Summary
Questo protocollo descrive un sistema flessibile, a basso costo per la misurazione della deambulazione del mouse in un'analisi di attività di campo aperto. Vi mostriamo un saggio di deambulazione di 6 minuti basato su questo sistema rileva una diminuzione nel movimento volontario nei topi mdx che distingue accuratamente miglioramento in un salvataggio di muscolo-specific di questi animali.
Abstract
Misurazione dei risultati funzionali nel trattamento della distrofia muscolare è un aspetto essenziale del test preclinici. La valutazione della deambulazione volontaria in modelli murini è un saggio di attività non-invasivo e riproducibile che è direttamente analoga alle misure del paziente deambulazione come il 6-minute walk test e relativi punteggi di mobilità. Molti metodi comuni per il test di velocità di deambulazione del mouse e distanza sono basati sul test di campo aperto, dove la libera circolazione di un animale all'interno di un'arena è misurata nel tempo. Uno svantaggio principale di questo approccio è che il software commerciale e attrezzature per il tracciamento del movimento ad alta risoluzione sono costosa e possono richiedere il trasferimento di topi a strutture specializzate per il test. Qui, descriviamo un sistema a basso costo, basati su video per la misurazione della deambulazione del mouse che utilizza il software libero e open-source. Usando questo protocollo, dimostriamo che volontaria della deambulazione nel modello del topo del dystrophin-null mdx per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è diminuita rispetto al mouse di selvaggio-tipo attività. In mdx topi che esprimono il transgene di utrofina, questi deficit di attività non vengono osservati e la distanza totale percorsa è indistinguibile da topi wild-type. Questo metodo è efficace per misurare i cambiamenti nel ambulation volontario associato a patologia distrofica e fornisce una piattaforma versatile che può essere facilmente adattata alle impostazioni di ricerca diversi.
Introduction
Misurazioni affidabili e riproducibili di funzione muscolare sono fondamentali per valutare l'efficacia delle terapie potenziali per la DMD. DMD è una malattia genetica causata da mutazioni nel gene della distrofina, che conduce alla debolezza muscolare progressiva, perdita della deambulazione ed eventuale insufficienza cardiorespiratoria. Il modello animale più ampiamente usato di DMD è il mouse dystrophin-null mdx . Una batteria di test funzionali sono emersi come analisi di routine per valutare la progressione di malattia nel topo mdx così come in modelli animali simili di altre distrofie e miopatie. Comunemente usato in vivo analisi includono misurazioni della forza di presa della zampa anteriore, filo appeso tempo, massimo rotarod, ora ad esaurimento durante il rilevamento delle attività in esecuzione e motore tapis roulant. C'è stato un notevole sforzo nel campo per standardizzare questi test, con l'obiettivo di riduzione della variabilità tra gli studi preclinici e aumentando il potenziale traslazionale di terapeutica testato in topi1,2.
Una categoria importante di test preclinici è la misura del movimento volontario, un parametro che è frequentemente alterato in modelli murini di distrofia muscolare. Questo solitamente è testato da saggi basati su campo aperto attività di monitoraggio e può valutare orizzontale (a piedi) o movimenti verticali (allevamento) sopra un corso di minuti o ore2,3,4. Una serie di studi hanno dimostrato il movimento volontario per essere alterata in topi mdx , particolarmente dopo l'esercizio, e queste misurazioni hanno dimostrate di essere sensibili alla progressione di malattia e trattamento di droga. Uno dei principali limiti nell'esecuzione di queste analisi è la necessità di apparecchiature specializzate, ad alto costo. Qui, viene presentato un metodo di basso costo che tiene traccia della deambulazione del mouse utilizzando risorse prontamente disponibili.
La distanza di 6 minuti a piedi è una metrica comunemente usata come uno strumento di valutazione clinica in individui con la distrofia muscolare di Duchenne5,6. Le modifiche di questa misura sono state usate per valutare i risultati in modelli animali di Duchenne, compresi di topi mdx 7 e documentalista dorato distrofia muscolare (GRMD) cani8. In questo studio, registriamo il movimento volontario campo aperto in 6 minuti subito dopo una sfida di esercizio mite. Distanza di deambulazione è stata quindi calcolata utilizzando software open-source gratuito per misurare il movimento orizzontale nel corso del tempo.
