Summary
Agudo, exposición a tóxicos ambientales puede afectar desarrollo con efectos a largo plazo. Protocolos detallados se proporcionan para ilustrar una estrategia utilizando un modelo eficaz de laboratorio para estudiar el efecto de la exposición embrionaria temprana a bisfenol A. Ofrecemos Análisis de comportamiento para monitorear la efectividad de nuestros bio-ensayos de exposición de sustancias tóxicas y fecundidad.
Abstract
Bisfenoles, como el Bisfenol A (BPA) y bisfenol S (BPS) polimerización a agentes ampliamente utilizados en la producción de plásticos y numerosos productos de uso cotidiano. En su estructura química y propiedades biológicas estradiol-como base, han sido clasificados como endocrino interrumpir compuestos (EDC). La exposición prolongada a interruptores endocrinos, incluso en dosis bajas, se ha relacionado con varios defectos de salud, incluyendo cáncer, trastornos conductuales e infertilidad, con mayor vulnerabilidad indicado durante períodos tempranos del desarrollo. Estudios celulares y moleculares con el modelo genéticamente manejable de nematodo elegans de Caenorhabditis han demostrado que la exposición al BPA provoca apoptosis, mortalidad embrionaria y alteración en el ADN mecanismos de reparación. Hemos divulgado previamente que la exposición de embriones de C. elegans a dosis bajas de bisfenoles diferentes disminuye fecundidad. Además, hemos demostrado que los efectos de la exposición durante las primeras etapas del desarrollo persisten en la edad adulta como ensayaron por cuantificar el comportamiento de la habituación, una forma de aprendizaje asociativo. Aquí, le ofrecemos protocolos detallados para la exposición embrionaria a EDCs dosis bajas así como de la fecundidad asociada y anterior toquen ensayos de habituación, junto con resultados representativos.
Introduction
Exposición a tóxicos ambientales, particularmente compuestos aquellos que tienden a interferir con el desarrollo, ha estado bajo escrutinio científico cuidadoso en los últimos años. Más de 1 mil productos químicos de uso diario se clasifican en endocrinas interrumpir compuestos (EDC)1. Periodos de rápido crecimiento y desarrollo, que incluyen el embrionario, infantil y etapas de la infancia, se han observado para ser particularmente vulnerables a los efectos nocivos a dosis incluso bajas EDC. Han demostrado su efecto a causa de trastornos reproductivos y del desarrollo neurológico2. Por las directrices de panel nos Agencia de protección ambiental y el programa nacional de Toxicología de Estados Unidos, una dosis baja puede definirse como cualquier dosis por debajo del nivel de uno que se ha divulgado para causar un cambio biológico observable o daño3. Además de efectos de dosis bajas de los EDCs, mezclas de varias EDCs encontradas bajas concentraciones en el medio ambiente tienen el potencial para causar efectos acumulativos sustantivas4.
Bisphenol A (BPA o 4,4'-(propane-2,2-diyl)) es un agente de polimerización en artículos comúnmente usados tales como botellas de agua, recibos de almacén, selladores dentales y las guarniciones de bebidas y latas de alimentos5. Debido a su similitud estructural con el Estradiol 17-β (E2) y su afinidad a los receptores de estrógenos ERα y ERβ, el BPA ha sido clasificada como un endocrino interrumpir química (EDC)5,6. Aunque más débil, afinidad de BPA a los receptores de estrógenos se ha demostrado para afectar el sistema de reproducción de ambos sexos y alterar funciones neuronales en las dosis que se consideran seguros7,8. Se han observado cambios en la metilación del ADN a través de mecanismos epigenéticamente regulados para causar defectos neuronales a largo plazo en ratones expuestos a BPA9. Específicamente, el BPA también se ha implicado como un posible culpable de aumento de las tasas de hiperactividad, deficiencia de atención y aumento de la sensibilidad a los medicamentos debido a un aumento observado en los receptores de dopamina D1 en el forebrain limbic del ratón después de la exposición crónica 9 , 10. evidencia significativa sobre los efectos deletéreos de los interruptores endocrinos en la salud humana se basa en estudios de correlación, centrándose principalmente en la exposición crónica de la población a sustancias tóxicas ambientales incluso en dosis bajas5; sin embargo, limitaciones en deducciones de estudios en humanos y en la manipulación de controles experimentales han sido aceptados al abordar las críticas de exageraciones sin fundamento11,12.
