Summary
Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.
Abstract
Imagerie de calcium (Ca2 +) est un outil puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle de Ca2 + signaux intracellulaires dans les dendrites neuronales. Ca2 + fluctuations peuvent se produire à travers une variété de membrane et mécanismes intracellulaires et jouent un rôle crucial dans l’induction de la plasticité synaptique et la régulation de l’excitabilité dendritique. La capacité d’enregistrer différents types de signaux de Ca2 + en ramifications dendritiques est donc précieuse pour des groupes d’étudier comment dendrites intègrent l’information. L’avènement de la microscopie biphotonique a fait ces études beaucoup plus facile en résolvant les problèmes inhérents à l’imagerie dans les tissus vivants, tels que la diffusion de la lumière et le photovieillissement. En outre, grâce à la combinaison de techniques électrophysiologiques classiques avec deux photons Ca2 + imagerie, il est possible d’étudier Ca2 + fluctuations locales dans les dendrites neuronales en parallèle avec les enregistrements de l’activité synaptique Soma. Nous décrivons ici comment utiliser cette méthode pour étudier la dynamique des locaux Ca2 + transitoires (chats) dans les dendrites des interneurones inhibiteurs GABAergiques. La méthode peut être également appliquée à l’étude dendritiques Ca2 + signalisation dans différents types de neurones dans des tranches de cerveau aiguë.
Introduction
La contribution d’un neurone à l’activité du réseau est en grande partie déterminée par la nature dynamique des entrées synaptiques qu’il reçoit. Traditionnellement, la principale méthode de caractérisation de l’activité synaptique dans les neurones s’est fondé sur les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière somatique des courants postsynaptiques évoqués par stimulation électrique des axones de passage. Toutefois, la seule activité des synapses situées dans la partie proximale est véridiquement signalée dans ce cas1. En outre, afin d’évaluer les mécanismes spécifiques à synapse, enregistrements de paires de neurones et de dendrites à un endroit précis ont été utilisés pour cibler les synapses d’intérêt et les mécanismes d’intégration dendritique, respectivement. Une percée majeure dans le domaine de la physiologie synaptique a été atteint par un mariage des techniques optiques et électrophysiologiques. Excitation biphotonique microscopie à balayage laser (2PLSM) en combinaison avec les outils d’optogenetic et de Ca2 + imagerie peut révéler des détails extraordinaires de l’organisation dynamique de l’activité synaptique à connexions neuronales spécifiques dans des tranches de cerveau dans vitro et in vivo.
Plusieurs avantages principaux faits 2PLSM se démarquer de l’excitation classiques, un photon microscopy2: (1) en raison de la nature non linéaire d’excitation à deux photons, la fluorescence est générée uniquement dans le volume focal, et représentent tous les photons émis signaux utiles (pas besoin de trou d’épingle) ; (2) longueurs d’onde, utilisés en 2PLSM, pénètrent dans les tissus de diffusion plus efficacement ; en outre, les photons dispersés sont trop diluées pour produire l’excitation biphotonique et fluorescence de fond ; (3) le photovieillissement et phototoxicité sont également limités à plan focal. Par conséquent, malgré le coût élevé des systèmes 2 photons par rapport aux microscopes confocaux classiques, la 2PLSM reste une méthode de choix pour enquête à haute résolution de structure neuronale et la fonction dans les tissus vivants épais.
La première application de 2PLSM dans les tissus de diffusion a été à l’image de la structure et la fonction des épines dendritiques3. 2PLSM en combinaison avec Ca2 + imagerie a révélé cette fonction d’épines comme des compartiments isolés biochimiques. Puisque de nombreux types de neurones, il y a une correspondance biunivoque entre les épines et les synapses individuels4, deux photons Ca2 + imagerie bientôt est devenu un outil de reporting de l’activité des synapses individuelles en tissu intact5, 6,7,8. En outre, 2PLSM Ca2 + imagerie a été utilisée avec succès pour surveiller l’activité des canaux calciques unique et les interactions non linéaires entre les conductivités intrinsèques et synaptiques, ainsi que d’évaluer l’État et l’activité dépendante- régulation du Ca2 + signalisation neuronale dendrites5,6,7,8,9,10,11.
Le calcium est un omniprésent second messager intracellulaire, et son organisation spatio-temporelle subcellulaire détermine la direction de réactions physiologiques, de modifications de la force synaptique à la régulation des ions canaux, croissance dendritique et la colonne vertébrale, comme Bien que la mort cellulaire et la survie. Dendritiques Ca2 + élévations se produisent via l’activation de multiples voies. Potentiels d’action (PA), backpropagating pour les dendrites, ouvrir de canaux voltage-dépendants de calcium12 et produire des transitoires relativement globales Ca2 + (chats) dans les dendrites et les épines13. La transmission synaptique est associée à l’activation de postsynaptique Ca2 +-récepteurs perméables (NMDA, Ca2 +-perméable AMPA et kaïnate), déclenchement synaptique chats6,14,15. Enfin, SUPRALINÉAIRE Ca2 + événements peuvent être générés en dendrites sous certaines conditions11,12,13,16.
