Summary
環境有害物質への暴露鋭く、長期的な効果との開発に影響を与えます。詳しいプロトコルは早期萌芽期ビスフェノール A 曝露の影響を検討するため効果的な lab モデルを使用した戦略を説明するために提供されます。多産と私たちの毒性物質の暴露のバイオ試金の有効性を監視するための行動のアッセイを提供します。
Abstract
ビスフェノール類、ビスフェノール A (BPA) など、ビスフェノール S (BPS) は、プラスチックおよび多数の日常使用製品の生産で広く使用されるエージェントを重合します。その化学構造とエストラジ オールのような生物学的性質に基づいて、彼らは内分泌撹乱物質 (EDC) として分類されています。内分泌かく乱化学物質、低用量で長期曝露は、初期の発育期間中に示される大きな脆弱性と癌、行動障害、不妊を含む様々 な健康の欠陥にリンクされています。遺伝的に解き得る線虫モデル線虫の細胞・分子の研究は、BPA への暴露は、アポトーシスを引き起こす、胚性致死性と DNA の破壊を修復メカニズムを実証しています。については異なるビスフェノール類減少の多産の低用量にc. の elegans胚の露出を報告しました。また、我々 は開発の非常に早い段階での露出の効果と慣れ現象、連合学習のフォームを定量化することで大人になって永続化を示しています。ここでは、低用量内分泌かく乱化学物質と同様に関連付けられている多産と前方に萌芽期の露出のための詳しいプロトコル タッチ代表結果とともに、慣れの試金を提供します。
Introduction
環境有害物質への暴露は特に、その開発を妨害する傾向があり、近年の科学的な精査の下でされている化合物します。日常の使用で 1000 人以上の化学物質は、内分泌かく乱化合物 (EDC)1として分類されます。急速な成長と開発、萌芽期、乳児と小児期の期間は、低用量でも EDC に有害な影響を特に受けるを指摘されています。その効果は引き起こす生殖および発達障害2に示されています。米国環境保護庁と米国国家毒性プログラムのパネル ガイドラインあたり低用量は、観察可能な生物学的変化を引き起こす損害3と報告されている 1 つのレベルの下の線量として定義されるかもしれません。個々 の内分泌かく乱化学物質の低用量作用、ほか低濃度環境では、さまざまな内分泌かく乱化学物質の混合物に実質的な累積効果4可能性があります。
ビスフェノール A (BPA や 4,4'-(propane-2,2-diyl)) は水のボトル、店の領収書、シーラント、飲料のライニングなど一般的に使用されるアイテムは、重合剤、食品缶5。17 β エストラジ オール (E2) その構造的類似性と ERα と ERβ のエストロゲン受容体への親和性、BPA は、内分泌かく乱化学物質 (EDC)5,6として分類されています。弱く、両性の生殖システムに影響を与えるし、安全7,8と見なされている用量で神経機能を混乱させるエストロゲンの受容器に BPA の親和性を示されています。9BPA に暴露したマウスに長期的な神経障害を引き起こす epigenetically 規制メカニズムを介して DNA メチル化の変化を観測されています。具体的には、BPA はまた慢性曝露後マウス大脳辺縁系の脳における D1 ドパミン受容体に見られる増加薬に感度の向上、注意欠損多動性の増加率の可能な原因として関与しています。9,10. 内分泌かく乱化学物質の人の健康に有害な影響の重要な証拠は個体群でも低用量5; 環境有害物質の慢性露出を中心に相関研究に基づいてただし、根拠のない誇大広告11,12の批判に対応しながら人間の研究からの推論、実験的コントロールの操作の制限を受け入れられています。
そのステロイド ホルモン受容体の遺伝子、研究者が機能および作用機構に及ぼす内分泌かく乱化学物質を解明するこの遺伝的扱いやすい lab モデルを利用したに関して哺乳類の線虫の遺伝子の保全のためなど13線虫を用いた実験は BPA や BPS などこれらの化合物のアポトーシス、胚性致死、混乱を二本鎖 DNA 休憩修復機構と神経機能14,15 がこと示されている。 ,16。
