Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת משופרת עבור אוסף עשיר של נוזל מוחי שדרתי (CSF) עם שום זיהום מדם. עם אוסף מדגם גדול יותר, טוהר, ניתוחים נוספים ניתן לבצע באמצעות נוזל מוחי-שדרתי כדי לקדם את ההבנה שלנו של מחלות המשפיעות על המוח ואת חוט השדרה.
Abstract
נוזל מוחי שדרתי (CSF) הוא נוזל גוף יקר עבור ניתוח מחקר מדעי המוח. הוא נחשב לאחד הנוזלים במגע קרוב עם מערכת העצבים המרכזית, לפיכך, יכול לשמש כדי לנתח את מצב חולה במוח או בחוט השדרה ללא גישה ישירה רקמות אלו. עם זאת, בעכברים שקשה לי לקבל מגנה cisterna בשל הקרבה שלו לכלי הדם, אשר לזהם לעיתים קרובות דגימות. האזור לאוסף CSF בעכברים גם קשה לנתח כדי, דוגמיות קטנות לעיתים קרובות בלבד מתקבלים (מרבי של 5-7 µL או פחות). פרוטוקול זה מתאר בפירוט טכניקה שיפור שיטות הנוכחי של איסוף כדי לצמצם זיהום מדם ולאפשר עבור אוסף עשיר של CSF (בממוצע שניתן לאסוף 10-15 µL). ניתן להשתמש בטכניקה זו עם שיטות אחרות לנתיחה לאיסוף רקמות של עכברים, כפי שזה לא משפיע כל רקמות במהלך שאיבת נוזל מוחי-שדרתי. לפיכך, המוח וחוט השדרה אינם מושפעים בטכניקה זו, נותרו ללא פגע. עם אוסף גדול של מדגם CSF, טוהר, ניתוחים יותר ניתן להשתמש עם מחקר מדעי המוח זה סיוע נוזלים נוספת, להבין טוב יותר מחלות התוקפות את המוח ואת חוט השדרה.
Introduction
CSF הוא נוזל גוף יקר עבור ניתוח מחקר מדעי המוח. CSF בעיקר זני פלזמה, המכיל מספר תאים (לא תאי דם אדומים, רק מספר כדוריות הדם), כמעט ללא חלבון. זה אחד הנוזלים קשר הדוק עם מערכת העצבים המרכזית (CNS), זה יכול להתעלף אלקטרוליטים רבים מן המוח וחוט השדרה במערכת ההיקפית. בבני אדם, שדרתי אפשר לאסוף כדי לסייע באבחון המחלה או למטרות מחקר בניסויים קליניים, בדיקת נוזל עמוד השדרה (או ניקור מותני) היא הליך מינורי, פולשני: נוזל CSF יכול לשקף שינויי מערכת העצבים ללא צורך לגשת ישירות אל אלה רקמות. לכן, בשנים האחרונות, למטרות מחקר במרפאה, הושגו שדרתי מחולים של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, אחרים2,1,dementias3. ישנם מבחני סמן רבים אשר פותחו באמצעות דגימות נוזל מוחי-שדרתי פוטנציאל לסייע באבחון מחלות של המרפאה2,3. עם זאת, יש לויכוחים על האמינות של מבחני אלה כדי להפיק תוצאות עקביות, רגיש במיוחד לאבחון המחלה4,5. . כך, שאין צורך גדול להתפתחותם של מבחני טוב יותר של מטרות, אשר ניתן למצוא ב- CSF, כדי לסייע בהפקת טכניקה סטנדרטית כדי לאבחן מחלות ניווניות עם יותר רגישות וספציפיות. בשל חשיבות פוטנציאל אנושי המוחי-שדרתי במחלה, האוסף של CSF מן מכרסמים חקר המוח הוא גם עניין.
