Summary
Denne protokollen beskriver en fleksibel, lavkost system for å måle mus ambulation i åpne-feltet aktivitet analysen. Vi viser at en 6-minutters ambulation analysen basert på dette systemet oppdager en reduksjon i frivillig bevegelse i mdx mus, og nøyaktig skiller forbedring i en muskel-spesifikke redning av disse dyrene.
Abstract
Måle funksjonelle resultater i behandlingen av muskeldystrofi er en vesentlig del av prekliniske testing. Vurdering av frivillige ambulation i musen modeller er en ikke-invasiv og reproduserbar aktivitet analysen som er direkte analog til tiltak av pasientens ambulation for eksempel 6 minutters gange testen og relaterte mobilitet score. Mange vanlige metoder for testing musen ambulation hastighet og distanse er basert på åpne felttest, der et dyr er fri bevegelse innenfor en arena er målt over tid. En stor ulempe med dette er at kommersiell programvare og utstyr for høyoppløselig bevegelse sporing er dyrt og krever overføring mus til spesialiserte anlegg for testing. Her beskriver vi en rimelig, video-basert system for å måle musen ambulation som benytter gratis og åpen kildekode programvare. Bruker denne protokollen, viser vi at frivillige ambulation i dystrophin er null mdx musemodell for Duchenne muskeldystrofi (DMD) er redusert i forhold til vill-type mus aktivitet. I mdx mus uttrykke utrophin transgene, disse aktivitet underskudd er ikke observert og totale avstanden reist er utvisket fra vill-type mus. Denne metoden er effektiv for å måle endringer i frivillig ambulation tilknyttet dystrophic patologi, og tilbyr en allsidig plattform som lett kan tilpasses til ulike forskningsmiljøer.
Introduction
Pålitelig og reproduserbar målinger av muskler er kritisk for å vurdere effekten av potensielle terapi for DMD. DMD er en genetisk lidelse forårsaket av mutasjoner i genet dystrophin, fører til progressiv muskelsvakhet, tap av ambulation og eventuell cardiorespiratory feil. Den mest brukte dyr modellen av DMD er dystrophin null mdx musen. Et batteri av funksjonelle tester har dukket opp som rutinemessig analyser for evaluering av sykdomsprogresjon i mdx musen så vel som i lignende dyr modeller av andre dystrophies og myopathies. Brukte i vivo analyser inkluderer målinger av forlemen grep styrke, wire hengende tid, rotarod maksimalt, tid til utmattelse under tredemølle kjører og motor aktivitet sporing. Det har vært en betydelig innsats i feltet for å standardisere disse testene, med mål om å redusere variasjon mellom prekliniske studier og øke translasjonsforskning potensialet i therapeutics testet i mus1,2.
En viktig kategori prekliniske testing er måling av frivillige bevegelsen, en parameter som endres ofte i murine modeller av muskeldystrofi. Dette er vanligvis testet av analyser basert på åpen aktivitet avlytting og kan vurdere vannrett (walking) eller loddrett (bakside) bevegelser i løpet av minutter eller timer2,3,4. En rekke studier har vist frivillige bevegelsen endres i mdx mus, spesielt etter trening, og disse målingene har vist seg å være følsomme for narkotika behandling og sykdom progresjon. Ettall større begrensningen i å utføre disse analyser er behovet for spesialisert, høye kostnader utstyr. Her vises en rimelig metode som sporer musen ambulation bruker tilgjengelige ressurser.
6 minutters gange avstand er en beregning brukt som et klinisk vurdering verktøy i personer med Duchenne muskeldystrofi5,6. Modifikasjoner av dette tiltaket har blitt brukt til å vurdere resultatene i dyr modeller av Duchenne, inkludert mdx mus7 og Gylden Gjenerverve muskeldystrofi (GRMD) hundene8. I denne studien registrere vi frivillig åpne feltet bevegelse i 6 minutter etter en mild morsjon utfordring. Ambulation avstand ble deretter beregnet benytter ledig åpen kilde programvare for å måle horisontal bevegelse over tid.
