Summary
Ce protocole décrit un système flexible et peu onéreuse pour mesurer ambulation de souris en un dosage de l’activité de plein champ. Nous montrons qu’un test de marche de 6 minutes basé sur ce système détecte une diminution des mouvements volontaires chez la souris mdx et distingue précisément amélioration à un sauvetage d’un muscle spécifique de ces animaux.
Abstract
Mesurer les résultats fonctionnels dans le traitement de la dystrophie musculaire est un aspect essentiel des essais précliniques. L’évaluation de l’ambulation volontaire dans des modèles murins est un test non invasif et reproductible de l’activité qui est directement analogues aux mesures du patiente ambulation tel que le test de marche de 6 minutes et scores de mobilité. Beaucoup de méthodes communes pour tester la souris ambulation vitesse et la distance sont basées sur le test de plein champ, où la libre circulation de l’animal dans une arène est mesurée au fil du temps. Un inconvénient majeur de cette approche est que les logiciels commerciaux et équipements pour le suivi de mouvement haute résolution est coûteux et peut nécessiter le transfert de souris à des établissements spécialisés pour les tests. Nous décrivons ici un système peu coûteux et axée sur la vidéo pour mesurer ambulation de souris qui utilise des logiciels libres et open source. Utilisant ce protocole, nous démontrons qu’ambulation volontaire dans le modèle de souris mdx de la dystrophine null pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est diminuée par rapport à l’activité souris sauvage. Dans mdx , souris exprimant le transgène utrophine, ces déficits d’activité ne sont pas respectées et la distance totale parcourue est indiscernable de la souris de type sauvage. Cette méthode est efficace pour mesurer les variations ambulation volontaire associé à une pathologie dystrophique et fournit une plate-forme polyvalente qui peut être facilement adaptée aux paramètres de recherche diversifié.
Introduction
Des mesures fiables et reproductibles des fonctions musculaires sont essentiels pour évaluer l’efficacité des thérapies potentielles de DMD. DMD est un trouble génétique causé par des mutations dans le gène de la dystrophine, conduisant à une faiblesse musculaire progressive, perte de déambulation et éventuelle insuffisance cardiorespiratoire. Le modèle animal plus largement utilisé de DMD est la souris mdx de la dystrophine null. Une batterie de tests fonctionnels sont apparus comme des tests de routine pour évaluer la progression de la maladie chez la souris mdx , ainsi que dans des modèles animaux similaires d’autres dystrophies musculaires et myopathies. Couramment utilisés en vivo essais comprennent des mesures de la force de préhension des membres antérieurs, fil pour accrocher des temps, rotarod maximum, temps d’épuisement au cours du suivi d’activité en cours d’exécution et moteur tapis roulant. Il y a eu un effort considérable dans le domaine de normaliser ces tests, dans le but de réduire la variabilité entre les études précliniques et accroître le potentiel translationnel des agents thérapeutiques testés dans la souris1,2.
Un volet important des essais précliniques est la mesure des mouvements volontaires, un paramètre qui est fréquemment altéré dans les modèles murins de la dystrophie musculaire. Ceci est généralement testé par des études basées sur le contrôle de l’activité de plein champ et peut évaluer horizontal (à pied) ou des mouvements verticaux (élevage) sur un parcours de quelques minutes ou heures2,3,4. Un certain nombre d’études ont montré des mouvements volontaires pour être modifiée chez les souris mdx , notamment après l’exercice, et ces mesures ont démontré d’être sensible à la progression de la maladie et de traitement drogue. Une des limites principales dans l’exécution de ces tests est le besoin d’équipement spécialisé et coûteux. Ici, une méthode peu coûteux qui suit ambulation de souris à l’aide des ressources disponibles est présentée.
La distance de marche de 6 minutes est une mesure couramment utilisée comme un outil d’évaluation clinique chez les personnes atteintes de la dystrophie musculaire de Duchenne5,6. Modifications de cette mesure ont été utilisées pour évaluer les résultats dans des modèles animaux de Duchenne, y compris de souris mdx 7 et de chiens golden retriever de Duchenne (GRMD)8. Dans cette étude, nous enregistrons le mouvement volontaire de plein champ dans les 6 minutes immédiatement après une faute d’exercice doux. Distance de marche a ensuite été calculé à l’aide de logiciel open source libre pour mesurer le mouvement horizontal au fil du temps.