עכברים הם חיות חשוב במחקר ביולוגי ורפואי ולאפשר לבדיקה של תרכובות טיפולית פוטנציאל ולימודי הוכחה הרעיון לפני ניסויים קליניים בבני. עם זאת, בעכברים קשה להשיג דגימות נוזל מוחי-שדרתי עקב שלה קרבה אל המוח של חיים קטן, כפי השיטה הרגילה של CSF אוסף בעכברים היא כדי להשיג את זה דרך המלון cisterna, פתח בין המוח לבין המשטח הגבי של המוח המוארך. זה גורם קושי באיסוף דגימות נוזל מוחי-שדרתי ככל שהאזור הזה קשה לנתח כדי, בקרבה לכלי הדם, מעלה את הסיכון של זיהום מתאי הדם. בשל קשיים אלה, רוב החוקרים ניתן להשיג רק כמות קטנה של נוזל מוחי-שדרתי לניתוח (בדרך כלל מסר µL 5-7), הזיהום של שדרתי על ידי כדוריות הדם היא הדאגה העיקרית עבור ניתוחים-6,-7,-8 , 9. זיהום דם יכול להסתיר תוצאות, לא שיקפו את המצב של מערכת העצבים. יתר על כן, מוגבלת דגימה שנאספו יכולים להשפיע מחקר כפי שנאסף עכברים. הכמות הרגילה מספיקה לכל מדידה אחת בלבד (בכפול או משולש) שימוש assay מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). לפיכך, שדרתי הם בדרך כלל איחדו של עכברים מרובים כדי שיהיה מספיק הדגימה כדי להריץ מבחני מרובים. פיתוח פרוטוקול להצפנה שופע, נערבב מהאוסף של CSF עכברים הוא נכסף, יהיה מועיל לשיפור חקר המוח באמצעות מכרסמים.
ב פרוטוקול זה, טכניקה עבור שפע (ממוצע של 10-15 µL) מהאוסף של CSF עכברים ומורדמת מתואר בפירוט ומשפר על שיטה הידועות כרגע של CSF אוסף כדי לצמצם זיהום דם10. פרוטוקול חזקים לאוסף CSF יסייעו בפיתוח של מבחני סמן מבוסס-CSF, אשר יכול לשמש כדי לסייע באבחון המחלה, כמו גם לשפר את המחקר לתוך המנגנונים העומדים בבסיס מחלות התוקפות את מערכת העצבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם למדיניות החברה מדעי המוח (ארה ב), ועדות אתיות אוניברסיטת פודאן (שנגחאי, סין). ההליך זה ניתוח ההישרדות.
1. כיוונון של CSF אוסף מכשיר
- משוך את הזכוכית נימי (הקוטר הפנימי 0.75 מ מ, הקוטר החיצוני 1.0 מ מ) באמצעות של פולר micropipette (כפי שמוצג ליו. et al. 10; נימי מחודדים מוצג באיור1).
- המקום נימי לתוך בעל נימי זכוכית מחודדים בחוזקה רכוב על micromanipulator (איור 1 א').
- שבור את הקצה של נימי מחודדים עם מלקחיים ישר תחת מיקרוסקופ ויבתר, כך הקוטר הפנימי של קצה שבור על 10-20 מיקרומטר (איור 1C).
- לצרף הקצה השני של בעל נימי צינורית דקה ומזרק, וחבר את צינורית דקה ואת המזרק עם שסתום-כיוונית.
- משמרת את השסתום משולשת לפתוח, לצלול את המזרק לשידור המכה של המזרק דרך הצנרת אל הזכוכית נימי כדי לגרש כל מזהמים וליצור הלחץ בצינור נימי.
- . אני חוזר זה כבר כמה פעמים על ידי והחסרונות חיבור התחברות מחדש את המזרק לשסתום משולשת, ממלאים את המזרק ~ 100-200 µL לפני חיבור מחדש האחרון של המזרק עם השסתום משולשת (איור 1B).
- העבר את micromanipulator עם נימי הזכוכית בצד כדי למנוע נזק במהלך ניתוח העכבר.
איור 1. מיקרוסקופ, micromanipulator והגדרת נימי. מיקרוסקופ (א) micromanipulator עם נימי מצורף התקנה, כמו גם תמונה מקרוב (B) את המזרק מחובר ושסתומים -כיוונית לפתוח (המוצג כאן) או לסגור את צנרת, ו- (ג) רצופה (מימין) שבור (שמאל) צינור קפילר עצה מוכן לאיסוף CSF. לאחר שבר, הקצה של נים צריכה של הקוטר הפנימי של 0.75 מ מ, הקוטר החיצוני של 1.0 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
2. העכבר לנתיחה
- עזים ומתנגד העכבר.