Den største fordelen med denne metoden er at dyr kan testes i en rekke innstillinger uten spesialisert utstyr eller høye kostnader kommersiell programvare for analyse. Et viktig aspekt av denne analysen er at det kan utføres i en grunnleggende laboratorium uten å måtte flytte eller overføre mus av på vivarium til et spesialisert kjernen. Video-sporing protokollen beskrevet her kan er velegnet for vurdering av ambulation i relativt kort tid-perioder og oppdage aktivitet forskjeller mellom vill-type og mdx mus, samt avsløre funksjonell forbedring i en redning modell av DMD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metodene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of California, Los Angeles. Vill-type (C57BL/6J) og mdx mus (C57Bl/10ScSn bakgrunn) ble kjøpt fra en kommersiell kilde. MDX: utrophin-vs mus var en gave fra James Ervasti, med tillatelse fra Kay Davies, og ble opprettholdt på mdx bakgrunn. Ambulation analyser ble utført på mannlige mus på 6 måneders alder. Mus ble opprettholdt i Terasaki biovitenskap Vivarium følgende retningslinjer fastsatt av de institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of California, Los Angeles (godkjenning #2000-029-43) og godkjenning for disse studiene ble gitt av den UCLA dyr velferd forsikring (godkjenning #A3196-01).
1. forberedelse av kammer
- Utføre datainnsamling i et stille, temperaturkontrollerte rom på en konsekvent dag9. Utføre testene blindet genotype og behandling av musen blir testet.
- Tilpasse alle åpen kammer system for denne analysen.
Merk: I denne studien bruker vi en billig og lett transportable opptak kammer konstruert fra en stor papirkurven. I åpne-feltet er en skuff satt i et bur eller lignende opphøyet plattform. - Plass kameraet på en ledning maske over kammeret registrere over hele arena.
- Rengjør til opptak kammeret desinfeksjonsmiddel før hvert forsøk.
2. før trening protokollen og datainnsamling
- Eventuelt umiddelbart før aktivitet opptak, utfordre hver mus med en muskel aktivering protokoll.
Merk: Dette er valgfritt, men anbefales eksperimenter med mdx mus.- Lar musen grep pull bar en digital makt måler og trekk forsiktig tilbake til baren trekk slippes. Gjenta dette fem ganger i rettssaken.
- Registrere topp spenning (N) for hvert forsøk.
Merk: I tillegg en trening utfordring for ambulation analysen, i kraft av dyret under denne grep styrke analysen kan brukes som en ekstra funksjonelle utfallet tiltaket2,10. - Utføre fem totale prøvelser for hver mus med 1 min hvile mellom hvert forsøk.
- Umiddelbart etter grep styrke analysen eller andre arbeidstest-protokoll, Plasser musen i aktivitet kammeret.
- Start videoinnspillingen av bevegelse av musen i kammeret arena. Lar musen å fritt utforske for 6 min.
- Stoppe innspillingen 6 minutter og tilbake musen til buret sitt hjem.
3. video analyse
- Du kan også forberede video for analyse ved å redusere Rammehastigheten. For å redusere Rammehastigheten for sporing analyse, kan du bruke følgende protokollen i en video redigering programvare (f.eks, iMovie eller lignende program) for å overvinne video bildefrekvens med en faktor på 2.
Merk: Avhengig av lengden og rammen rate av videoen, kan det være nyttig å redusere video bildefrekvens før analyse. I denne studien videoen ble spilt inn på 30 rammer/s (6 min opptak, ca 10,800 rammer totalt).- Laste inn videoen i programvaren.
- På "Speed"-menyen, velg "Speed: rask ' og angi hastigheten til 2 x.
- Eksportere desimert videoen MP4-filformatet for å spore analyse.
- Åpne video for analyse i programmet. Angi kalibrering for video opptak ved hjelp av linjeverktøyet. Tegne en linje langs den ene siden av kammeret. Høyreklikk på linjen og velg "Kalibrer tiltak..." Angi den faktiske størrelsen på siden kammer i centimeter.
- For å begynne semi-automatisk sporing av mus posisjon, klikk på "Flytt" markøren.
