Summary
Det här protokollet beskriver en flexibel, låg kostnad system för att mäta mus förflyttningar i en öppna fältet aktivitet assay. Vi visar att en 6-minuters förflyttningar analys utifrån detta system upptäcker en minskning av frivillig rörelse i mdx möss och exakt skiljer förbättring i en muskel-specifika räddning av dessa djur.
Abstract
Mäta funktionella resultat vid behandling av muskeldystrofi är en viktig aspekt av prekliniska tester. Bedömningen av frivilliga förflyttningar i musmodeller är en icke-invasiv och reproducerbara verksamhet som är direkt jämförbar med åtgärder av patientens mobilitet såsom 6-minuters gångtest och relaterade rörlighet noter. Många vanliga metoder för att testa musen förflyttningar hastighet och avstånd är baserade på öppna fältet testet, där djurets fria rörlighet inom en arena mäts över tid. En stor nackdel med detta tillvägagångssätt är att kommersiell programvara och utrustning för högupplösta motion tracking är dyrt och kanske kräver överföring av möss till specialiserade anläggningar för testning. Här beskriver vi en låg kostnad, video-baserade system för att mäta mus förflyttningar som använder fri och öppen programvara. Användning av detta protokoll, visar vi att frivilliga förflyttningar i dystrofin-null mdx musmodell för Duchennes muskeldystrofi (DMD) minskas i förhållande till vildtyp mus aktivitet. I mdx möss att uttrycka den utrophin transgenens, dessa aktivitet underskott iakttas inte och den totala tillryggalagda är omöjlig att skilja från vildtyp möss. Denna metod är effektiv för att mäta förändringar i frivilliga förflyttningar är associerad med dystrofa patologi, och ger en mångsidig plattform som kan anpassas lätt till olika forskning inställningar.
Introduction
Tillförlitliga och reproducerbara mätningar av muskelfunktion är kritiska för att utvärdera effekten av potentiella behandlingar för DMD. DMD är en genetisk sjukdom som orsakas av mutationer i dystrofingenen, leder till Progressiv muskelsvaghet, förlust av förflyttningar och eventuellt kardiorespiratorisk fel. Den mest använda djurmodell av DMD är dystrofin-null mdx musen. Ett batteri av funktionella tester har dykt upp som rutinmässiga analyser för att utvärdera sjukdomsprogression i mdx musen samt som i liknande djurmodeller av andra dystrofier och myopatier. Vanligen används i vivo analyser omfatta mätningar av forelimb greppstyrka, tråd hängande tid, rotarod maximalt, tid till utmattning under löpbandet körs, och motoriska aktivitetsspårning. Det har varit en betydande insats i fältet att standardisera dessa tester, med målet att minska variabiliteten mellan prekliniska studier och öka translationell potential therapeutics testas i möss1,2.
En viktig kategori av prekliniska tester är mätning av frivillig rörelse, en parameter som ofta ändras i murina modeller av muskeldystrofi. Detta är vanligtvis testad av analyser baserat på öppna fältet aktivitetsövervakning och kan utvärdera antingen vågrät (gångavstånd) eller vertikala (uppfödning) rörelser över en kurs i minuter eller timmar2,3,4. Ett antal studier har visat frivillig rörelse ändras i mdx mice, särskilt efter träning, och dessa mätningar har visat sig vara känsliga för läkemedel behandling och sjukdom progression. En stor begränsning i att utföra dessa analyser är behovet av specialiserad, dyr utrustning. Här presenteras en billig metod som spårar mus förflyttningar använder lättillgängliga resurser.
6 minuters promenadavstånd är ett mått som ofta används som en klinisk bedömningsverktyg hos individer med Duchennes muskeldystrofi5,6. Ändringar av denna åtgärd har använts för att bedöma resultat i djurmodeller av Duchenne, inklusive mdx mice7 och golden retriever muskeldystrofi (GRMD) hundar8. I den här studien registrerar vi frivilliga öppna fältet rörelse de 6 minuter omedelbart efter en mild träning utmaning. Förflyttningar avståndet beräknades sedan med hjälp av gratis programvara med öppen källkod för att mäta horisontella rörelse över tiden.