Deux photons Ca2 + imagerie en combinaison avec les enregistrements électrophysiologiques de patch clamp emploie synthétique Ca2 +-indicateurs fluorescents, qui sont généralement livrés par le biais de l’électrode de patch pendant les enregistrements de cellules entières . Une méthode standard pour la quantification de Ca2 + dynamique repose sur l’indicateur de double méthode17,18. Il utilise deux fluorophores avec des spectres d’émission bien séparées (par exemple, une combinaison d’un rouge Ca2 +-insensible colorant vert Ca2 + indicateurs, tels que l’Oregon vert BAPTA-1 ou Fluo-4) et présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de l’indicateur unique. Tout d’abord, un Ca2 +-colorant insensible est utilisé pour localiser les petites structures d’intérêt (ramifications dendritiques et épines) où l’imagerie2 + Ca sera effectuée. Deuxièmement, le rapport entre la variation de la fluorescence verte et rouge (ΔG/R) est calculé en guise de [Ca2 +], qui est pratiquement insensible aux variations de fluorescence de base en raison de fluctuations [Ca2 +]017 , 18. en outre, les changements de fluorescence peuvent être calibrés en termes absolus, Ca2 + concentration19.
Une préoccupation générale lors de l’exécution de deux photons Ca2 + imageries expériences en tranches aiguës est la cellule santé et la stabilité de l’acquisition d’image en raison de la puissance du laser haute généralement utilisée. En outre, dans les2 + expériences d’imagerie, de Ca on se préoccupe de la perturbation et l’importante surestimation de subcellulaire Ca2 + dynamique dû au fait que servent d’indicateurs de Ca2 + très mobiles exogène Ca2 + mémoires tampons. Ainsi, le choix de l’indicateur de Ca2 + et sa concentration dépend du type neuronal, l’amplitude attendue des chats et la question expérimentale.
Nous avons adapté la méthode biphotonique Ca2 + imagerie pour recherche de Ca2 + fluctuations de dendrites de GABAergique interneurones9,10,11,20,21 , 22. alors que la majeure partie des premiers Ca2 + études d’imagerie ont été effectuées dans les principaux neurones, interneurones inhibiteurs présenter une grande variété de mécanismes2 + Ca fonctionnels qui sont distincts de ceux des cellules pyramidales20 , 23 , 24. ces mécanismes interneurone spécifiques (par exemple, Ca2 + perméables récepteurs AMPA) pourraient jouer un rôle spécifique dans la régulation de l’activité des cellules. Dendritiques Ca2 + signalisation dans des interneurones est une cible tentante pour complément d’enquête, deux photons Ca2 + imagerie dans les dendrites des cellules présente des difficultés supplémentaires, d’un diamètre plus mince des dendrites et manque d’épines pour une particulièrement élevé Ca2 + liaison capacité endogène. Comme nos recherches portent sur l’étude des interneurones hippocampe, le protocole suivant, alors qu’il y a lieu à différentes populations de neurones, a été adapté pour faire face à ces défis.
Ce protocole a été exécuté avec un microscope confocal de deux photons commercial, qui était équipé de deux détecteurs externes, non-descanned (NDDS™), modulateur électro-optique (MOE) et un Dodt balayage dégradé contraste (CGT) et installé sur une table optique. Le microscope a été couplé avec un laser Ti : Sapphire de multiphoton mode bloqué à 800 nm (> 3 W, 140 impulsions fs, 80 Hz fréquence de répétition). Le système d’imagerie était équipé d’une plate-forme d’électrophysiologie standard, y compris une chambre de perfusion avec contrôle de température, une plateforme de traduction avec deux micromanipulateurs, un amplificateur de la microélectrode contrôlé par ordinateur, un numériseur, une stimulation appareil et logiciel d’acquisition de données.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées selon les orientations de bien-être de l’Animal Protection Comité de Université Laval et le Conseil canadien de protection des animaux.
1. préliminaire préparation (facultatif : préparer 1 jour à l’avance)
- Préparer trois types de solution liquide céphalorachidien artificiel (FSCA) (Normal, saccharose et Solutions de récupération, 1 L ; voir tableau 1). Ajuster l’osmolalité des solutions à 300 ± 10 mOsm25 et refroidir le FSCA-Sucrose jusqu'à un point près du point de congélation (0-4 ° C).