Il vantaggio principale di questo metodo è che gli animali possono essere testati in una varietà di impostazioni senza bisogno di attrezzature specializzate o software commerciale ad alto costo per l'analisi. Un aspetto importante di questa analisi è che può essere eseguita in un ambiente di laboratorio di base senza la necessità di spostare o trasferire i topi fuori il vivarium in una struttura specializzata. Il protocollo di rilevamento video descritto qui è particolarmente adatto per la valutazione della deambulazione relativamente a periodi di tempo breve e può rilevare differenze di attività tra topi wild-type e mdx , nonché miglioramento funzionale in un salvataggio di rivelare modello di DMD.
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Protocol
I metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la University of California, Los Angeles e istituzionali Animal Care. Wild-type (C57BL/6J) e topi mdx (C57Bl/10ScSn sfondo) sono stati acquistati da una fonte commerciale. MDX: topi di utrofina-Tg erano un regalo da James Ervasti, con il permesso di Kay Davies ed erano tenuti sullo sfondo mdx . Analisi della deambulazione sono stati effettuati su topi maschi a 6 mesi di età. Topi sono stati mantenuti nel Vivarium di Life Sciences Terasaki seguendo le linee guida stabilite dalla cura istituzionale degli animali e uso Committee presso la University of California, Los Angeles (approvazione n. 2000-029-43) e l'approvazione per questi studi fu concesso dal UCLA Animal Welfare Assurance (approvazione n #A3196-01).
1. preparazione della camera
- Eseguire la raccolta di dati in una stanza tranquilla, temperatura controllata in un preciso istante del giorno9. Eseguire i test in cieco per il genotipo e il trattamento del mouse in fase di test.
- Adattarsi a qualsiasi sistema di alloggiamento del campo aperto per questa analisi.
Nota: In questo studio, usiamo una camera di registrazione poco costoso e facilmente trasportabile costruita da un grande cestino. L'arena di campo aperto è un vassoio impostato su una gabbia o la piattaforma sopraelevata simile. - Posizionare la fotocamera su una rete metallica sopra la camera di registrare tutta l'arena completo.
- Pulire la camera di registrazione con disinfettante prima di ogni prova.
2. pre-allenamento protocollo e raccolta dati
- Facoltativamente, immediatamente prima dell'attività di registrazione, è possibile sfidare ogni mouse con un protocollo di attivazione muscolare.
Nota: Questo è facoltativo ma consigliato in esperimenti su topi mdx .- Consentire il mouse per afferrare la sbarra di trazione di un dinamometro digitale e tirare delicatamente indietro fino a quando la barra di tiro viene rilasciata. Ripetere questa procedura cinque volte al trial.
- Tensione di picco record (N) per ogni prova.
Nota: Oltre a servire come una sfida di esercizio per l'analisi della deambulazione, la forza esercitata dall'animale durante questo test di forza di presa può essere utilizzata come un ulteriore risultato funzionale misura2,10. - Eseguire cinque prove totale per ogni mouse con 1 min di riposo tra ogni prova.
- Subito dopo il test di forza di presa o altro protocollo di esercizio, posizionare il mouse nella camera di attività.
- Avviare la registrazione video del movimento del mouse nell'arena da camera. Consentire il mouse per esplorare liberamente per 6 min.
- Interrompere la registrazione a 6 min e tornare il mouse alla sua gabbia a casa.
3. video analisi
- Facoltativamente, preparare video per analisi di riduzione della frequenza fotogrammi. Al fine di ridurre la frequenza fotogrammi per analisi di rilevamento, utilizzare il seguente protocollo in un software di video editing (ad es., iMovie o programma simile) per decimare il frame rate video di un fattore 2.
Nota: A seconda della lunghezza e frame rate del video, può essere utile per ridurre la frequenza di fotogrammi video prima dell'analisi. In questo studio, il video è stato registrato a 30 fotogrammi/s (6 min di registrazione, totale circa 10.800 fotogrammi).- Caricare il video nel software.
- Sotto il menu 'Speed', selezionare ' velocità: veloce ' e impostare la velocità a 2x.
- Esportare il video decimato in formato file. MP4 per tenere traccia delle analisi.
- Aprire il video per l'analisi con il programma. Impostare la taratura per la video registrazione utilizzando lo strumento linea. Disegnare una linea lungo un lato della camera. Fare clic con il pulsante destro sulla linea e selezionare "Calibra misura..." Immettere la dimensione effettiva del lato camera in centimetri.
- Per iniziare il rilevamento semi-automatizzato della posizione del mouse, fare clic sul cursore 'Sposta'.