Den största fördelen med denna metod är att djur kan testas i en mängd olika inställningar utan att behöva specialutrustning eller dyr kommersiell programvara för analys. En viktig aspekt av denna analys är att det kan utföras i grundläggande laboratoriemiljö utan att behöva flytta eller överföra möss ur ett vivarium till en specialiserad core facility. Det video-tracking-protokollet som beskrivs här kan är väl lämpad att bedömningen av förflyttningar över relativt korta tidsperioder och identifiera aktivitet skillnader mellan vildtyp och mdx mice, samt avslöja funktionell förbättring i en räddning modell av DMD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoderna som beskrivs här godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid University of California, Los Angeles. Vildtyp (C57BL/6J) och mdx möss (C57Bl/10ScSn bakgrund) köptes från en kommersiell källa. MDX: utrophin-Tg möss var en gåva från James Ervasti, med tillstånd från Kay Davies, och kvarstod på mdx bakgrunden. Mobilitet-analyser utfördes på hanmöss vid 6 månaders ålder. Möss bibehölls den Terasaki biovetenskap Vivarium efter riktlinjer fastställda av den institutionella Animal Care och användning kommittén vid University of California, Los Angeles (godkännande nr 2000-029-43) och godkännande för dessa studier beviljades av den UCLA djur välfärd Assurance (godkännande nr A3196-01).
1. beredning av kammare
- Utföra datainsamling i ett tyst, kontrollerad temperatur rum på en enhetlig tid av dag9. Utföra de tester som förblindade till genotyp och behandling av musen som testas.
- Anpassa alla öppna fältet kammaresystem för denna analys.
Obs: I denna studie använder vi en billig och lätt att transportera inspelning kammare konstruerad från en stor papperskorg. Öppna fältet arenan är en bricka på en bur eller liknande upphöjda plattformen. - Placera kameran på ett ståltrådsnät över kammaren för att spela in över hela arenan.
- Rengöra inspelning kammaren med desinfektionsmedel innan varje rättegång.
2. före utöva protokoll och datainsamling
- Du kan också omedelbart före aktivitet inspelning, utmana varje mus med en muskel aktivering protokoll.
Obs: Detta är valfritt men rekommenderas i experiment med mdx möss.- Låt musen för att greppa dra baren för en digital kraft mätare och dra försiktigt tillbaka tills golvläggarjärn släpps. Upprepa detta fem gånger per studie.
- Spela in topp spänning (N) för varje prövning.
Obs: Förutom att tjäna som en övning utmaning för förflyttningar analysen, den kraft som utövas av djuret under denna grepp styrka analys kan användas som en ytterligare funktionella resultatet åtgärd2,10. - Utför fem totala prövningar för varje mus med 1 min vila mellan varje försök.
- Omedelbart efter grepp styrka analysen eller andra övning protokoll, Placera musen i aktivitet kammaren.
- Starta videoinspelningen av förflyttning av musen i kammare arena. Låt musen för att fritt utforska i 6 min.
- Stoppa inspelningen vid 6 min och återgå musen till dess buren.
3. video analys
- Du kan också förbereda video för analys genom att minska bildrutefrekvensen. För att minska bildrutefrekvensen för att spåra analys, använda följande protokoll i ett videoredigeringsprogram (t.ex., iMovie eller liknande program) för att decimera video bildfrekvensen med en faktor 2.
Obs: Beroende på längd och stomme hastighet av videon, det kan vara användbart att minska video bildfrekvensen före analys. I denna studie spelades videon på 30 bildrutor/s (6 min inspelning, ca 10.800 bildrutor totalt).- Läsa in videon i programvaran.
- Under menyn 'Speed', Välj ' hastighet: snabbt ' och inställt 2 x hastighet.
- Exportera decimerad video i MP4-format för att spåra analys.
- Öppna video för analys i programmet. Ställ in kalibreringen för videoinspelning med hjälp av linjeverktyget. Rita en linje längs ena sidan av kammaren. Högerklicka på raden och Välj ”Kalibrera åtgärd...” Ange den faktiska storleken av kammaren sida i centimeter.
- För att börja halvautomatisk spårning av musposition, klicka på 'flytta' markören.