הערה: עבור זה פרוטוקול, C57BL/6 ועמילואיד קודמן החלבון/presenilin 1 (APP/PS1) הטרנסגניים עכברים (מחלת אלצהיימר העכבר מודל) היו בשימוש, מרדימים עם 4% כלורין (ב- dH20) ב 10 µL גרם של משקל העכבר באמצעות בקרום הבטן זריקה. - כשהוא מורדם לחלוטין, ודא כי העכבר. הוא מורדם במידה מספקת. התגובה נסיגה שאורך צביטה, על ידי מעט הארכת הגפיים האחוריות, צובט את הבהונות ולצפות לתגובה גמילה, מבוצע כדי להבטיח הרדמה נאותה. בדוק על-ידי צובט כל ארבעת הגפיים; אם אין תגובה העכבר הוא מורדם כראוי. לחתוך ו לקצץ את השיער בעורף של העכבר מעל העיניים, בין האוזניים לחלק התחתון של הצוואר באמצעות מספריים ויבתר (איור 2 א). לחלופין, קוצץ או קרם depilatory יכול לשמש כדי לסייע בהסרת שיער.
- לאבטח את הראש של העכבר באמצעות מתאם העכבר (מאחורי הראש כלפי מעלה עם האף מכוון למטה ~ 45 °, איור 2A). לסדר את האוזן ברים בין האוזניים לבין העיניים של העכבר והדק. ודא הראש לא יכול להזיז מובטח בחוזקה המתאם באמצעות בעדינות דוחף למטה אל ראשו של העכבר.
- בדיקה חוזרת של נסיגה בתגובה טו קמצוץ לפני ביצוע הניתוח החתך באופן קבוע לאחר מכן כדי להבטיח המטוס כירורגי של הרדמה. מבחינה ויזואלית הערה כל שינוי קצב נשימה במהלך ההליך כדי לציין שינויים במישורים של הרדמה. טכניקה נקי, שאינו aseptic, יכול לשמש לניתוח ההישרדות קצר זה. באמצעות מספריים ומלקחיים מעוקל, לחתוך את העור ואת השכבה הראשונה של שריר עד לבסיס הגולגולת נחשפת רק שכבה דקה של השריר.
הערה: לחתוך העור העכבר לרוחב החלק האחורי של הצוואר, ואז לחתוך את העור למטה באמצע הגולגולת בין האוזניים לבין העיניים של העכבר. העור ורקמות ואז ניתן למשוך בנפרד, אל מחוץ לאזור מעל מגנה cisterna. - בזמן צפייה מבעד למיקרוסקופ ויבתר, בזהירות לנתח משם האחרון דק שכבות של שרירים על הבסיס של הגולגולת באמצעות מלקחיים ולהעביר שכבות אלה של שריר בצד, אל מחוץ לאזור עניין. אם יש דימום, להשתמש צמר גפן כדי להסיר לעזור לעצור את הדימום.
- לאחר השכבה הקשה של המוח על המלון cisterna חשוף (משולשת עם בדרך כלל 1-2 כלי דם גדולים רץ דרך האזור; משני הצדדים של או בין כלי הדם היא אופטימלית עבור הכניסה נימי ואוסף CSF, איור 2B), להשתמש רטוב ניצן כותנה תנקה את הקרום ולאחר מכן להשתמש במקלון צמר גפן יבש כדי לייבש את האזור.