A partire dal fotogramma iniziale nel video, fare clic destro sul punto da rilevare; il punto di rilevamento è segnato con un cerchio blu.
Nota: Nello studio presente, la posizione di ogni animale è stata registrata da rintracciare la base della coda. - Far avanzare il fotogramma cliccando la freccia destra sulla tastiera; il punto di rilevamento dovrebbe spostare automaticamente basato sulla posizione della base della coda.
- Se la posizione di rilevamento non è allineata con il punto di interesse in un determinato frame, allineare manualmente il cerchio blu alla base della coda.
Nota: A seconda della qualità del video e la velocità del mouse, il rilevamento può richiedere i livelli variabili di input dell'utente per mantenere l'allineamento con il punto di interesse. Il percorso del mouse dovrebbe avanzare attraverso il corso del video.
- Se la posizione di rilevamento non è allineata con il punto di interesse in un determinato frame, allineare manualmente il cerchio blu alla base della coda.
- Quando rintracciare il video completo è completa, salva la sovrapposizione video e tracciatura. Esportare i dati posizionali del ricalco selezionando "Esporta per foglio di calcolo".
4. analisi dei dati
- Aprire i dati posizionali in un programma di software di foglio di calcolo. Il software di analisi di movimento segnala che la X, Y coordinare la posizione del mouse in ogni fotogramma.
- Per calcolare la distanza percorsa dalla cornice, utilizzare la seguente equazione (dove è la posizione nella cornice uno x1, y1 e pagina due è x2, y2):
Nota: Distanza percorsa nel tempo può essere calcolato sommando la distanza percorsa tra ogni fotogramma.
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Representative Results
Variazioni del dosaggio campo aperto hanno dimostrati di essere un metodo efficace per testare la progressione di malattia nei modelli della distrofia muscolare. Qui, dimostriamo un video versatile inseguimento del metodo per l'analisi del movimento del mouse bidimensionale utilizzando apparecchiature di registrazione prontamente disponibili e software open source (Figura 1A–B). Coerente con i risultati riportati da simili dosaggi, mostriamo che topi mdx sfidato con un protocollo di esercizio immediatamente prima di test mostrano significativamente meno movimento volontario in un'attività di campo aperto 6 minuti rispetto a topi wild-type (Figura 1 , Figura 2). Dopo sforzo lieve di una sfida di forza di presa, topi mdx in genere rimangono ancora per i primi minuti del protocollo della deambulazione, con un modesto aumento nel movimento di minuti 4-5 (Figura 3A). Quando gli esperimenti su animali wild-type e mdx senza una sfida di esercizio, abbiamo non rilevato alcuna differenza nella distanza totale percorsa (Figura 2).
Ciò è coerente con i rapporti da altri gruppi guardando le analisi di movimento simili, con inoptati mdx non mostrando alcuna differenza o piccole riduzioni rispetto a topi wild-type. Abbiamo inoltre valutato topi transgenici che esprimono alti livelli di utrofina al fine di testare la sensibilità della nostra analisi (mdx: utr-tg, Fiona linea)11,12. Mdx: utr-tg è un modello robusto salvataggio del fenotipo con poche caratteristiche distrofici mdx . A seguito dell'esercizio, topi mdx esprimendo utrofina erano indistinguibili da wild-type, con nessuna differenza significativa nella distanza totale percorsa (Figura 3B) o in qualsiasi del tempo cumulativo punti misurati (Figura 3A).
Video-based per il monitoraggio si basa sulla variabilità di fotogramma per fotogramma, misurata mediante sia manuale osservatore segnando o con rilevazione automatica del software. Software di analisi di movimento libero e open source consente semi-automatico rilevamento di movimento degli animali, in cui non rilevati o sovrastimati i movimenti possono essere corretti manualmente come viene generata la traccia di attività. Per ridurre al minimo il trattamento dei dati in questa analisi, abbiamo ricampionate i video originali dalla registrato 30 fps a 15 fps. Per determinare l'effetto di diminuire la frequenza di campionamento, abbiamo misurato il totale distanza percorsa da 1 min di video a velocità telaio completo e quindi confrontato misurazioni della distanza derivate da downsampling versioni del set di dati (Figura 4A). Abbiamo trovato che dimezzando la frequenza fotogrammi (decimazione da 2) ha fatto diminuire la distanza misurata del 5,0% e riducendo la frequenza dei fotogrammi più bassa come 7.5 fps conservato quasi il 90% della distanza originale calcolato (89,2% della distanza dal video a 30 fps). La precisione della distanza misurata ha fatto scendere bruscamente dopo questo punto, anche se anche altamente decimato DataSet ancora ben approssimata il percorso dell'animale (Figura 4B). Queste osservazioni sottolineano l'importanza di considerazione del frame rate e nella valutazione dell'animale attività di elaborazione del segnale e dimostrano che un'alta risoluzione spaziale può essere mantenuta nel downsampling dati video.