Börjar på den första bildrutan i videon, högerklicka på punkten kan spåras; den spårning punkten markeras med en blå cirkel.
Obs: I den aktuella studien spårades position varje djur genom att spåra basen av svansen. - Förväg ramen genom att klicka på högerpilen på tangentbordet; den spårning punkten bör automatiskt flytta baserat på placeringen av svans basen.
- Om spårning ställning inte är i linje med punkten av intresse i en given ram, manuellt justera den blå cirkeln på basen av svansen.
Obs: Beroende på kvaliteten på videon och hastigheten på musen, spårning kräva variabla nivåer av användarindata att bibehålla anpassningen till punkten av intresse. Sökvägen till musen bör avancera genom loppet av videon.
- Om spårning ställning inte är i linje med punkten av intresse i en given ram, manuellt justera den blå cirkeln på basen av svansen.
- När spårning av hela videon är klar, spara överlägget video och spårning. Exportera positionella för spårning genom att välja ”exportera till kalkylblad”.
4. dataanalys
- Öppna positionsdata i ett kalkylprogram för programvara. Rörelse analys programvaran rapporterar X, Y-koordinatens position för musen i varje bildruta.
- För att beräkna tillryggalagd sträcka av ram, använda följande ekvation (där position i ramen en är x1, y1 och ram två är x2, y2):
Obs: Ackumulerad distans över tid kan beräknas genom att lägga till sträckan som tillryggalagts mellan varje bildruta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Variationer i öppna fältet analysen har visat sig vara en effektiv metod att testa sjukdomsförloppet i modeller av muskeldystrofi. Här visar vi en mångsidig video spårning metod för analys av tvådimensionella musrörelse använder lättillgängliga färdskrivaren och programvara med öppen källkod (figur 1A–B). Överensstämmelse med resultat rapporterats från liknande analyser, visar vi att mdx mice utmanas med en övning protokollet omedelbart innan testning visar betydligt mindre frivillig rörelse i en 6-minuters öppna fältet aktivitet än vildtyp möss (figur 1 c , Figur 2). Efter den milda ansträngning grepp styrka utmaning, mdx mice vanligtvis förblir fortfarande för de första minuterna av protokollet förflyttningar, med en blygsam ökning rörligheten minut 4 till 5 (figur 3A). Vid testning av vildtyp och mdx djur utan en träning utmaning, upptäckt vi ingen skillnad i total körsträcka (figur 2).
Detta är förenligt med rapporter från andra grupper som ser på liknande rörelse analyser, med outnyttjade mdx visar ingen skillnad eller små minskningar i förhållande till vildtyp möss. Vi dessutom utvärderat transgena möss uttrycker höga nivåer av utrophin för att testa känsligheten för vår analys (mdx: utr-tg, Fiona linje)11,12. Mdx: utr-tg är en robust rescue modell av mdx fenotypen med några dystrofa funktioner. Efter övningen mdx mice uttrycker utrophin var omöjlig att skilja från vildtyp, med ingen signifikant skillnad i den totala tillryggalagda (figur 3B) eller på någon av den sammanlagda tiden punkter uppmätta (figur 3A).
Video-baserad spårning är beroende av bildruta-för-bildruta variabilitet, mätt genom antingen manuell observatör scoring eller automatiserad programvara identifiering. Fri och öppen källkod rörelse analysis software möjligt för halvautomatisk upptäckt av djurförflyttningar, där oupptäckt eller överskattade rörelser kan manuellt korrigeras som aktivitet tracen genereras. Att minimera databehandlingen i denna analys, vi nedsamplas den ursprungliga videor från inspelade 30 fps till 15 fps. För att avgöra effekten av minskar samplingsfrekvensen, Vi mätte totalen avstånd reste från 1 min av full frame rate video och sedan jämfört avståndsmätningar härrör från nedsamplas versioner av datauppsättningen (figur 4A). Vi hittade att minska bildfrekvensen halveras (decimering av 2) minskade det uppmätta avståndet med 5,0% och minska bildrutefrekvensen så lågt som 7,5 fps förvarat nästan 90% av det ursprungliga avståndet beräknas (89,2% av avståndet från 30 fps video). Riktigheten av uppmätt avstånd tappade bort kraftigt efter denna punkt även om även starkt decimerats datamängder approximeras fortfarande nära vägen för djuret (figur 4B). Dessa iakttagelser belysa vikten av bildfrekvens och signalbehandling vid bedömningen av djurens aktivitet, och visar att hög rumslig upplösning kan behållas i nedsamplas videodata.