Le principal avantage de cette méthode est que les animaux peut être testés dans une variété de configurations sans avoir besoin d’équipement spécialisé ou coût élevé des logiciels commerciaux pour l’analyse. Un aspect important de cette analyse est qu’elle peut être réalisée dans un environnement de laboratoire de base sans avoir besoin de déplacer ou de transférer la souris hors du vivarium à un laboratoire spécialisé central. Le protocole de suivi vidéo décrit ici est bien adapté à l’évaluation de déambulation au cours de périodes relativement peu de temps et peut détecter des différences d’activité entre souris sauvage et mdx , ainsi que révèlent une amélioration fonctionnelle dans une opération de sauvetage modèle de DMD.
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Protocol
Les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Californie, Los Angeles et d’institutionnels animalier. Sauvage (C57BL/6J) et souris mdx (C57Bl/10ScSn fond) ont été achetées à une source commerciale. MDX: souris utrophine-Tg étaient un cadeau de James Ervasti, avec la permission de Kay Davies et se sont maintenus sur le fond de mdx . Ambulation analyses ont été effectuées sur des souris mâles à l’âge de 6 mois. Souris ont été maintenues dans le Vivarium de Sciences de la vie de Terasaki directives établies par l’animalier institutionnel et le Comité de l’urbanisme à l’Université de Californie, la Los Angeles (autorisation #2000-029-43) et l’approbation de ces études a été accordée par le UCLA Animal Welfare Assurance (agrément n° A3196-01).
1. préparation de la chambre
- Effectuer la collecte de données dans une pièce silencieuse, de la température contrôlée à la fois cohérente du jour9. Effectuer les essais aveuglés pour le génotype et le traitement de la souris à l’essai.
- S’adapter à n’importe quel système de chambre de plein champ pour cette analyse.
Remarque : Dans cette étude, nous utilisons une chambre d’enregistrement peu coûteux et facilement transportable construite à partir d’une grande poubelle. L’arène de plein champ est un plateau situé sur une cage ou une plate-forme surélevée semblable. - Placez la caméra sur un treillis métallique au-dessus de la chambre d’enregistrer dans l’arène pleine.
- Nettoyer la chambre enregistrement de désinfectant avant chaque essai.
2. exercer de pré collecte de données et de protocole
- En option, immédiatement avant l’enregistrement de l’activité, contester chaque souris avec un protocole d’activation musculaire.
NOTE : Ceci est facultatif, mais recommandé dans les expériences impliquant des souris mdx .- Laissez la souris pour saisir la barre de traction d’un dynamomètre numérique et tirer doucement jusqu'à ce que la barre de traction est libérée. Répétez cette procédure cinq fois par procès.
- Tension de pic inégalé (N) pour chaque essai.
Remarque : En plus d’être un défi d’exercice pour le dosage de la déambulation, la force exercée par l’animal au cours de ce test de force de préhension peut être utilisée comme une mesure de résultat fonctionnel supplémentaire2,10. - Effectuer cinq essais totales pour chaque souris, avec 1 min de repos entre chaque essai.
- Immédiatement après l’essai de résistance de poignée ou tout autre protocole d’exercice, placez votre souris dans la chambre de l’activité.
- Démarrer l’enregistrement du mouvement de la souris sur la scène de la chambre. Laissez la souris pour explorer librement pendant 6 min.
- Arrêter l’enregistrement à 6 min et regagner sa cage maison de la souris.
3. video analyse
- Vous pouvez également préparer vidéo pour l’analyse en réduisant la fréquence d’images. Afin de réduire la fréquence d’images pour le suivi de l’analyse, utilisez le protocole suivant dans une vidéo éditant le logiciel (p. ex., iMovie ou un programme similaire) à décimer la fréquence d’images vidéo par un facteur de 2.
Remarque : Selon la longueur et la cadence de la vidéo, il peut être utile réduire la fréquence d’images vidéo avant l’analyse. Dans cette étude, la vidéo a été enregistrée à 30 images/s (6 min d’enregistrement, environ 10 800 cadres de totales).- Chargez la vidéo dans le logiciel.
- Sous le menu « Vitesse », sélectionnez "vitesse : rapide" et régler la vitesse à 2 x.
- Exporter la vidéo décimée au format de fichier .mp4 pour le suivi de l’analyse.
- Ouvrir la vidéo pour l’analyse dans le logiciel. Régler l’étalonnage pour l’enregistrement vidéo en utilisant l’outil en ligne. Tracez une ligne le long d’un côté de la chambre. Faites un clic droit sur la ligne, puis sélectionnez « Calibrate mesure... » Entrez la taille réelle du côté chambre en centimètres.
