz sırasında fosforile ve çekirdeğinde, böylece tüm çekirdeklerin Mitotik faz16işaretleme yer alır. Tpx2 Mitotik iğ ve apikal işlemler sırasında interkinetic nükleer geçiş17,18görselleştirebilirsiniz Mikrotubul ilişkili proteindir. Bu işaretçileri kullanarak, vRGC division üç yönden prensip olarak çözümlenebilir: ister division uçak hizalanmış dikey (gösteren simetrik hücre bölünmesi), yatay veya oblik ((I) ister division apikal yanında, (II) yer alır hücre asimetrik hücre bölünmesi olduğunu gösterir) apikal yüzey ve (III) olup Mikrotubul organize merkezleri oluşan normalde.
Organoids da daha fazla daha karmaşık kortikal doku organize ve tabakalı yapıları farklı. Kortikal gün 35 ± 2 organoids içinde Ventriküler bölge (VZ)-, bir iç ve dış subventricular bölgesi (SVZ) yanı sıra kortikal plaka (CP) - alan gibi yapılarından oluşur. VZ ve iç ve dış SVZ içinde vRGCs, ara ataları (IPS) ve hücreleri oRGCs hatırlatan tespit edilebilir. Buna ek olarak, bir katmanlı korteks ilk oluşumu CP-gibi bir alanda Tbr1 ve içinde Ctip2 ve üst kortikal nöronlar Satb2, ifade ifade derin kortikal nöronlar ile görülebilir yanı sıra dış bölgelerde10Reelin ifade hücrelerde.
Resim 1 : Organoid Protokolü ve 'go' ve 'No' ölçütleri örnek şematik bakış. (A)protokol şematik bakış. CI orta: kortikal indüksiyon orta; CD: kortikal farklılaşma orta. (B-C) Görüntü bir en uygun % 90 Konfluent IPSC monolayer kültür (B) ve farklılaşma (C) sergileyen bir uygun olmayan IPSC kültür. (D-E) Bir IPSC toplam boyutu, hücre yoğunluğu ve yüzey görünümü (D) en iyi ve her iki hücre sergileyen iki 'No' hücre toplamları yedek boşluklar (E, üst toplama) ya da düzensiz (E, alt toplamak) iki gün kenarları Aşağıdaki hücre toplama. (F-G) Yarı saydam ve pürüzsüz kenarlar (F) ve optik eksik hücre toplamları sergilenmesi hücre toplamları (G) takas. Sarı çizginin ilgi alanı görselleştirme. (H-K) Sürekli neuroepithelial döngüler (H, J) ile en iyi bir organoid ve Radyal geliştirmek için başarısız bir organoid gün 15 ve gün 20, sırasıyla görüntüsü neuroectoderm (ben, K) düzenlenir. Ölçek çubukları, B-C 500 µm; D-K 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Homojenliği ve tekrarlanabilirlik ön-tipi organoid Protokolü'nün. (A-B) Organoids gün 15(a)ve gün 26 (B) bir toplu iş temsilcisi alan parlak görüntüler. Günde 20 organoids (C) kantitatif analiz. Dış yüzeyde bir neuroepithelium, Açık kenarlık ve Radyal hücresel mimarisi kanıtı ile optik net yüzeysel doku olarak parlak alanındaki tanınabilir görüntüleyen Organoids sayılabilir (n = IPSC satır başına 3 en az 16 organoids ile deneme). Ölçek barlar, A-B: 500 µm. hata çubukları ± SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Ön-tipi organoids doğrulama günde 20. (A-J) Immunocytochemical organoids karakterizasyonu. Organoids birden fazla neuroepithelial döngüler (A,) DAPI ile counterstained düzenlemek. Neuroepithelial döngüler express nöral kök hücre işaretçisi Sox2 içinde organize hücreleri (B, D), ön işaretleri Pax6 tabakalı (C, D) ve Otx2 (E), yanı sıra dorsal ön işaret Emx1 (F). Kortikal döngü yapıları iyi yapisan Kavşağı kemer N-cadherin (G) ve zona occludens protein 1 (ZO-1; birikimi ile en