Figur 1: representativa öppna fältet spår av 6 minuters förflyttningar avstånd. (A) utformningen av aktivitet inspelning kammare används i denna studie. Grepp mätaren användes för träning utmaning innan till assay, sedan gratis förflyttningar spelades på öppna fältet plattformen. (B) sammansatt bild av 6 minuters videoinspelning med spårning analys i rörelse spårning programvara. (C) överlagring av två representativa traces (WT, grå, n = 1; mdx, röd, n = 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekt av träningen på mdx förflyttningar. 6 minuters förflyttningar avstånd registrerades vid 6 månaders ålder med eller utan föregående övning (ej utnyttjade MDX-n = 5, WT n = 4; utövas MDX-n = 5, WT n = 5). Ingen signifikant skillnad observerades mellan WT och mdx när ej utnyttjats, men en signifikant skillnad sågs hos möss utövas före assay (ingen motion: WT 1077.0± 106,4 cm, mdx 971.0 ± 36.16 cm; efter träning: WT 770,2 ± 30,75 cm, mdx 127,8 ± 36.16 cm). Data representerar innebär ± SEM. statistik beräknas med tvåvägs ANOVA följt av Tukey är flera jämförelse test (*p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001 och ***p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Transgena uttrycket av utrophin förbättrar mobilitet i mdx mice. 6 minuters förflyttningar avstånd registrerades vid 6 månaders ålder använder en öppna fältet aktivitet kammare (WT n = 5, MDX-n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (A) Kumulativ sträcka minut. Ingen signifikant skillnad upptäcktes mellan WT och mdx: utr-tg när som helst. Statistik beräknas med tvåvägs ANOVA följt av Tukey är flera jämförelse test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 och ***p < 0,0001). (B) Total öppna fältet tillryggalagd sträcka över 6 min (WT 770,2 ± 30,75 cm, mdx 127,8 ± 36.16 cm, mdx: utr-Tg 701.3 ± 33.54 cm). Data representerar innebär ± SEM. statistik beräknas med envägs ANOVA följt av Tukey är flera jämförelse test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 och ***p < 0,0001).Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: effekten av samplingsfrekvens på förflyttningar spårning. I en vild typ mus, 1 min av förflyttningar avstånd spelades och spåras med hjälp av rörelse spårningsprogram på full bildhastighet (30,0 fps, 1 819 totala ramar). Musen tvådimensionell position i varje bildruta bestämdes, och dessa data var sedan decimerade för att simulera spårning i lägre frame rate video (30, 22,5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1.5 och 0,75 fps). (A) totala avståndet beräknas från koordinater i varje nedsamplas datauppsättning. Streckade linjer visar värden inom 5% av det avståndet beräknas från den full frame Betygsätt video. Uppgifterna i denna studie har erhållits från video decimerats till 15 fps (röd pil). (B) överlägg spår jämföra full frame rate spårning med 1,5 fps (ovan) och 15 fps (nedan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Öppna fältet analysen ger ett effektivt och icke-invasiv sätt att testa motorisk funktion i musmodeller av muskelsjukdom och variationer av denna analys kan fungera som en värdefull endpoint åtgärd för prekliniska studier. En stor begränsning med denna typ av analys är höga kostnader och begränsade tillgängligheten av aktivitet övervakningssystem. I denna studie visar vi en billig system för öppna fältet aktivitet analys som kan generera liknande resultat som befintlig kommersiell programvara och utrustning. Detta system kan användas inom vivaria där möss är inhysta, vilket eliminerar behovet av att överföra djur till corefaciliteter. Mångsidigheten hos denna analys möjliggör också användning av video spårning i en mängd olika forsknings- och utbildningsmiljöer, inklusive grundutbildning laboratorium kurser inriktade på djurens fysiologi och beteende.