私たちの研究室以前初期胚発生に限定も低線量の露出が存続大人15行動の赤字と下げられた多産をもたらすことを示しました。繰り返し刺激慣れ線虫 c. エレガンスを含むモデル システムでは連合学習の形態であり、私たちの方法論に萌芽期の露出の長期効果を測定する行動の出力として連合学習のこのフォームを使用して、17有害物質 BPA 暴露における線虫 c. エレガンスに描かれている全体的な回路図を含む胚性致死でその即効性と大人の行動の長期的な影響を研究するため詳細なプロトコルを提供私たち具体的には、図 1。産卵および連合学習の試金から代表的な結果は、我々 の方法論の有効性を強調するため提供されます。
Protocol
以下のプロトコルは、初期胚発生に伴う BPA 暴露の効果をテストするのには標準化されているし、BPS、BPF や他の内分泌かく乱化学物質とc. の elegans胚毒性物質との使用のため変更可能性があります。
1. 素材のセットアップ
- 塩化ナトリウム 1.5 g、ペプトン、1.25 g、8.5 g を 500 mL の水で寒天を溶解して線虫成長メディア (NGM)18メディアの 500 mL を準備します。オートクレーブ滅菌 (121 ° C、15 PSI、20 分) 後、追加のコレステロール (5 mg/mL のエタノール)、0.5 mL 1 M MgSO4、1 M CaCl2と 1 M カリウム リン酸バッファー、pH 7.4 (108.3 g KH2PO4 12.5 mL 0.5 mL の 0.5 mL、K2HPO4、水 1 L に 35.6 g)。
- 1 N 島の 25 mL、漂白剤、4 mL と水の 71 mL を混合することによって、次亜塩素酸を準備します。このソリューションを新しくします。
- KH2PO4の 3 g、6 g の Na2HPO4、塩化ナトリウム 5 g、MgSO4と 1 l の水の 1 M の 5 mL を混合することによって M9 バッファーを準備します。
- 129 0.02 M K2HPO4mL、KH2PO4, 871 mL、塩化ナトリウム 5.85 g を混ぜて18 S バッファーを準備します。
- M9 と S バッファーをオートクレーブで滅菌します。
- 大腸菌 (OP 50 株) 20 mL ルリア スープ (LB) の夜通し文化を育てます。
- 1 mM の原液 10% エタノールで BPA を解散します。S バッファーで 0.1 μ M、0.5 μ M、1 μ M、5 μ M、10 μ M の後続の希釈液を作る。
注: S 緩衝水溶液の希釈は大幅エタノールの濃度を低減します。たとえば、このプロトコル (10 μ M) に記載されている最高の BPA 濃度でエタノールの濃度は 0.1 %v/v。
2線虫養殖と同期。
- 100 mm の版 (約 25 mL/プレート) に NGM メディアを注ぐし、固めることができます。凝固させる為、一度一晩成長液体培養からエシェリヒア属大腸菌OP50 の 150 μ L を広めることでプレートをシードします。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
- 次の日は、1 cm 角のおおよそのスラブをチャンキングによる新しいプレートに N2 ワームを転送します。目に見える胚を含む栄養の十分な成熟した大人とプレートが作成されるまで、20 ° C で 3 日間の成長するワームを許可します。
- 同期、プレート間に 5 mL の M9 バッファーをピペッティングにより各プレートを洗います。滅菌 15 mL の円錐形遠心チューブに液体を転送します。
注: 同期は大人のワームを殺すし、比較的同じ段階である胚を収集することです。 - 成虫の餌の緩やかなを取得するために室温で 4 分間 3,000 × g で遠心分離機します。
- 10 mL のピペットを使用すると、ペレットをそのまま残すために上澄みを慎重に取り外します。次亜塩素酸溶液 5 mL を加え、軽く混ぜます。
- 3,000 x g常温で 4 分間遠心します。
- 10 mL のピペットで上澄みを削除し、7 mL の M9 バッファーで洗浄します。この手順を 2 回繰り返します。
3. BPA にワームを公開します。