apikal yan sergiledi. H). ventrikül RGCs Mikrotubul (acetylated α-tübülin, Ac-küvet tarafından lekeli) ağları genişletmek apikal döngü yapıları (Ben) Bazal tarafında. P-vimentin (p-VIM) ifade Proliferasyona hücrelerin apikal yüzeyde yer almaktadır. Mitotik iğ Tpx2. temsilcisi daha yüksek büyütme görüntü dikey tarafından lekeli ve yatay bölümü uçak (J) sağ tarafta gösterilir. (K) RT-PCR analiz için bölgeye özgü transkripsiyon faktörleri günde 20 organoids iki bağımsız kümesi türetilmiş 2 farklı IPSC satırlarından. FB: fetal Beyin kontrolü; AB: Yetişkin Beyin kontrolü. Ölçek çubukları, A-D 200 µm; E-ben 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Epitope | Seyreltme |
| Sox2 | 1 - 300 |
| Pax6 | 1 - 500 |
| Otx2 | 1 - 500 |
| Emx1 | 1 - 50 |
| N-cadherin | 1 - 500 |
| ZO-1 | 1 - 100 |
| P-Vimentin | 1 - 1000 |
| Tpx2 | 1 - 500 |
| Acetylated α-tübülin | 1 - 500 |
| Alexa488 ms anti | 1 - 1000 |
| Alexa488 anti rb | 1 - 1000 |
| Alexa555 ms anti | 1 - 1000 |
| Alexa555 anti rb | 1 - 1000 |
Tablo 1: Antikor organoids gün 20 Kalite kontrolü için.
| Astar | Sıra |
| Otx2 ileri | tgcaggggttcttctgtgat |
| Otx2 ters | agggtcagagcaattgacca |
| FoxG1 ileri | ccctcccatttctgtacgttt |
| FoxG1 ters | ctggcggctcttagagat |
| Emx1 ileri | agacgcaggtgaaggtgtgg |
| Emx1 ters | caggcaggcaggctctcc |
| FoxA2 ileri | ccaccaccaaccccacaaaatg |
| FoxA2 ters | tgcaacaccgtctccccaaagt |
| Pax5 ileri | aggatgccgctgatggagtac |
| Pax5 ters | tggaggagtgaatcagcttgg |
| HoxB2 ileri | tttagccgttcgcttagagg |
| HoxB2 ters | cggatagctggagacaggag |
| HoxA4 ileri | ttcagcaaaatgccctctct |
| HoxA4 ters | taggccagctccacagttct |
| HoxB4 ileri | acacccgctaacaaatgagg |
| HoxB4 ters | gcacgaaagatgagggagag |
| HoxB6 ileri | gaactgaggagcggactcac |
| HoxB6 ters | ctgggatcagggagtcttca |
| ileri 18s | ttccttggaccggcgcaag |
| 18s ters | gccgcatcgccggtcgg |
Tablo 2: Astar ve gen ifade profil için astar serileri.
Discussion
Beyin organoids ilgili tür arka plan ve karmaşık 3D düzenleme hücre doku bağlamda sağladıkları gibi insan beyni geliştirme vitro eğitim için güçlü bir araç temsil eder. Bunun üzerine, onlar insan hayvan modelleri ve indirgemeci insan iki boyutlu monolayer hücre kültürü teknikleri arasında köprü. Onların uygulamaları ancak, tekrarlanabilirlik9eksikliği tarafından engel vardır. Biz büyük örnek örnek değişkenlik IPSC kendiliğinden organize kapasitesini faktörler desenlendirme için onların amenability birleştirerek üstesinden gelir bir ön-tipi organoid Protokolü geliştirdik. Özellikle, iPSCs kendi kendine organizasyon teşvik etmek ve daha sonra TGF-β/SMAD kültürler bir BMP (LDN-193189) için teşhir ederek dorsal korteks farklılaşma tanıtmak sinyal inhibe toplanan ve TGF-β reseptör inhibitörü (A83-01) tip ı. Ayrıca, Wnt yolu (IWR) posteriorization önlemek için inhibe bir bileşik uygulandı. 'İç' beyin organoid protokolleri19aksine, hangi temel kendinden montajlı oldukça heterojen beyin organoids sebebiyet veren ve büyük toplu iş iş varyasyonları sergilenmesi dış denetim (verimliliği tarafından ölçülen polarize Sinirsel ektoderm oluşumu15), burada tekrarlanarak açıklanan protokol homojen ön özel organoids insan iPSCs oluşturur.