I denna studie fann vi att skillnaderna i frivillig rörelse mellan vildtyp och mdx möss kan lätt identifierade följande exacerbation av motion. Denna robusta skillnad har rapporterats av andra grupper tittar på liknande aktivitet resultat, inklusive timslånga öppna fältet analyser och övernattning uppfödning analyser. Medan vi observerade någon skillnad i frivilliga förflyttningar mellan outnyttjade vildtyp och mdx mice, stämmer detta överens med resultat från andra grupper13. Vissa forskare har rapporterat en blygsam skillnaden i frivilliga förflyttningar avstånd mellan outnyttjade vildtyp och mdx mice7, medan andra rapporten skillnaden13. Våra fynd stöder användning av muskelaktivering före testning för att tillförlitligt upptäcka en statistiskt signifikant skillnad i mdx aktivitet.
I denna studie presenterade vi möss med en roman öppet fält miljö. Med denna nya miljö-protokollet, observerade vi mycket liten variabilitet inom grupper. Men när möss är placerade i en främmande miljö, tenderar de att ha förhöjd aktivitet14. Om samma djur testas över flera sessioner, djur bör vara vana att inspelning kammaren och genomgå fullständiga testprotokollet flera gånger innan inspelning av data.
En viktig faktor för att utvärdera data från öppna fältet analyser är att det är mycket känsliga för djurs beteende och känslomässiga tillstånd, särskilt ångest-liknande beteenden. Det är möjligt att mdx kan ha olika beteendemässiga svar på romanen miljön än vildtyp kontroll djuren. Dock testade vi dessutom en muskel-specifika räddning, mdx: utr-Tg mus, som uttrycker utrophin under en muskel-specifika promotorn. Dessa möss utförs samt vilda djur, vilket tyder på att eventuella beteendemässiga skillnader i mdx möss inte kör ändringarna i frivilliga förflyttningar.
Öppna fältet analyser används allmänt i behavioral paradigm såväl som i studier av motorisk funktion, och det finns en mängd olika parametrar som kan spelas från aktivitet övervakningssystem. Några av dessa mätningar som vanligen används i kommersiell verksamhet analysprogram inkluderar automatisk detektion av specifika beteenden, aktivera frekvenser, vertikal rörelse och inställningar för specifika områden av intresse. För 6-minuters förflyttningar avstånd analysen används i denna studie, är utdata till stor del begränsat till avståndet och hastigheten på horisontella förflyttningar.
Dessutom, på grund av den indata från användaren krävs för halvautomatisk spårning i detta protokoll, skulle denna analys sannolikt inte vara väl lämpad för aktivitet övervakning för längre tid eller mäta flera djur samtidigt. I denna studie fann vi att en utbildad användare kunde bearbeta och extrahera data från videor i cirka 15-30 min per inspelning. Medan detta representerar bara en måttlig tid börda för småskaliga experiment, skulle denna analysnivå snabbt bli oöverkomliga för studier på stora provningssatser över en längre tidsperiod. Medan mer helautomatiska kommersiella tracking system vanligtvis kosta mer än 20 000 USD, kan dessa lösningar vara mer kostnads - och tidseffektiv för laboratorier där förflyttningar testas ofta. Men för laboratorie- och utbildningsmiljöer som bara testa litet antal djur, ger enkel set-up och reproducerbarhet av denna analys ett värdefullt verktyg för bedömning av motoriska beteende.
Typerna av dataanalyser tillgängliga är en viktig faktor i att bestämma lämpliga endpoint analyser för en preklinisk studie. Medan vi kunde konsekvent identifiera skillnader mellan tre genotyper med 6 minut förflyttningar avstånd (vildtyp, mdxoch mdx: utr-tg), en mer komplex analys av långsiktiga aktivitet kan vara önskvärt när man tittar på subtila förändringar i frivillig rörelse. Dock gör tillgängligheten och enkelheten i detta låg kostnad upplägg det en användbar och mycket relevanta funktionstest för prekliniska studier i mdx musmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health [R01 AR048179 och R01 HL126204 till R.C.W, T32 AR059033 och F32 AR069469to E.M.G] och muskeldystrofi Association USA [274143 och 416364 till R.C.W.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