- Pour commencer le suivi semi automatique de la position de la souris, cliquez sur le curseur de « déplacer ».
À partir de la trame initiale dans la vidéo, clic droit sur le point d’être suivis ; le point de suivi est marqué avec un cercle bleu.
Remarque : Dans la présente étude, la position de chaque animal a été suivie par tracer la base de la queue. - Avancer l’image en cliquant sur la flèche droite du clavier ; le point de suivi devrait déplacer automatiquement basé sur la position de la base de la queue.
- Si la position de suivi n’est pas alignée avec le point d’intérêt dans un cadre donné, aligner manuellement le cercle bleu à la base de la queue.
Remarque : Selon la qualité de la vidéo et la vitesse de la souris, le suivi peut exiger des niveaux variables d’entrée d’utilisateur pour maintenir l’alignement avec le centre d’intérêt. Le chemin de la souris doit faire progresser tout au long de la vidéo.
- Si la position de suivi n’est pas alignée avec le point d’intérêt dans un cadre donné, aligner manuellement le cercle bleu à la base de la queue.
- Lorsque le suivi de la vidéo complète est terminée, enregistrez la superposition vidéo et de traçage. Exporter les données positionnelles de la vectorisation en sélectionnant « Exporter à feuille de calcul ».
4. analyse des données
- Ouvrez les données de position dans un logiciel tableur. Le logiciel d’analyse de mouvement signale que le X, Y coordonnée de la position de la souris sur chaque image.
- Pour calculer la distance parcourue par l’image, utilisez l’équation suivante (où est la position dans le cadre un x1, y1 et cadre deux est x2, y2) :
Remarque : La distance cumulée au fil du temps peut être calculée en ajoutant la distance parcourue entre chaque image.
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Representative Results
Les variations du dosage plein champ ont démontré être une méthode efficace pour vérifier la progression de la maladie dans les modèles de la dystrophie musculaire. Ici, nous démontrons une vidéo polyvalente suivi la méthode d’analyse de mouvement de la souris à deux dimensions à l’aide d’appareil de contrôle facilement accessibles et logiciels open source (Figure 1 a–B). Conformément aux résultats signalés dans des épreuves similaires, nous montrons que les souris mdx contesté avec un protocole d’exercice immédiatement avant les essais montrent significativement moindre mouvement volontaire dans une tâche de plein champ 6 minutes que les souris de type sauvage (Figure 1 , Figure 2). Après le léger effort d’un défi de force de préhension, souris mdx généralement rester immobile pendant les premières minutes du protocole ambulation, avec une augmentation modeste de mouvement par minute 4 à 5 (Figure 3 a). Lorsque vous testez des animaux sauvage et mdx sans une contestation de l’exercice, nous avons ne détecté aucune différence dans la distance totale parcourue (Figure 2).
Cela est compatible avec les rapports des autres groupes semblables essais de mouvement, en regardant avec levées mdx ne montrant aucune différence ou légères diminutions par rapport aux souris de type sauvage. Nous avons évalué en outre des souris transgéniques exprimant des niveaux élevés d’utrophine afin de tester la sensibilité de notre essai (mdx: utr-tg, ligne de Fiona)11,12. Le mdx: utr-tg est un modèle robuste sauvetage du phénotype mdx avec peu de fonctionnalités dystrophiques. Après l’exercice, souris mdx exprimant l’utrophine étaient impossibles à distinguer de type sauvage, sans qu’aucune différence significative dans la distance totale parcourue (Figure 3 b) ou à tout le temps cumulatif des points mesurés (Figure 3 a).
Suivi vidéo repose sur la variabilité de l’image à image, mesurée par un observateur manuel marquant ou par détection d’un logiciel automatisé. Logiciel gratuit et open source d’analyse de mouvement permet une détection semi automatisée des mouvements des animaux, dans lequel mouvements non détectées ou surestimées peuvent être manuellement corrigées comme la trace de l’activité est générée. Pour réduire au minimum le traitement des données dans ce test, nous avons sous-échantillonnées les vidéos originales de l’enregistré 30 i/s à 15 images/s. Pour déterminer l’effet de la diminution du taux d’échantillonnage, nous avons mesuré le total distance parcourue de 1 min de vidéo taux plein cadre et ensuite comparé les mesures de distances dérivés sous-échantillonnées versions de l’ensemble de données (Figure 4 a). Nous avons constaté que la réduction de la cadence de la moitié (décimation par 2) a diminué la distance mesurée de 5,0 % et réduire la fréquence d’images aussi faible que 7,5 fps retenus près de 90 % de la distance d’origine calculée (89,2 % de la distance à 30fps vidéo). La précision de la distance mesurée a chuté fortement après ce point, bien qu’encore fortement décimé les ensembles de données encore d’approximation de la voie de l’animal (Figure 4 b). Ces observations soulignent l’importance de considérer la cadence et en évaluant l’activité animale de traitement du signal et démontrent que haute résolution spatiale peut être conservée dans les données vidéo sous-échantillonnées.