באיור 2. ההתקנה דיסקציה של עכבר להחליפן בתמונות של נימי הכניסה לאוסף נוזל מוחי-שדרתי. כיוונון של העכבר מוכן לחילוץ CSF עם (A) גילחת את הראש כשכרטיס במקום לקבלת ניתוח ו- (B) מפורט (תצוגת x 10) דימוי דורא העכבר ביתור המכסים את מגנה cisterna (חץ מקווקו מציגה כלי דם העובר באזור, חץ מוצק מראה אזור אופטימלי נימי ההכנסה). תמונות מפורט (10 x תצוגה) של (C) להשחיז קצה זכוכית נימי מיושר נגד דורא של cisterna מגנה, (D) הנקודה שבה נימי כמעט פנצ'רים השכבה הקשה של המוח, בהתנגדות כלשהי של דורא, ו- (E) הטיפ נימי טפח דרך השכבה הקשה של המוח כדי לאסוף CSF. CSF צריך להיות נוזל צלול שליקט את הזכוכית של נימי (חץ מנוקד). כל קווי סרגל בחלק התחתון של כל תמונת מיקרוסקופ מציינים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
3. CSF מהאוסף העכבר מורדם
- יישר את נימי זכוכית לחלק האחורי של הראש העכבר כך נקודת מחודדים הוא ממש מאחורי הקרום ב ~ 30-45 ° זווית (איור 2C).
- לצלול את המזרק פעם או כמה פעמים וצייר את המזרק ~ µL 100-200 (כדי לוודא יש חומציות, ויש לחץ שלילי בכוס נימי).
- באמצעות את micromanipulator, להזיז את נימי עצה להתקרב הקרום עד שניתן לראות התנגדות, אך לא ניקב זה (איור דו-ממדי).
- לאחר התנגדות הוא ראה בין קצה נים הקרום, טפח בעדינות את צינור קפילרי דרך הקרום על ידי דפיקות על הפקדים micromanipulator. השתמש במיקרוסקופ כדי לראות את נקודת מחודדים של נימי הניקוב לתוך המלון cisterna. CSF צריך באופן אוטומטי להיגרר את צינור קפילרי ברגע הפתיחה היה ניקבה (2E איור).
- להשאיר את נימי לאסוף לאט CSF. אם CSF הפסיק ב"משיכת, לצייר את המזרק את כמות קטנה לאט (~ 50 µL) כדי ליצור לחץ שלילי יותר נימי להוציא החוצה נוזל מוחי-שדרתי.
הערה: לחלופין, נימי יכול להיות ובאיטיות הוציא המוח באמצעות הפקדים micromanipulator בסדר כדי לאפשר CSF לזרום לתוך נימי שוב. סכום כולל של ~ 10-15 µL של CSF (~ 3-4 ס מ נים) לוקח ~ 10-30 דקות, מדי פעם 20 µL או יותר ניתן לאסוף. אמנם לא הכרחי, מומלץ להשתמש משטח חום במהלך האיסוף CSF. אוסף CSF בוצעה בטמפרטורת החדר (~ 23 ° C). - פעם אחת כמות נוזל מוחי-שדרתי הרצוי נאסף, לסגור הצנרת על ידי הסטה השסתום משולשת לסגור (כדי להפסיק לצייר החוצה את CSF).
- להוציא את המזרק מחובר הצנרת, ו פתיחה ולאחר מכן סגירה הצנרת (כדי ליצור לחץ אוזן את נימי, אבובים, ובאזור בחוץ נימי). חבר מחדש את המזרק עם השסתום משולשת, אך לא לצלול את המזרק.
- הסר בעדינות את נימי זכוכית העכבר באמצעות את micromanipulator.
- למקם את הצינור אוסף (1.5 מ ל microtubes עם µL 1 של 20 x מעכב פרוטאז) תחת הנקודה מחודדים של הזכוכית נימי.
- לפתוח את הצנרת, מזנקת בעדינות את המזרק: CSF צריך לזרום מתוך את נימי, לתוך הצינור אוסף.
- לאחר אוסף, במהירות צנטריפוגה (דופק ספין בשביל 5 s במהירות מירבית באמצעות צנטריפוגה מיני) נוזל מוחי-שדרתי לערבב את הדגימה עם מעכבי פרוטאז בתחתית הצינורית אוסף.
הערה: שדרתי יכולה להיות aliquoted, ולאחר מכן מאוחסנים לצורך ניתוח נוסף ב-80 מעלות צלזיוס. בשאר העכבר יכול ניסויים בשביל לרקמות אחרות, כגון המוח ואת חוט השדרה. העכבר עדיין בחיים בשלב זה, ולכן הדם יכולה גם להיות שנאספו, במידת הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בהליך שתואר כאן (איור 1 ואיור 2), נוזל מוחי-שדרתי מיד שליקט את נימי צריך להיות נקי (איור 2E), לא ורוד או אדום. אם יש ורוד כדי גוון אדום שליקט את נימי הנוזל, ואז היה זיהום בדם.