Figura 1: rappresentante aprire tracce di campo della distanza di deambulazione di 6 minuti. (A) messa a punto della camera di registrazione di attività utilizzato in questo studio. Misuratore di aderenza è stato utilizzato per esercizio prima della sfida di test, quindi della deambulazione libera è stata registrata sulla piattaforma aperta del campo. (B) immagine composita di 6 min di registrazione video con analisi di tracciatura in movimento, software di monitoraggio. (C) sovrapposizione di due tracce rappresentative (WT, grigio, n = 1; mdx, rosso, n = 1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetto dell'esercizio sulla deambulazione mdx . Distanze di deambulazione di 6 minuti sono stati registrati a 6 mesi dell'età con o senza l'esercizio precedente (non esercitato mdx n = 5, WT n = 4; esercitato mdx n = 5, WT n = 5). Nessuna differenza significativa è stata osservata fra WT e mdx quando inoptati, ma una differenza significativa è stata veduta in topi esercitati prima del dosaggio (nessun esercizio: WT 1077.0± 106,4 cm, mdx 971.0 ± 36,16 cm; post-esercizio: WT 770.2 ± 30,75 cm, mdx 127,8 ± 36,16 cm). Rappresentano dati significa ± SEM. statistiche calcolate facendo uso di ANOVA a due vie seguita da Tukey test di confronto tra più (*p < 0.05, * *p < 0,01, * * * p < 0,001 e * * *p < 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione transgenica di utrofina migliora la deambulazione nei topi mdx . Distanze di deambulazione di 6 minuti sono stati registrati a 6 mesi di età, utilizzando una camera di attività di campo aperto (WT n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (A) la distanza complessiva percorsa dal minuto. Nessuna differenza significativa è stata rilevata tra WT e mdx: utr-tg in qualsiasi punto. Le statistiche calcolate utilizzando ANOVA a due vie, seguita da Tukey di test di confronto tra più (*p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 e * * *p < 0,0001). (B) totale aperto campo distanza percorsa in 6 minuti (± WT 770.2 30,75 cm, mdx 127,8 ± 36,16 cm, mdx: utr-Tg 701.3 ± 33,54 cm). Rappresentano dati significa ± SEM. statistiche calcolate usando il One-way ANOVA seguita da Tukey test di confronto tra più (*p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 e * * *p < 0,0001).Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: effetto di frequenza di campionamento sulla deambulazione tracking. Un mouse di tipo selvatico, 1 min di distanza di deambulazione è stata registrata e rilevati tramite movimento segue il software alla massima velocità (30,0 fps, 1.819 frame totali). È stata determinata la posizione bidimensionale del mouse in ogni fotogramma, e questi dati allora sono stati decimati per simulare il rilevamento in video di velocità di trasmissione inferiori (30, 22.5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1,5 e 0,75 fps). (A) totale distanza calcolata da coordinate in ogni set di dati di downsampling. Linee tratteggiate mostrano valori entro il 5% della distanza calcolata da full frame rate dei video. Dati in questo studio sono stati ottenuti da video decimato a 15 fps (freccia rossa). (B) sovrapposizioni di tracce confronto completo telaio tasso tracciando con 1,5 fps (sopra) e a 15 fps (sotto). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il dosaggio di campo aperto consente di testare la funzione motoria in modelli murini di malattia del muscolo in modo efficace e non invasivo, e variazioni di questo test possono servire come una misura di endpoint prezioso per studi pre-clinici. Uno dei principali limiti con questo tipo di analisi è l'accessibilità ad alto costo e limitato di sistemi di monitoraggio delle attività. In questo studio, dimostriamo un sistema a basso costo per l'analisi di attività di campo aperto che possono generare risultati simili a software commerciali esistenti e attrezzature. Questo sistema può essere utilizzato all'interno di vivai dove sono alloggiati topi, eliminando la necessità di trasferire gli animali a strutture di nucleo. La versatilità di questo test consente anche l'utilizzo di video tracking in un'ampia varietà di ricerca e contesti educativi, compresi i corsi di laboratorio universitario incentrati sul comportamento e fisiologia animale.