Debido a la conservación de genes de Caenorhabditis elegans con respecto a los mamíferos, incluyendo sus genes del receptor de la hormona esteroide, los investigadores han utilizado este modelo de laboratorio genéticamente manejable para desentrañar los efectos funcionales y mecánicos de EDCs 13. experimentos con C. elegans han demostrado que estos compuestos como BPA y BPS pueden causar apoptosis, mortalidad embrionaria, alteración en los mecanismos de reparación de rotura de ADN de doble hebra y función neural14,15 ,16.
Nuestro laboratorio ya ha demostrado que incluso dosis bajas de exposición limitada a embriogénesis temprana conduce a baja fecundidad con déficits conductuales en los sobrevivientes adultos15. Habituación a un estímulo repetido es una forma de aprendizaje asociativo en sistemas modelo, como C. elegans, y nuestra metodología utiliza esta forma de aprendizaje asociativo como una salida de comportamiento para analizar los efectos a largo plazo de la exposición embrionaria a las sustancias tóxicas17 específicamente, proporcionamos protocolos detallados para estudiar la exposición al BPA en C. elegans, incluyendo sus efectos inmediatos sobre la mortalidad embrionaria y efectos a largo plazo en el comportamiento del adulto, con un esquema general en Figura 1. Resultados representativos de fecundidad y de ensayos de aprendizaje no asociativo se proporcionan para destacar la eficacia de nuestra metodología.
Protocol
Protocolos que se indican a continuación han sido estandarizados para probar los efectos de la exposición BPA durante la embriogénesis temprana y pueden ser modificados para su uso con BPS, BPF o interruptores endocrinos y tóxicos en C. elegans embriones.
1. material instalación
- Disolver 1,5 g de NaCl, 1.25 g de peptona y 8,5 g de agar en el agua a 500 mL para preparar 500 mL de medio de18 medios de crecimiento de nematodos (NGM). Después de la esterilización en autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 minutos), Añadir 0.5 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol), 0,5 mL de 1 M MgSO4, 0,5 mL de 1 M de CaCl2 y 12,5 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4 35,6 g de K2HPO4, agua 1 L).
- Preparar solución de hipoclorito al mezclar 25 mL de 1 KOH de N, 4 mL de lejía y 71 mL de agua. Hacen de esta solución fresca.
- Preparación de Buffer M9 mezclando 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 5 mL de 1 M de MgSO4y el agua a 1 L.
- Preparar el tampón S18 mezclando 129 mL de 0,02 M K2HPO4, 871 mL de KH2PO4y 5,85 g de NaCl.
- Esterilice en autoclave los buffers M9 y S.
- Cultivar una cultura noche de Escherichia coli (cepa 50 OP) en 20 mL de caldo Luria (LB).
- BPA se disuelven en etanol al 10% para hacer una solución stock de 1 mM. Hacer diluciones subsecuentes de 0.1 μm, 0,5 μm, 1 μm, 5 μm y 10 μm en tampón de S.
Nota: Dilución en el búfer de S acuoso reduce la concentración de etanol; por ejemplo, en la mayor concentración de BPA que se describe en este protocolo (10 μm), la concentración de etanol es 0,1% v/v.
2. cultivo de C. elegans y sincronización
- Vierta los medios NGM en placas de 100 mm (aproximadamente 25 mL/placa) y deje que se solidifique. Una vez solidificado, semilla las placas separando 150 μL de e. coli OP50 del cultivo líquido crecido durante la noche. Incube las placas a 37 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, traslado gusanos de N2 en las nuevas placas en trozos una losa aproximada de cuadrado de 1 cm. Permiten gusanos crecer durante 3 días a 20 ° C hasta que la placa está poblada con adultos maduros bien alimentados que contienen embriones visibles.
- Para sincronizar, lave cada placa mediante pipeteo hasta 5 mL de buffer M9 en la placa. Transferir el líquido a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL estéril.
Nota: La sincronización se realiza para matar a gusanos adultos y recoger embriones que son relativamente el mismo escenario. - Centrifugar a 3.000 x g durante 4 min a temperatura ambiente para obtener un pellet suelto de gusanos adultos.
- Con una pipeta de 10 mL, retire con cuidado el sobrenadante para dejar intacta la pelotilla. Añadir 5 mL de la solución de hipoclorito y mezclar suavemente.
- Centrifugar a 3.000 x g a temperatura ambiente durante 4 minutos.
- Retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mL y lavar con 7 mL de buffer M9. Repita este paso dos veces.
3. exponer los gusanos a BPA
- Después del último lavado de paso 2.7 anterior, suspender cerca de 100 μl de huevos con buffer M9. Transferir aproximadamente 50 μl de los huevos a los tubos del microfuge 2 mL ya que contienen la concentración adecuada que BPA diluido en tampón de S. Ajustar la cantidad de S-buffer para asegurar la correcta concentración final de BPA (μm 0.0, 0.1 μm, 0,5 μm, 1.0 μm, 5.0 μm y 10 μm) por el tubo. Tabla 1 ilustra una forma de hacer las diluciones.
| Para la concentración de BPA Final | Acción BPA (100 μM) | S Buffer | Gusanos de sincronizada |
| 0,1 ΜM | 1 ΜL | 949 ΜL | 50 ΜL |
| 0,5 ΜM | 5 ΜL | 945 ΜL | 50 ΜL |
| 1 ΜM | 10 ΜL | 940 ΜL | 50 ΜL |
| 5 ΜM | 50 ΜL | 900 ΜL | 50 ΜL |
| 10 ΜM | 100 ΜL | 850 ΜL | 50 ΜL |
Tabla 1: Acción BPA, S buffer y sincronizados gusanos utilizados para alcanzar las concentraciones deseadas utilizadas para nuestro estudio.
- Colocar tubos en una coctelera y agite suavemente durante 4 horas a 20° C, a 25 rpm para un agitador rotatorio o inclinaciones 25/min para un agitador oscilante.
- Después de 4 h, colocar tubos en los titulares de tubo y gusanos resolver.
- Deseche el sobrenadante y transferir gusanos a placas (NGM con OP50 e. coli). Hacer el cultivo líquido OP50 e. coli según lo indicado en 1.5 y las placas de la semilla como se indica en 2.1.
- Dejar las gusanos crecer durante 60 horas en 20 ° C. Examinar las placas de todos los días de contaminación. Contaminados planchas NGM son generalmente descoloridas y acompañados de colonias individuales. Ver gusanos bajo el microscopio para masificación. La falta de césped OP50 e. coli y gusanos concentrados en pequeñas manchas significa hacinamiento.
4. anterior toque habituación ensayo
- Transferir a aproximadamente 10 jóvenes sincronizados recoger gusanos adultos a nuevas placas NGM no sembradas usando un alambre de platino 30 G esterilizados por fuego. Deje reposar durante 5 minutos permitir que los gusanos de tiempo para aclimatarse a la nueva placa.
- La respuesta de habituación, utilice un pelo de ceja atado al extremo de un pincho de madera o palillo de dientes y esterilización por inmersión en etanol al 70%. Limpie con un paño limpio libre de pelusas y esperar 1 minuto para el etanol se evapore apagado. Toque suavemente el gusano en la cabeza (parte anterior del bulbo faríngeo) con el pelo de la ceja. Repita los toques, permitiendo 10 s entre toques para permitir que el gusano recuperar.
- Continuar al tacto (permitiendo intervalos interstimulus de 10 s) hasta que el gusano ya no se mueve hacia atrás. En este punto, el gusano ha habituado al estímulo. Anotar el número de toques para el gusano a habituarse.
- Analizar la diferencia entre las tasas medias de habituación de los controles tratados y no tratados con ANOVA unidireccional seguida de post-hoc de Tukey.
5. gusano fecundidad ensayo
- Traslado individual L3 gusanos a un plato fresco y semillas usando una selección platino. Asegúrese de que sólo un gusano esté colocada por placa.
Nota: después de la etapa larval L3, gusanos se convierten en larvas L4 y la edad adulta. Recolección temprana es conveniente en que son lo suficientemente grandes como para el traslado de los individuos asegurando que han no ya pusieron los huevos que de lo contrario sería faltados en la cuenta. - Contar el número de huevos puestos cada 12 – 24 h. Después de contar, transferir el gusano de los padres a una nueva placa. Repita hasta que el gusano deja de poner huevos, por lo general después de 5 días cuando se incubaron a 20 ° C.
Nota: en promedio, un gusano de tipo salvaje puede poner hasta 300 huevos; por lo tanto, transferir al padre a una nueva placa diariamente evita el hacinamiento. - Analizar la diferencia entre el número promedio de huevos puestos por los controles tratados y no tratados con ANOVA unidireccional seguida de post-hoc de Tukey.