כמו לדוגמה של היישום של המדגם CSF שנאספו באמצעות שיטה זו, רמות של חלבון עמילואיד-הבטא (Aβ) נמדדה באמצעות אליסה. רמות של Aβ ב- CSF נמדד בדרך כלל מחלת אלצהיימר מחקר7. CSF הוא בעיקר ללא חלבון. במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר (APP/PS1 עכברים), רמות של Aβ האנושי42 גדלו באופן משמעותי, כמו אלו עכברים overexpress APP אנושי. זה יכול להיות שנצפו עם הדגימות של CSF שנאסף בת 12 חודשים עכברים באמצעות השיטות המתוארות כאן (0 pg/mL ב- CSF של עכברים (WT) פראי-סוג בהשוואה 1,303 pg/mL בעכברים CSF של האפליקציה/PS1, איור 3).
איור 3. תוצאות נציג שדרתי אסף- אליסה ניתוח שדרתי שנאספו. במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר (APP/PS1), קיימת עלייה משמעותית ברמות של Aβ האנושי42 ב- CSF, כפי אלו עכברים overexpress האנושי Aβ42 (1,303 pg/mL). בפראי-סוג (WT) עכברים שם צריך להיות לא אנושי Aβ42 זוהה (0 pg/mL). אינטראקצית t-מבחן שימש כדי למדוד את משמעות, * * p < 0.01, קווי שגיאה מיוצג SEM, n = 3 ו 4 עכברים-בגיל 12 חודשים בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בפירוט טכניקה אשר משפר את שיטות הנוכחי10 של CSF אוסף לצמצם זיהום מדם ולאפשר האוסף בשפע של CSF (בממוצע ~ 10-15 µL ניתן להשיג) של עכברים. כאשר אתה מפר את הטיפ נימי, קצה נים לא צריך להיות קטן מדי (כמו שהיית CSF יחולצו לאט מאוד) או גדול מדי (וויל לא יהיה מספיק כדי לאסוף את נוזל מוחי-שדרתי. עדין, רקמות יכול להיות תקוע בעצם נימי). כדאי לשים לב כאשר לנתח את האזור עבור אוסף CSF: דימום להפסיקו וניקה האזור. למטרת הכניסה של נימי הזכוכית מדם עם dH20 כדי למנוע זיהום, עם הדגימה. האנטומיה של העכבר כל אחד זה שונה, אבל במרבית העכברים יש כלי דם גדולים 1-2 פועל דרך האזור שבו נימי צריך להיות מוכנס לאוסף CSF. בחירת שהמקום הנכון עבור החדרת נימי הוא חשוב, כמו הוספת יותר מדי כלי הדם לזהם את נוזל מוחי-שדרתי עם דם. כפי שמוצג באיור2, אזור ברורה של כלי דם, כגון כמו בין או משני צדדיו של כלי הדם הגדולים, הוא אופטימלי נימי הכניסה למנוע זיהום. אם CSF אינה זורמת החוצה על קצב קבוע של תחנות אחרי זמן מה, ציור המזרק קצת (~ 50 µL) יכול לעזור להפעיל מחדש את זרימת נוזל מוחי-שדרתי לתוך נימי. לחלופין, נימי עצמה ניתן להעביר ובאיטיות או ממנו את העכבר עם micromanipulator מחדש את הזרימה של מיצוי נוזל מוחי-שדרתי. חייבים להקפיד כאשר עושים את הצעדים האלה כמו דם יכול לזרום לתוך נימי גם כן. טכניקה זו פועלת היטב עקב ההבדלים בלחץ של המוח ושל זכוכית נימי למשוך החוצה CSF מן העכבר. לפיכך, העכבר יכול רק מנוקבת פעם אחת, כמו לאחר נימי הוא מוכנס לתוך העכבר והיא נלקחת, יש אובדן הלחץ במוח CSF כבר לא להיגרר את נימי באופן אוטומטי אם הוספתו שוב. לכן, תרגול מושלם, טכניקה זו לייצר חומציות הדם ולהשיג אוסף CSF נאותה על הכניסה הראשונה של נים לתוך העכבר (מניסיון, 10-20 תרגול עכברים יהיה מספיק כדי להגיע בשלב זה).