Starter på den første rammen i videoen, høyreklikk på punktet spores; sporing poenget er merket med en blå sirkel.
Merk: Studien, plasseringen av hvert dyr ble sporet av sporing foten av halen. - Fremme rammen ved å klikke pil høyre på tastaturet; sporing punktet bør automatisk flytte basert på plasseringen av hale base.
- Hvis sporing posisjonen ikke er justert med til severdigheten i en gitt ramme, manuelt justere den blå kretsen på undersiden av halen.
Merk: Avhengig av kvaliteten på videoen og hastigheten på musen, sporing kan kreve variable beskyttelsesnivåer brukerinndata å opprettholde Agressos til severdigheten. Banen til musen skal gå gjennom løpet av videoen.
- Hvis sporing posisjonen ikke er justert med til severdigheten i en gitt ramme, manuelt justere den blå kretsen på undersiden av halen.
- Når sporing av hele videoen er fullført, lagre video og sporing overlegget. Eksportere posisjonelle data sporing ved å velge "Eksporter til regneark".
4. dataanalyse
- Åpne posisjonsdata i et regneark-program. Bevegelse analyseprogramvare rapporter X, Y koordinatposisjonen til musen i hver ramme.
- Bruk denne formelen til å beregne avstanden reist av ramme (der posisjon i ramme en er x1, y1 og ramme to er x2, y2):
Merk: Kumulativ distanse over tid kan beregnes ved å legge til avstanden reist mellom hver ramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Varianter av åpen analysen har vist seg å være en effektiv metode for å teste sykdomsprogresjon i modeller av muskeldystrofi. Her viser vi en allsidig video oppfølgingsmetode for analyse av todimensjonal musen bevegelse bruke tilgjengelig utstyr og åpen kildekode (figur 1A-B). Konsekvent resultater rapportert fra lignende analyser, viser vi at mdx mus utfordret med en øvelse protokoll umiddelbart før testing viser betydelig mindre frivillig bevegelse i en 6-minutters åpne feltet oppgave enn vill-type mus (figur 1 c , Figur 2). Etter den milde anstrengelse grep styrke utfordring, mdx mus vanligvis forblir fremdeles i de første minuttene av ambulation-protokollen, med en beskjeden økning i bevegelse minutt 4 til 5 (figur 3A). Når du tester vill-type og mdx dyr uten en trening utfordring, oppdaget vi ingen forskjell i total distanse (figur 2).
Dette er i tråd med rapporter fra andre grupper etter lignende bevegelse analyser, med unexercised mdx viser ingen forskjell eller små reduksjoner i forhold til vill-type mus. Vi i tillegg vurdert transgene mus uttrykke høye nivåer av utrophin for å teste følsomheten til analysen vår (mdx: utr-tg, Fiona linje)11,12. Mdx: utr-tg er en robust redning modell av mdx fenotypen med noen dystrophic funksjoner. Etter øvelsen mdx mus uttrykke utrophin ble utvisket fra vill-type, med ingen signifikant forskjell i den totale avstanden reist (figur 3B) eller på noen av kumulativ tid peker målt (figur 3A).
Video-basert sporing bruker delbilde til delbilde variasjon, målt ved enten manuell observatør scoring eller automatisert programvare oppdagelsen. Ledig og åpen kilde bevegelse analyseprogramvare gir semi-automatisert påvisning av dyr bevegelse, der uoppdaget eller overvurdert bevegelser kan manuelt korrigeres aktivitet spor er generert. Å minimere databehandlingen i denne analysen, vi Nedsamples opprinnelige videoer fra opptak 30 fps til 15 fps. For å fastslå effekten av avtagende samplingsfrekvensen, vi målte totalen avstanden reist fra 1 min fullformat rate video og deretter sammenlignet avstandsmålinger avledet fra Nedsamples versjoner av datasettet (figur 4A). Vi fant at redusere Rammehastigheten med halvparten (uttynning av 2) redusert målt avstand med 5.0% og reduserer bildefrekvensen så lavt som 7,5 fps beholdt nesten 90% av den opprinnelige avstanden beregnede (89,2% av avstand fra 30 bilder per sekund). Nøyaktigheten av målt avstand falt kraftig etter dette punktet, men også svært desimert datasett fortsatt tett tilnærmes banen til dyret (figur 4B) av dette. Disse observasjonene markere betydningen av vurderer bildefrekvens og signalbehandling i vurderingen dyr aktivitet, og viser at høy romlig oppløsning kan beholdes i Nedsamples videodata.