Figure 1 : représentation ouvrir des traces de champ de distance de marche de 6 minutes. (A) mise en place de chambre d’enregistrement d’activité utilisée dans cette étude. Compteur de poignée a été utilisé pour exercice avant le défi d’analyser, puis déambulation libre a été enregistrée sur la plate-forme de plein champ. (B) image Composite de 6 min de vidéo d’enregistrement avec l’analyse de traçage dans le logiciel de suivi de mouvement. (C) superposition de deux traces représentatives (WT, gris, n = 1 ; mdx, rouge, n = 1). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effet de l’exercice sur la déambulation de mdx . distance de marche de 6 minutes ont été enregistrés à 6 mois d’âge avec ou sans exercice antérieur (non exercés mdx n = 5, WT n = 4 ; exercé mdx n = 5, WT n = 5). Aucune différence significative n’a été observée entre les versions WT et mdx lors de levées, mais une différence significative a été observée chez les souris exercés avant les tests (pas d’exercice : WT 1077.0± 106,4 cm, mdx 971.0 ± 36,16 cm ; post-exercice : WT 770.2 ± 30,75 cm, mdx 127,8 ± 36,16 cm). Données représentent ± SEM. statistiques calculées à l’aide de deux voies ANOVA suivie de Tukey signifie test de comparaison multiple (*p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001 et ***p < 0,0001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression transgénique d’utrophine améliore la déambulation chez les souris mdx . distance de marche de 6 minutes ont été enregistrés à 6 mois d’âge à l’aide d’une chambre de l’activité de plein champ (WT, n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (A) distance cumulée parcourue par minute. Aucune différence significative n’a été détecté entre WT et mdx: utr-tg à tout moment. Statistiques calculées utilisation bidirectionnelle ANOVA suivie de Tukey du test de comparaison multiple (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ***p < 0,0001). (B) Total libre champ distance parcourue pendant 6 min (WT 770.2 ± 30,75 cm, ± mdx 127,8 cm 36,16, mdx: utr-Tg 701,3 ± 33,54 cm). Données représentent ± SEM. statistiques calculées à l’aide d’ANOVA à suivie de Tukey signifie test de comparaison multiple (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ***p < 0,0001).S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : effet de la fréquence d’échantillonnage sur ambulation suivi. Chez une souris sauvage, 1 min de distance de marche a été enregistré et suivis à l’aide de mouvement dépistant le logiciel à une fréquence (30,0 fps, 1 819 nombre total de trames). La position de deux dimensions de la souris dans chaque image a été déterminée, et ces données sont ensuite décimées afin de simuler le repérage en vidéo de taux de trame inférieure (30, 22,5, 20, 15, 10, 7,5, 6, 3, 1,5 et 0,75 fps). Distance totale (A), calculée à partir des coordonnées dans chaque ensemble de données sous-échantillonnées. Lignes pointillées montrent des valeurs au sein de 5 % de la distance calculée à partir du full frame rate vidéo. Données dans cette étude proviennent de vidéo décimée à 15 images/s (flèche rouge). (B) des superpositions de traces en comparant plein cadre taux retraçant avec 1,5 images/s (voir ci-dessus) et 15 images/s (ci-dessous). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’essai de champ libre offre un moyen efficace et non invasif pour tester la fonction motrice chez les modèles murins de la maladie du muscle, et les variations de ce test peuvent servir en guise de point de terminaison précieuse pour des études précliniques. Une limitation majeure avec ce type de test est l’accessibilité limitée et de desserte à coût élevé de l’activité des systèmes de surveillance. Dans cette étude, nous montrons un système peu coûteux pour l’analyse d’activités de plein champ qui peut générer des résultats similaires aux logiciels commerciaux existants et des équipements. Ce système peut être utilisé dans les vivariums où sont logés les souris, éliminant le besoin de transférer des animaux à des installations de base. La polyvalence de ce dosage permet également l’utilisation de la vidéo de suivi dans une grande variété de recherche et établissements d’enseignement, y compris des cours de premier cycle laboratoire axées sur le comportement et la physiologie animale.