פרוטוקול זה שיטה משופרת ויעיל עבור חילוץ CSF עכברים, אם נעשה כראוי, מצמצם זיהום מדם (איור 1, איור 2, איור 3). טכניקה זו מוגבל בזמן נלקח CSF להיות שנאספו. בדרך כלל, 30 דקות יש צורך לאסוף ~ 15 µL ומעלה של CSF בטמפרטורת החדר (~ 23 ° C). במהלך תקופה זו, העכבר יכול להישמר חמים עם צמר גפן או רקמות, אך ללא כיסוי או משטח חום, CSF ניתן עדיין בהצלחה לאסוף. תוספת של כרית חום או מחמם את העכבר לפני ההליך עשויים לשפר את הטכניקה הזו על ידי הגדלת זרימת נוזל מוחי-שדרתי המוח, לצמצם את הזמן הדרוש לאוסף, כפי שמתואר שיטות אחרות,10,11. אבל בפרוטוקול המתוארים כאן, שימש פד חום או התחממות של העכבר והיה בין עכברים ללא קושי בכמות נוזל מוחי-שדרתי. זה יכול להיות שנאספו. בתור דוגמה של היישום שניתן להשתמש בטכניקה זו, נמדדו רמות של Aβ האנושי42 באמצעות אליסה. Aβ ידוע להיות דביק, אפשר לדבוק זכוכית, הצינורות אוסף. ב פרוטוקול זה, נימים זכוכית בורוסיליקט צינורות פוליפרופילן שימשו כדי לאסוף את CSF עכברים. בעוד Aβ מסוימים עשויים לדבוק נימי זכוכית, דפנות הצינורות אוסף, אליסה תוצאות מראים כי רמות Aβ ניתן למדוד (איור 3). בכל זאת, זה אפשרי כי רמות Aβ נמדד מאמצע CSF שליקט פרוטוקול זה הם פחות מזה שתואר על ידי מחקרים אחרים, אבל הנימים זכוכית נחוצים לנקב דרך השכבה הקשה של המוח של העכבר כדי לאסוף את נוזל מוחי-שדרתי. מלבד מדידת Aβ, לחלבונים אחרים עניין גם ניתן למדוד באמצעות נוזל מוחי-שדרתי את אסף.
בעוד השיטה שפורסמו בעבר של CSF אוסף מאת ליו. et al. 10 נועד עבור אוסף רציף של CSF מן החי עכברים, השיטה המתוארת כאן היא עבור האוסף של CSF מן העכברים להקריב בשביל לרקמות וניתוחו. לפיכך, טכניקה זו ניתן להשתמש יחד עם שיטות אחרות לנתיחה לאיסוף רקמות העכבר כפי שהוא משפיע על המוח וחוט השדרה, ואחרי אוסף CSF (דהיינו, לאחר 10-30 דקות במשך ~ 10-15 µL של CSF), צריך העכבר עדיין לנשום, תחת הרדמה. לכן, רקמות אחרות כגון הדם, המוח, חוט השדרה, הכבד הן עדיין שמיש עבור איסוף וניתוח הביוכימי. למרות ליו. et al. שיטת שנאספו CSF מהר מאוד (10 דקות לכל בעכבר על 3-7 µL של CSF), השיטה המתוארת כאן לוקח זמן רב יותר, אבל תוכלו לאסוף CSF עוד10. שיטה נוספת עבור אוסף CSF יש גם תוארה על ידי מאיה. et al. 11 הן ליו. et al. ומתארים מאיה et al. שיטות איסוף CSF מן העכברים על ידי החזקת נימים זכוכית או ג'ל מטעין טיפים ניקב לתוך המלון cisterna. השיטה המתוארת כאן שונה על-ידי תיקון את נימי micromanipulator. פעולה זו מבטיחה כי נימי נשמרת משותק, הקטנת זיהום מדם במהלך האיסוף CSF. Micromanipulator מאפשרת גם עבור יותר דיוק ודיוק, ניקב את מגנה cisterna להשיג נוזל מוחי-שדרתי. למרות השיטה ואח ' מאיה ' היה גם יכול לקבל 15-20 µL של CSF לכל העכבר, זה דורש ניקב את מגנה cisterna שוב ושוב על ידי יד עם ג'ל מטעין טיפים, אשר עלולה להגביר את הסיכון של זיהום דם או רקמות. יתר על כן, מאיה שיטת ואח עשויה להקטין את הלחץ במוח עם כל רציפים ניקב של המלון cisterna כך יש פחות ופחות CSF אספו בכל פעם. השיטה המתוארת כאן כרוכה דקירה אחת בלבד ולהשאיר את נימי ב מגנה cisterna לאסוף עוד יותר CSF כמו זה מתמלאים עם נוזל מוחי-שדרתי, בעוד העכבר נמצא תחת הרדמה. כך, הפרוטוקול המתואר כאן ברציפות אוספת נוזל מוחי-שדרתי וממזערת זיהום אפשרי של דקירות חוזרות לתוך cisterna מגנה את, כמו גם שיבוש הרקמה שמסביב.