Figur 1: representant åpne feltet spor 6 minutters ambulation avstand. (A) satt opp av aktivitet opptak kammer brukt i denne studien. Grep meter ble brukt til øvelse utfordringen før til analysen og gratis ambulation ble spilt inn på åpen plattform. (B) sammensatt bilde av 6 min video-opptak med sporing analyse i bevegelse sporing. (C) overlapping av to representant spor (WT, grå, n = 1; mdx, rød, n = 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Effekten av trening på mdx ambulation. 6 minutters ambulation avstander ble registrert på 6 måneders alder med eller uten tidligere morsjon (ikke-utøvde mdx n = 5, WT n = 4, utøvd mdx n = 5, WT n = 5). Ingen signifikant forskjell ble observert mellom WT og mdx når unexercised, men en betydelig forskjell ble sett i mus utøves før analysen (ingen øvelse: WT 1077.0± 106.4 cm, mdx 971.0 ± 36.16 cm, post-øvelse: WT 770.2 ± 30.75 cm, mdx 127.8 ± 36.16 cm). Data representerer betyr ± SEM. statistikk beregnet ved hjelp av toveis VARIANSANALYSE etterfulgt av Tukey er flere sammenligningen test (*p < 0,05, **p < 0.01, *** p < 0,001 og ***p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Transgene uttrykk for utrophin forbedrer ambulation i mdx mus. 6 minutters ambulation avstander ble registrert på 6 måneders alder med en åpen aktivitet kammer (WT n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-vs n = 4). (A) Kumulativ distanse reist minutt. Fant ingen signifikant forskjell mellom WT og mdx: utr-vs når som helst. Statistikken beregnes ved hjelp av toveis VARIANSANALYSE etterfulgt av Tukey er flere sammenligningen test (*p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001 og ***p < 0,0001). (B) Total åpne feltet distanse over 6 min (WT 770.2 ± 30.75 cm, mdx 127.8 ± 36.16 cm, mdx: utr-vs 701.3 ± 33.54 cm). Data representerer betyr ± SEM. statistikk beregnet ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukey er flere sammenligningen test (*p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001 og ***p < 0,0001).Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: effekten av samplingsfrekvens på ambulation sporing. I vill-type mus, 1 min ambulation avstand ble spilt inn og spores ved hjelp av bevegelse sporing på fullformat rate (30.0 fps, 1,819 sum rammens). Identifiserte todimensjonal plasseringen av musen i hver ramme, og disse dataene ble deretter desimert for å simulere sporing i lavere rammen rate video (30, 22,5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1.5 og 0,75 fps). (A) Total distanse beregnet fra koordinater i hvert Nedsamples datasett. Stiplede linjer viser verdier i 5% av avstanden beregnet fra full frame rate video. Dataene i denne studien ble innhentet fra video desimert til 15 fps (rød pil). (B) belegg av spor sammenligne fullformat rate sporing med 1,5 fps (over) og 15 fps (nedenfor). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Åpen analysen gir en effektiv og ikke-invasiv måte å teste funksjon i musen modeller av hjertemuskelen sykdom, og varianter av denne analysen kan tjene som et verdifullt endepunktet mål for pre kliniske studier. Ettall større begrensningen med denne analysen er høye kostnader og begrenset tilgjengelighet av aktivitet overvåkingssystemer. I denne studien viser vi en lavkost system for åpen aktivitetsanalyse som kan generere lignende resultater til eksisterende kommersiell programvare og utstyr. Dette systemet kan brukes i drette der mus er plassert, eliminerer behovet å overføre dyr til kjernen fasiliteter. Allsidigheten av denne analysen kan også bruk av video sporing i en rekke forsknings- og utdannings-innstillinger, inkludert undervisning laboratorium kurs fokusert på dyr fysiologi og atferd.