- 上記のステップ 2.7 から最後の洗浄後 M9 バッファーと卵の約 100 μ L を中断します。既に S バッファーで希釈した BPA の適切な濃度を含む 2 mL の microfuge の管に卵の約 50 μ L を転送します。チューブあたり BPA (0.0 μ M、0.1 μ M、0.5 μ M、1.0 μ M、5.0 μ M と 10 μ M) の正しい最終濃度を確保する S バッファーの量を調整します。表 1 は、これらの希釈液を作る方法の 1 つを示しています。
| 最終の BPA 濃度 | BPA をストック (100 μ M) | S バッファー | 同期のワーム |
| 0.1 Μ M | 1 Μ L | 949 Μ L | 50 Μ L |
| 0.5 Μ M | 5 Μ L | 945 Μ L | 50 Μ L |
| 1 Μ M | 10 Μ L | 940 Μ L | 50 Μ L |
| 5 Μ M | 50 Μ L | 900 Μ L | 50 Μ L |
| 10 Μ M | 100 Μ L | 850 Μ L | 50 Μ L |
表 1: 株式 BPA、S バッファーと我々 の研究に使用される必要な濃度を達成するために使用される同期のワーム。
- シェーカーにチューブを置き、軽く振るシェーカー 25 rpm またはロッキング シェーカー傾斜 25/分で、20 ° C で 4 時間。
- 4 h 後チューブ ホルダーに管を配置し、解決するワームを許可します。
- 上澄みを廃棄し、ワームをシード プレート (エシェリヒア属大腸菌OP50 NGM 板) に転送します。1.5 で述べたように液体のエシェリヒア属大腸菌OP50 文化で 2.1 で述べたようにプレートをシードします。
- 20 ° C で 60 h の成長ワームを聞かせてください。汚染の毎日のプレートを確認します。汚染された NGM プレートは通常変色し、個々 のコロニーを伴います。過密の顕微鏡下でワームをチェックします。エシェリヒア属大腸菌OP50 芝生と小さなスポットで集中してワームの欠如を意味する過密。
4. 前方タッチ慣れアッセイ
- 新しいシードされていない NGM プレート火災滅菌 30 G プラチナ ワイヤを使用して大人のワームを選ぶ約 10 同期の若者を転送します。ワームのままにそれらを許可するように 5 分間妨げられていない新しいプレートに順応する時間。
- 慣れ応答木製の串やつまようじの端に付す眉毛を使用し、70% エタノールに浸漬して消毒します。きれいな糸くずティッシュで拭くし、エタノールを蒸発させ 1 分待ちます。頭 (咽頭の球根の前方) にワームをそっと触れる眉の毛を使用しています。10 を許可するタッチを繰り返して回復するワームを許可するために接触の間に s。
- ワームはもはや後方移動するまで (10 秒刺激間隔を許可) をタッチし続けます。この時点で、ワームには刺激に慣れます。慣らすにワームに必要なタッチの数を記録します。
- 平均慣れテューキー事後テストが続く一方通行 ANOVA を使用して処理と未処理のコントロール率の違いを分析します。
5. ワームの多産の試金
- 個々 の L3 ワームをプラチナのピックを使用して新鮮でシード プレートに転送します。その 1 つだけのワームはプレートごとに配置されていることを確認します。
注: 後 L3 幼虫ワームは L4 幼虫期と成人期に発展します。早くそれらを拾っては、カウントでは見逃されることを卵を既にレイアウトしていない彼らを確保しながら、個々 の動物の転送のために十分に大きいという点で便利です。 - すべての 12-24 h の卵数をカウントします。カウント後に新しいプレートに親虫を転送します。ワームは、通常 5 日後、産卵を停止を繰り返して、20 ° C で培養したとき
注: 平均すると、野生型ワームことができます最大 300 の卵を産むしたがって、毎日新しいプレートに親を転送するを防ぐ過密。 - テューキー事後テストが続く一方通行 ANOVA を使用して処理と未処理のコントロールにより産卵数の平均の違いを分析します。
Representative Results