עם אוסף גדול של מדגם CSF, טוהר, ניתוח נוסף יכול לשמש עם נוזל זה סיוע נוסף במחקר מדעי המוח. היא ידועה בקרב החוקרים כי האוסף של CSF מן העכברים יכול להיות מייגע ורק מדגם מוגבל ניתן להשיג (בדרך כלל מסר מספר מרבי של 5-7 µL6,7,8,9). בספרות, אין רבים מפורט פרוטוקולים לאור לחילוץ CSF ומשפר לפרוטוקול זה על שיטת שפורסמו בעבר10 כדי לצמצם זיהום מדם, תוך שמירה על האוסף בשפע של CSF. CSF יש יישומים רבים במחקר מדעי המוח, כאחת הנוזלים הקרוב ביותר ברקמות של מערכת העצבים, הוא דוגמה ערך למחקר. זה בעבר זוהתה שיש העכבר למבוגרים הנפח הכולל של µL 40 של CSF12. לכן, פרוטוקול זה הוא יכול לקבל 25% ואולי יותר מהסכום הכולל של CSF עכבר למבוגרים. מלבד העכברים C57BL/6 ו- APP/PS1 זנים המפגרים, המתח outbred החתמה אזור הבקרה (ICR) עכברים גם שימשו בהצלחה לאסוף CSF באמצעות פרוטוקול זה. CSF מן העכברים בגילאים שונים (4 עד 18 חודשים) שנאספו בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה. לכן, צריך להיות שום קושי באיסוף CSF זנים שונים או בגילאים של עכברים בשיטה זו. פרוטוקול מפורט זה בתקווה ישמש על ידי רבים כדי לשפר את ההתפתחות של CSF מבחני וטכניקות אחרות ניתוח כדי לסייע במחקר להבין מחלות ניווניות המשפיעות על המוח ואת חוט השדרה.
זה קריטי כי ראשו של העכבר הידק בחוזקה, אז הוא אינו זז במהלך ניתוח ואת אוסף CSF (סעיף 3 לפרוטוקול). האתר הניקוב הראשונית לתוך המלון cisterna חשוב להשגת שפע, שאינן שזוהמו CSF. כדאי לא להוסיף את נימי קרוב מדי אל כל כלי הדם כדי למנוע זיהום של המדגם שנאספו. יתר על כן, ההתאמה של נימי הוא קריטי עבור אוסף CSF אופטימלית. השימוש micromanipulator מאפשרת כוונון עדין מבלי במידה רבה לשבש את הרקמה שמסביב, מזהם את נוזל מוחי-שדרתי. באמצעות הפקדים בסדר של micromanipulator, נימי ניתן לאט להעביר פנימה או החוצה כדי לאפשר CSF לזרום החוצה מן העכבר ולתוך את נימי לאוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81650110527, 81371400) הלאומי מפתח בסיסי מחקר תוכנית של סין (2013CB530900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer's Dement. , (2016).
- You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