I denne studien fant vi at forskjeller i frivillig bevegelse mellom vill-type og mdx mus kan lett oppdaget følgende forverring av trening. Denne robuste forskjellen er rapportert av andre grupper etter lignende aktivitet resultater, inkludert timelange åpne feltet analyser og natten oppdrett analyser. Mens vi observerte ingen forskjell i frivillig ambulation unexercised vill-type og mdx mus, er dette i tråd med resultater fra andre grupper13. Noen forskere har rapportert en beskjeden forskjell i frivillig ambulation avstand mellom unexercised vill-type og mdx mus7, mens andre rapporterer ingen forskjell13. Våre funn støtter bruk av muskel aktivering før testing for å oppdage en statistisk signifikant forskjell i mdx aktivitet.
I denne studien presentert vi mus med en roman åpne feltet miljø. Bruker denne romanen miljø-protokollen, observerte vi lite variasjon i grupper. Men når mus er plassert i et kjent miljø, pleier de å ha økt aktivitet14. Hvis de samme dyrene å bli testet over flere økter, dyr skal bli habituated til opptak chamber og gjennomgå full testprotokollen flere ganger før innspillingen dataene.
En viktig faktor i å evaluere data fra åpen analyser er at det er svært følsom for dyr oppførsel og emosjonelle forhold, spesielt angst-lignende atferd. Det er mulig at mdx kan ha et annet atferdsdata svar på romanen miljøet enn vill-type kontroll dyrene. Men vi i tillegg testet en muskel-spesifikk hjelpe, mdx: utr-vs mus, som uttrykker utrophin under en muskel-spesifikke promoter. Disse musene utført og vill-type dyr, antyder at atferdsdata forskjeller i mdx mus ikke kjører endringene i frivillig ambulation.
Åpen analyser er mye brukt i atferdsdata paradigmer så vel som i studier av funksjon, og det finnes en rekke parametere som kan registreres fra aktivitet overvåkingssystemer. Noen av disse målingene som vanligvis brukes i kommersiell aktivitet analyseprogramvare omfatter Automatisert påvisning av spesifikk atferd, slå frekvenser, vertikal bevegelse og preferanser for bestemte områder av interesse. For 6-minutters ambulation avstand analysen brukt i denne studien, er utgangen begrenset til avstand og hastighet på vannrette ambulation.
I tillegg på grunn av nivået på brukerinndata kreves for halvautomatisk sporing i denne protokollen, vil denne analysen trolig ikke være godt egnet for aktivitet overvåking for lengre perioder eller måle flere dyr parallelt. I denne studien fant vi at en trent bruker kan behandle og trekke ut data fra videoer i ca 15-30 min per registrering. Mens dette representerer bare en moderat gang byrde for småskala eksperimenter, ville dette nivået av analyse raskt blitt uoverkommelige for studier ser store Prøvesett over en lengre periode. Mens mer helautomatisk kommersielle sporingssystemer vanligvis koster mer enn 20 000 USD, kan disse løsningene være mer og tid-kostnadseffektive for laboratorier der ambulation er ofte testet. Men laboratorium og utdannings-innstillinger som bare teste lite antall dyr, gir enkelt oppsett og reproduserbarhet av denne analysen et verdifullt verktøy for å vurdere motor atferd.
Hvilke typer data analyser tilgjengelig er en viktig faktor i å bestemme riktig endepunkt analyser for en pre-klinisk studie. Mens vi var i stand til å konsekvent oppdage forskjeller mellom tre genotyper bruker 6 minutters ambulation fra (vill-type og mdx mdx: utr-vs), en mer omfattende analyse av langsiktig aktivitet kan være ønskelig når du ser på subtile endringer i frivillige bevegelsen. Men gjør tilgjengelighet og enkelhet i dette rimelige oppsettet det en nyttig og svært relevant funksjonelle test for pre kliniske studier i mdx musemodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health [R01 AR048179 og R01 HL126204 R.C.W, T32 AR059033 og F32 AR069469to E.M.G] og muskeldystrofi Association USA [274143 og 416364 å R.C.W.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