In questo studio, abbiamo trovato che le differenze di movimento volontario tra topi wild-type e mdx possono essere prontamente rilevato seguente l'esacerbazione di esercizio. Questa differenza robusta è stata segnalata da altri gruppi guardando la pagina di risultati di attività simili, tra cui analisi di campo aperto un'ora e durante la notte allevamento saggi. Mentre abbiamo non osservato alcuna differenza nel ambulation volontaria tra inoptati wild-type e topi mdx , ciò è coerente con i risultati da altri gruppi13. Alcuni ricercatori hanno segnalato una modesta differenza di distanza di deambulazione volontaria tra inoptati wild-type e di topi mdx 7, mentre altri riferiscono alcuna differenza13. I nostri risultati sostengono l'uso di attivazione muscolare prima del test al fine di rilevare in modo affidabile una differenza statisticamente significativa nell'attività di mdx .
In questo studio, abbiamo presentato i topi con un ambiente nuovo campo aperto. Usando questo protocollo ambiente novello, abbiamo osservato molto poca variabilità all'interno dei gruppi. Tuttavia, quando i topi sono collocati in un ambiente non familiare, tendono a catalizzato attività14. Se gli stessi animali devono essere testati in più sessioni, gli animali dovrebbero essere abituati alla camera di registrazione e subiscono il protocollo di test completo più volte prima di registrare dati.
Una considerazione importante nella valutazione dei dati da campo aperto saggi è che è altamente sensibile al comportamento animale e le condizioni emotive, comportamenti di particolare tipo di ansia. È possibile che l' mdx possono avere una diversa risposta comportamentale all'ambiente romanzo rispetto agli animali di controllo di tipo selvatico. Tuttavia, è inoltre testato un salvataggio di muscolo-specific, l' mdx: mouse utr-Tg, che esprime utrofina sotto un promotore di muscolo-specific. Questi topi eseguita così come animali, suggerendo che eventuali differenze di comportamento nei topi mdx non sono guidando i cambiamenti nel ambulation volontaria.
Campo aperto saggi sono ampiamente utilizzati nei paradigmi comportamentali anche negli studi della funzione motoria, e ci sono una varietà di parametri che possono essere registrati da sistemi di monitoraggio attività. Alcune di queste misure comunemente utilizzate nel software di analisi di attività commerciale riguardano il rilevamento automatico di comportamenti specifici, girare le frequenze, il movimento verticale e preferenze per specifiche regioni di interesse. Per il dosaggio di distanza di deambulazione di 6 minuti utilizzato in questo studio, l'output è in gran parte limitato a distanza e velocità di deambulazione orizzontale.
Inoltre, a causa del livello di input dell'utente richiesto per il rilevamento semi-automatizzato in questo protocollo, questo test probabilmente non sarebbe adatto per attività di monitoraggio per lunghi periodi di tempo o più animali in parallelo di misura. In questo studio, abbiamo trovato che un utente addestrato potrebbe elaborare ed estrarre dati dai video in circa 15-30 min per la registrazione. Mentre questo rappresenta solo un peso moderato tempo per esperimenti su piccola scala, questo livello di analisi sarebbe rapidamente diventato proibitivo per gli studi alla ricerca di set al grande campione per un periodo più lungo. Mentre i sistemi di tracciamento commerciale più completamente automatici in genere costano più di 20.000 USD, queste soluzioni possono essere più costo - e tempo-efficace per i laboratori dove la deambulazione è frequentemente testata. Tuttavia, per laboratorio e contesti educativi che prova solo un piccolo numero di animali, la semplice set-up e la riproducibilità di questo test fornisce un prezioso strumento per valutare il comportamento del motore.
I tipi di analisi dei dati disponibile sono una considerazione importante nel determinare le analisi di endpoint appropriato per uno studio pre-clinico. Mentre siamo stati in grado di rilevare costantemente le differenze fra i tre genotipi utilizzando distanza di deambulazione di 6 minuti (wild-type, mdxe mdx: utr-tg), un'analisi più complessa di attività a lungo termine può essere desiderabile quando guardando sottile cambiamenti nel movimento volontario. Tuttavia, l'accessibilità e la semplicità di questo set-up basso costo rendono un test funzionale utile e di grande rilevanza per gli studi pre-clinici nel modello del topo mdx .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health [AR048179 R01 e R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 e F32 AR069469to E.M.G] e la distrofia muscolare Association USA [274143 e 416364 di RCW].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
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