Representative Results
Estudios anteriores con C. elegans han reportado que la exposición continua a altas concentraciones de BPA (≥1 mM) a lo largo de desarrollo del embrión y la edad adulta disminuye fecundidad14. Estudios posteriores de nuestro laboratorio han demostrado que los embriones que han sido expuestos a BPA durante un período limitado de 4 h en las primeras etapas de su desarrollo demostrada una disminución en el número de huevos viables puso como adultos15 (figura 2). Dos características clave de la metodología eran que (i) las concentraciones de BPA usadas significativamente menor (0.1 μm Rango μm 10) y (ii) la exposición fue limitada al período embrionario temprano. Además de fecundidad disminuida incluso a dosis más bajas, nuestros ensayos de habituación revelaron que gusanos expuestos a BPA como embriones necesarios más estímulos para ser habituado comparado con gusanos exponen al vehículo solo15 (figura 3). Estos efectos son notables en que se basan en la exposición BPA de dosis baja, siguiendo la lógica que efectos más sutiles en la función neuronal que no pueden ser morfológicamente evidente están probable que sean discernibles a través de cambios de comportamiento. En Resumen, los resultados representativos presentan subrayado el hecho de que los efectos perjudiciales de la exposición BPA a un embrión afecta su desarrollo, incluyendo la función neuronal que puede evaluarse mediante ensayos de comportamiento adulto en C. elegans. Protocolos que aquí pueden utilizarse para pruebas de baja dosis y largo plazo efectos de otras sustancias tóxicas potenciales incluyendo compuestos perturbadores endocrinos.
Figura 1: representación esquemática del diseño experimental. Los gusanos maduros fueron recogidos y expuestos a la solución de hipoclorito para la recolección de embriones sincronizados. Los embriones entonces fueron expuestos a diferentes concentraciones de BPA durante 4 horas. Los embriones expuestos fueron transferidos en las placas sembradas de NGM, donde se les permitió crecer de 60 h a 20 ° C. Para probar la eficacia de la exposición durante las primeras etapas de desarrollo, los gusanos de L4 se transfirieron a placas individuales y probados para la fecundidad, y adultos jóvenes fueron probados con tacto anterior habituación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: fecundidad desciende por BPA. Exposición a 1 μm y mayores concentraciones de BPA disminuyó significativamente el número de huevos puestos en comparación con el control (representado por la línea horizontal; n = 10, *p < 0.05). Barras de error denotan SEM. análisis usando ANOVA, prueba post-hoc de Tukey. Esta figura ha sido modificada desde Mersha et al., 201515. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: efectos a largo plazo de la exposición BPA embrionaria se reflejan en el comportamiento adulto. Embriones expuestos a BPA concentraciones tan bajas como 0.1 μm afecta táctil anterior no asociativo habituación en adultos (n = 60, *p < 0.05). Barras de error denotan SEM; ANOVA, prueba post-hoc de Tukey. Esta figura ha sido modificada desde Mersha et al., 201515. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Fases de rápido crecimiento y desarrollo como la embriogénesis son particularmente vulnerables a los efectos perjudiciales de distintos compuestos interrumpiendo endocrinas, incluyendo BPA. Ofrecemos protocolos detallados para estudiar los efectos de exposición a BPA u otras sustancias tóxicas en el modelo de invertebrado C. elegans , que permite la valoración conveniente de una gama de concentraciones a evaluar su efecto sobre la viabilidad del embrión (figura 2) . Seguimiento de experimentos conductuales en sobrevivientes adultos que desarrollan a partir de embriones que fueron expuestos a bajas dosis de BPA permite ensayo a largo plazo efectos sobre la función neuronal (figura 3). La idea central de este trabajo es proporcionar protocolos detallados para la exposición de embriones a varias sustancias tóxicas durante el período de embriogénesis temprana en el modelo de C. elegans ; la primera ventana de 4 h de su período de desarrollo embrionario de 11,5 horas (a 20 ° C) corresponde al período de proliferación, que es seguido por organogénesis. Hacia este fin, se facilita la validación de los puntos finales a través de análisis de aprendizaje no asociativo y fecundidad. Mientras que la base mecanicista de la acción de BPA y otros bisfenoles es el Santo Grial hacia donde se dirige la investigación en este campo, tenemos intento ofrecer una explicación mecanicista de la acción de BPA en este artículo de metodología enfocada. Sin embargo, nos gustaría señalar que la C. elegans es un sistema ideal para diseccionar más el mecanismo de acción. Por ejemplo, en un futuro trabajar en descifrar los mecanismos de acción de BPA, mutantes de C. elegans pueden ser generadas y defienden para la resistencia a los efectos del BPA y así allanan el camino para descifrar el camino. Además, nuestro papel de compañero aborda el efecto del BPA a nivel de sincronía de red neuronal en vertebrados, proporcionando otra vía para entender las bases para investigar mecanismos potenciales para efectos tóxicos19.