Bu ön-tipi organoids nörogelişimsel çalışmaları, gen işlevi çalışmaları, evrimsel çalışmaları gibi uygulamaları çeşitli kullanılabilir hastalığı modelleme ve büyük olasılıkla, uyuşturucu test ve tedavi amaçlı. Protokol ise en erken insan kortikal gelişim yönlerini incelemek uygun. Örneğin vRGC davranış insan özgü yönlerini incelemek için ön-tipi organoids kullandık. Daha ayrıntılı olarak, lissencephaly, insan bir kortikal malformasyon kortikal katlama, çevre bir devamsızlık tarafından karakterize şiddetli bir formla ilişkili patofizyolojik değişiklikler ele. Fare beyni, doğal olarak lissencephalic olduğu gibi bu hastalık sadece bazı yönlerini farelerde modellenebilir. Organoid sistemi lissencephaly iPSCs için hasta kaynaklı uygularken, biz güvenilir hastalık insan özgü yönlerini özetlemek ve temel mekanizmaları belirlemek. Daha ayrıntılı olarak, hasta kaynaklı organoids asimetrik hücre bölünmesi için vRGCs simetrik bir anahtarla neden boyutunda önemli bir azalma göstermek göstermek olabilir. Bu anahtarı vRGCs Mikrotubul ağ, VZ niş mimarisini bozulma kuruluştaki değişiklikler ile ilişkili ve N-cadherin/β-catenin Engelli an harekete geçirmek için önde gelen hücre adezyon moleküllerinin ifade değişmiş Eksen10işaret. Not: vRGC bölümü modları Yönetmeliği β catenin bağımlı insan özgü β-catenin farelerde overexpression teğet korteks genişleme yol açar gibi ve daha sonra kortikal20katlanır olmak sürüldü. Böylece, bizim veri ön-tipi organoid sistemi ölçülebilir bir şekilde erken kortikal gelişim vitroinsan özgü yönlerini incelemek için umut verici bir araç temsil eden vurgulayın.
Polimerlerin organoids daha olgun nöronal fenotipleri ulaşmak için uzun süreler korumak için gelecek için büyük bir sorun olduğunu. Bu aşağıdakilerden birini veya birkaçını tarafından fark: bir biyoreaktör sistemi14organoids kültür, yüzen uygulama farklılaşma orta sinir büyüme veya nöronal hayatta kalma faktörler ile ilave15, iskele. Son olarak, beyin karmaşıklık kontrollü bir artış farklı bölgesel kimlik21,22serebral organoids ile ön-tipi organoids füzyon tarafından elde.
Birlikte ele alındığında, burada sunulan ön-tipi organoid Protokolü erken kortikal yapılar içinde vitroüretimi için kolayca uygulanabilir ve güvenilir bir aracı sunuyor. Son derece homojen erken kortikal dokusu ile birden çok IPSC hattında yükselişi ve güvenilir bir şekilde bireysel özel kortikal doku oluşturmak için kullanılması gereken Protokolü verir. Böylece, sistem özellikle yüksek seviyede homojenliği ve tekrarlanabilirlik gibi hastalık modelleme gerektiren uygulamalar için uygundur.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Çalışma Bakanlığı yenilik bilim ve araştırma Kuzey Ren-Vestfalya (Junior araştırma grubu) ve dönem NET NÖRON, JTC 2015 nörogelişimsel bozukluklar, kök-MCD tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
| Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
| Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
| Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
| Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
| D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
| DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
| Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
| Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
| Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
| IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
| L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
| Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
| Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
| Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
| Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
| Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
| Antibodies | |||
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
| Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
| Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
| Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
| N-cadherin | BD | 610921 | |
| ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
| P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
| Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
| Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
| Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |
References
- Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size. Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Iefremova, V., et al. An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome. Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. , (2017).
- Yamaguchi, T., et al. Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis. J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).
- Heidebrecht, H. J., et al. p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood. 90 (1), 226-233 (1997).
- Kosodo, Y., et al. Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain. EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Chenn, A., Walsh, C. A. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. , (2017).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