線虫での以前の研究は、胚の発育と成人期を通じて高い BPA の集中 (≥ 1 ミリメートル) への継続的な暴露が産卵数14を低下させることを報告しています。当研究室の報告以降の研究は、大人15 (図 2) として実行可能な卵の数の減少を示した彼らの開発の初期段階で 4 時間の限られた期間の BPA にさらされている胎児を置いたことを示しています。方法論の 2 つの主要機能は、(i) 使用の BPA 濃度も有意 (10 μ M の範囲を 0.1 μ M) を下げるし、(ii) の露出は早い萌芽期の期間に限られていた.低用量でも減少多産のほか私たちの慣れの試金は BPA に暴露される胚は、ワームに比べて慣れになってより多くの刺激を必要に応じてワームが車両だけで15 (図 3) にさらされることを明らかにしました。これらの効果は、低用量 BPA 暴露、次の神経機能形態学的に明らかにすることができない微妙な効果が行動の変化を識別する可能性があることの理論的根拠に基づいているという点で注目に値する。一言で言えば、代表的な結果を提示したここアンダー スコア胚への BPA 暴露の有害な影響にc. の elegansの大人の行動実験によって評価することができます神経の機能を含む、その開発が影響します。ここで提供するプロトコルは、内分泌の破壊的な化合物を含む他の潜在的な毒性の低用量および長期的なのと同様の効果をテストするため使用できます。
図 1: 実験的なデザインの概略図。成熟したワームは、収集され、同期された胚を収集するために、次亜塩素酸にさらされています。胚は、4 h の BPA 濃度の異なるにさらされたし。露出胚に移ったシード NGM プレートの上には、20 ° C で 60 h に成長することができた開発の初期段階中に露出の有効性をテストするために L4 ワームは個々 のプレートに移され、多産のためにテストし、前方タッチ慣れ若い大人を調べた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BPA が下降する多産します。1 μ M および BPA の高い濃度への露出 (水平方向の行によって表されるコントロールに比べて産卵数が減少n = 10、*p < 0.05)。誤差範囲を示す分散分析, テューキー事後テストを使用して行わ SEM. 分析。この図は、Mersha et al., 201515から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 萌芽期ビスフェノール A 曝露の長期的影響は、大人の行動に反映されます。BPA 濃度 0.1 μ M に影響を与える大人で非連想前方タッチ慣れとして低にさらされる胚 (n = 60、*p < 0.05)。誤差範囲を示す SEM;分散分析, テューキー事後テスト。この図は、Mersha et al., 201515から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
急速な成長の胚など開発フェーズは、BPA を含む様々 な内分泌撹乱物質の有害な影響を特に受けやすい。我々 は BPA や胚の生存率 (図 2) に及ぼす影響を評価するために濃度の範囲の便利な滴定により線虫無脊椎動物モデルで他の有害物質への暴露の影響を調べるため詳細なプロトコルを提供します。.フォロー アップ行動実験胚から開発された露出低用量 BPA のこと神経機能 (図 3) の長期的な影響を試金大人を存続します。線虫モデルの初期胚発生期間中に様々 な有害物質に胚を公開するための詳しいプロトコルを提供するためには、本稿の中心的な考え方(20 ° C) で、11.5 時間萌芽期の開発の期間の最初の 4 h ウィンドウは器官形成が続いている増殖期に対応します。この終わりに向かって産卵および連合学習の試金によって端点の検証を実施しています。BPA 及び他のビスフェノール類の行動のメカニズムの基礎はこの分野の研究を目的とした方向の聖杯が、我々 しないこの方法論の焦点を当てた記事で BPA のアクションの機械論的説明を提供しようとしました。ただし、線虫モデルがさらに作用のメカニズムを解剖する理想的なシステムを提供することを指摘したいと思います。たとえば、今後の作業での BPA の作用メカニズムを解読するのに線虫変異体は生成することができますと BPA の効果への抵抗の上映し、こうして経路を解読するための道を開きます。さらに、私たちの仲間の紙は脊椎動物、毒性物質の影響19の潜在的なメカニズムの調査のための基礎を理解する別の道を提供するニューラル ネットワーク同期レベルの BPA の影響を扱っています。