Dans cette étude, nous avons constaté que les différences dans un mouvement volontaire entre souris sauvage et mdx peuvent être facilement détectée exacerbation suivante par exercice. Cette différence robuste a été signalée par d’autres groupes en regardant des résultats d’activité similaires, y compris les essais de terrain dégagé d’une heure et essais d’élevage du jour au lendemain. Alors que nous avons n’observé aucune différence de déambulation volontaire entre sauvage non levée et souris mdx , cela correspond aux résultats d’autres groupes13. Certains chercheurs ont signalé une modeste différence de distance ambulation volontaire entre sauvage non levée et de souris mdx 7, tandis que d’autres n’indiquent aucune différence13. Nos résultats supportent l’utilisation de l’activation des muscles avant les essais afin de détecter de manière fiable une différence statistiquement significative dans l’activité de mdx .
Dans cette étude, nous avons présenté des souris avec un environnement roman plein champ. En utilisant ce protocole environnement roman, nous avons observé très peu de variabilité au sein des groupes. Toutefois, lorsque les souris sont placés dans un environnement familier, ils ont tendance à ont renforcé l’activité14. Si ces mêmes animaux sont à tester pendant plusieurs sessions, les animaux doivent être habitués à la chambre d’enregistrement et subissent le protocole de test complet plusieurs fois avant d’enregistrer les données.
Une considération importante dans l’évaluation des données d’essais de plein champ, c’est qu’il est très sensible au comportement animal et les États émotionnels, comportements de type particulièrement anxieux. Il est possible que le mdx peut avoir une réponse comportementale différente à l’environnement roman que les animaux témoins de type sauvage. Cependant, nous avons testé en outre un sauvetage spécifiques du muscle, le mdx: souris utr-Tg, qui exprime l’utrophine sous un promoteur spécifiques du muscle. Ces souris effectuées ainsi que les animaux sauvage, ce qui suggère que des différences comportementales chez des souris mdx ne conduisez pas les changements en déambulation volontaire.
Essais de plein champ sont employés couramment dans des paradigmes comportements ainsi comme dans les études de la fonction motrice, et il existe une variété de paramètres qui peuvent être enregistrées à partir de systèmes de surveillance de l’activité. Certaines de ces mesures couramment utilisées dans le logiciel d’analyse de l’activité commerciale comprennent la détection automatisée de comportements spécifiques, tourner les fréquences, le mouvement vertical et préférences pour des régions spécifiques d’intérêt. Pour le test de distance de marche de 6 minutes utilisé dans cette étude, la sortie est largement limitée à la distance et la vitesse de déambulation horizontale.
En outre, en raison du niveau d’entrée d’utilisateur requis pour suivi semi-automatisé dans ce protocole, ce dosage probablement ne serait pas bien adapté à l’activité de surveillance pour longues périodes de temps ou mesurer les animaux multiples en parallèle. Dans cette étude, nous avons constaté qu’un utilisateur formé pourrait traiter et extraire des données de vidéos dans environ 15 à 30 min par enregistrement. Tandis que ceci représente seulement une charge modérée de temps pour des expériences à petite échelle, ce niveau d’analyse deviendrait rapidement prohibitif pour les études portant sur des ensembles d’échantillons dans son ensemble sur une longue période de temps. Alors que les systèmes de suivi commercial plus entièrement automatisé coûtent généralement plus de 20 000 USD, ces solutions peuvent être plus et temps-rentables pour les laboratoires, où la déambulation est fréquemment testée. Toutefois, pour laboratoires et établissements d’enseignement qui testent seulement un petit nombre d’animaux, la simple mise en place et la reproductibilité de ce test fournit un outil précieux pour évaluer le comportement moteur.
Les types d’analyse de données disponibles sont un facteur important pour déterminer les dosages de point de terminaison approprié pour une étude préclinique. Alors que nous étions capables de détecter systématiquement les différences entre les trois génotypes à l’aide de la distance de marche de 6 minutes (sauvage, mdxet mdx: utr-tg), une analyse plus complexe de l’activité à plus long terme peut être souhaitable, en regardant les subtiles changements dans les mouvements volontaires. Cependant, l’accessibilité et la simplicité de ce set-up de faible coût rendent un test fonctionnel très pertinent et utile pour les études précliniques chez la souris mdx .
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health [R01 AR048179 et R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 et F32 AR069469to E.M.G] et la Muscular Dystrophy Association USA [274143 et 416364 à R.C.W.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
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