En la metodología detallada en este documento, algunos de los pasos críticos que deben ser ejecutaron extra cuidadosamente los siguientes: elegir un plato bien alimentados de C. elegans adultos con huevos maduros visibles debajo del microscopio de disección es crucial, y no seguir este paso dará como resultado un tamaño de muestra suficiente de embriones para el experimento de exposición EDC. También es importante asegurarse de que la solución de hipoclorito se realiza fresca para evitar la obtención de una población no sincronizada que interfiera con la capacidad para llevar a cabo la exposición BPA durante la embriogénesis temprana. Lavado de pellets con M9 (después de la exposición de hipoclorito) también es un paso muy importante. Si no se realiza correctamente, la alta concentración de cloro podría producir embriones muertos. Además, los embriones deben transferirse a sembrados NGM de placas después de 4 h. Si en la solución BPA para un período prolongado de tiempo, los embriones son propensos a desarrollar en las larvas de larga duración dauer. Esto interferirá significativamente con análisis de comportamiento y análisis de la fecundidad. Si olvida cualquiera de estos pasos, es aconsejable iniciar el procedimiento desde el principio. Si por cualquier motivo, la placa NGM con gusanos está contaminada o no tiene suficiente comida, agrega estrés sobre los gusanos de tal modo sesgando los datos recogidos. Tales placas deben ser desechados y no ser utilizados en el experimento.
Previamente, un estudio notable utilizado con éxito el modelo de C. elegans para demostrar que anormalidades del cromosoma causaron por resultado BPA debido a la descomposición de la maquinaria de reparación del ADN en la línea germinal14. Sin embargo, cabe destacar que el diseño del estudio anterior había utilizado continua exposición BPA de C. elegans a altas dosis de BPA durante toda su vida. Nuestra metodología fue diseñada para el estudio de bajas dosis de exposición BPA durante la embriogénesis temprana, con el fin de analizar sus efectos en la viabilidad embrionaria y sutiles efectos a largo plazo en los sobrevivientes. A nuestro conocimiento, no se ha desarrollado ninguna metodología para exponer embriones de etapa temprana a muy baja dosis de BPA durante un periodo especificado de tiempo; por lo tanto, lo que el método había presentado aquí novela.
Además, protocolos proporcionan aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar los efectos de otros interruptores endocrinos durante la fase de proliferación de la embriogénesis. Sin embargo, para estudiar las últimas etapas embrionarias, el protocolo requiere modificaciones claves en la ventana de tiempo crítico de desarrollo bajo enfoque. Además, nuestro protocolo no será adecuado para los experimentos que requieren tiempos más largos de exposición a sustancias tóxicas, como abre la posibilidad de la vía de desarrollo alternativo dando por resultado la detención de larga duración dauer en el segundo ciclo de muda, que es resistente a la a las duras condiciones20. Otras modificaciones y mejoras serán necesario por más tiempo de exposición a través del suplemento con una fuente de alimento que no tiene potencial para metabolizar la sustancia tóxica o por ejemplo EDC esterilizado e. coli. En conclusión, nuestra metodología puede ser utilizada para evaluar los efectos de varios endocrinos interrumpir productos químicos en la fecundidad y en la función neuronal en el sistema modelo de invertebrado C. elegans.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Apoyo por la NSF (EPSCoR EPS-0814251) y NIH (1P20GM103653-01A1) MKT y HSD, apoyo al estudiante institucional de la Universidad Estatal de Delaware a MDM (título III HBGI) y KRS (NIH-INBRE) se agradece. Gracias al centro de genética de C. elegans (apoyado por el Oficina de NIH de investigación infraestructura programas P40 OD010110) para tensión de N2 de tipo salvaje de C. elegans .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
| Peptone | Fisher | S25761B | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
| K2HPO4 | Fisher | 7758-11--4 | |
| KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
| LB | Fisher | BP1426-500 | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
| Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |
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