余分なを実行する必要があります重要な手順のいくつか本稿で詳細な方法論、慎重に次のとおりです: 成熟した卵を解剖顕微鏡の下で目に見えると大人は非常に重要ですよく供給の線虫のプレートを選択してこの手順に従わないと、EDC 曝露実験のための胚の不十分なサンプル サイズになります。また、次亜塩素酸のソリューションは新鮮初期胚発生中に BPA 露出を実行する能力を妨げる、非同期の人口を得ることを避けるために作られているかどうかを確認することが重要です。(次亜塩素酸の露出) の後 M9 とペレットの洗浄も非常に重要なステップです。適切に行われない死胚で高濃度の漂白剤の可能性があります。また、4 h 後シード NGM プレートに胚を転送する必要があります。長期間の BPA ソリューションは、胚は長寿命期間直幼虫へと発展する可能性が高いです。これが著しく多産アッセイと行動実験干渉します。これらの手順のいずれかを逃したが場合、非常に最初から手順を開始することをお勧めします。何らかの理由でワームに NGM プレート、汚染されているまたは十分な食料がない、それはそれにより収集されたデータを傾斜ワームにストレスを追加します。このようなプレートは、破棄する必要があり、実験では使用しないで。
以前は、顕著な研究は、BPA14生殖細胞の DNA 修復機構の故障に起因による染色体異常を示す線虫モデルを使用するしました。ただし、上記の研究デザインがその寿命全体で BPA の高用量に c. のelegansの連続の BPA 暴露を使用していたことは注目に値するです。我々 の方法論は、初期胚、胚の生存率に及ぼす影響と、生存者の微妙な長期的な影響を分析するために低用量の BPA 暴露を研究に設計されました。我々 の知識に方法論が開発され非常に低用量 BPA の指定した期間に限定する初期段階の胚を公開するにはしたがって、メソッドは、ここで小説で紹介。
また、プロトコルを提供ここで胚の増殖段階で他の内分泌かく乱化学物質の効果を研究に容易に適応することができます。しかし、後期胚を研究するためにプロトコルは、フォーカスの下で開発の重要な期間に主要な修正が要求されます。それが耐性がある 2 番目の脱皮のサイクルで寿命の長い期間直逮捕に終って代替開発経路の可能性を開くとさらに、我々 のプロトコルは毒性物質への露出のより長い時間を必要とする実験に適してできません。過酷な条件の20。それ以上の修正と改良が必要を通して毒性物質または EDCなどを代謝する可能性がない食料源との補足のより長い露光時間のオートクレーブ大腸菌。結論として、私たちの方法論を活用して、無脊椎動物モデル系の様々 なホルモン多産と神経機能の化学物質の影響を評価すること線虫。
Disclosures
著者は、開示するものがあることを宣言します。
Acknowledgments
NSF (EPSCoR EPS 0814251) によってサポートし、NIH (1P20GM103653 01A1) 時価と HSD、MDM (タイトル III HBGI) と KRS (NIH INBRE) にデラウェア州州立大学機関学生のサポートには感謝して承諾します。線虫の野生型 N2 ひずみのc. の elegans遺伝子センター (研究基盤プログラム P40 OD010110 の NIH のオフィスでサポートされている) のおかげで。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
| Peptone | Fisher | S25761B | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
| K2HPO4 | Fisher | 7758-11--4 | |
| KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
| LB | Fisher | BP1426-500 | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
| Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |
References
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