Remarque : L’utilisation d’une solution de découpe de faible teneur en sodium (ACSF-saccharose) permet de préserver la viabilité des neurones dans les couches superficielles des tranches aiguë26. - Préparation de 0,75 mL de patch-solution contenant un fluorophore rouge (p. ex., Alexa-594) et un indicateur de calcium synthétique vert (p. ex., Oregon vert BAPTA-1 ; voir tableau 1). Inclure la biocytine (voir tableau 1) dans la solution de patch si post hoc d’identification morphologique des cellules enregistrés est nécessaire.
- Ajuster l’osmolarité de la solution à 280 ± 5 mOsm et pH à 7,35 ± 0,5. Conserver la solution dans le réfrigérateur ou sur la glace en permanence.
Nota : Choix de l’indicateur de calcium doit être fondée sur sa gamme dynamique et sur la nature de l’enquêtés événements2 + Ca. - À l’aide d’un extracteur de micropipette, préparer des pipettes de patch de capillaires en verre borosilicate (voir Table des matières) avec une pointe de 2 µm ≈ (résistance de pipette de MΩ 3-5) et de pipettes de stimulation de capillaires en thêta-verre borosilicaté (voir Table de Matériaux) avec une pointe de 2 à 5 µm.
Remarque : Les paramètres extracteur pour faire des pipettes d’une forme et un diamètre donné seront déterminés par le type de filament extracteur et les résultats de test de rampe pour un type donné de verre.
2. préparation de la tranche hippocampe
- Anesthésier la souris (P13-20 ; la souche et le sexe de la souris est déterminé par la question expérimentale étant adressée) avec 1 mL d’isoflurane, placé sur une serviette en papier dans une chambre de narcose par inhalation. Lorsque l’animal est profondément anesthésié, comme en témoigne d’un manque de mouvement et la respiration lente, retirez-la de la chambre de narcose et décapiter à l’aide d’une guillotine.
- Exposer le crâne en coupant la peau avec une petite paire de ciseaux à l’arrière du crâne vers le nez. Une petite paire de pinces-gouges mini OS permet de faire un trou au niveau du bregma. Puis utilisez les ciseaux pour faire une coupe caudal-à-rostral le long de la suture sagittale. Avec les pinces-gouges saisir l’arrière de chaque lambeau de crâne et ascenseur vers le haut et vers l’extérieur pour enlever le crâne couvrant chaque hémisphère.
- Après que le cerveau est complètement exposé, sapent les nerfs optiques avec une petite spatule. Enlever le cerveau du crâne et la mettre dans une boîte de Pétri contenant continuellement oxygéné, froid ACSF-saccharose (voir le tableau 1 pour la concentration de saccharose).
- Si les tissus des souris âgées est nécessaire, effectuer une perfusion intracardiaque avec une seringue (25G) contenant 20 mL de glacee ACSF-Sucrose avant l’extraction du cerveau pour obtenir des tranches de bonne qualité.
- Préparer des tranches d’hippocampe du cerveau animal extrait.
- Laissez le froid de cerveau pendant environ 2 min. Placez un morceau de papier filtre sur un plat de Pétri sous glace, transférer le cerveau sur le papier filtre. Disséquer les deux hémisphères.
- Coller les hémisphères disséqués (l’orientation est déterminée par l’objectif expérimental pour obtenir des tranches de coronal, transversale, ou horizontale) sur une table vibratome et plongez-le dans le bac de vibratome rempli glacé oxygéné ACSF-saccharose. Faire des tranches épaisses à une température d’environ 1 ° C 300 µm en utilisant un refroidisseur vibratome ou en plaçant la glace autour de la barre d’État vibratome.
- À l’aide d’un pinceau plat, s’accumulent les tranches contenant l’hippocampe (jusqu'à 6 tranches par hémisphère) dans un bain contenant oxygéné ACSF-récupération chauffée à 37 ° C.
- Laissez les tranches dans le bain de l’ACSF-récupération pendant au moins 45 min.
3. enregistrements de Patch-clamp de la cellule entière
- Mise en place dans un bain positionné sous l’objectif d’une tranche de hippocampe (grossissement : 40 x, ouverture numérique : 0,8) d’un microscope biphotonique à balayage laser. Continuellement perfuse le bain oxygéné ACSF-normale chauffé à 30-32 ° C à raison de 2,5 à 3 mL/min.
- Utiliser le contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) ou microscopie Dodt-SGC pour localiser une cellule d’intérêt à l’aide de sa taille, la forme et la position.
Remarque : Selon la population de neurones ciblés, un modèle de souris transgénique permet de localiser facilement les cellules d’intérêt. Dans ce cas, cette étape peut être substituée avec utilisation d’une source lumineuse fluorescente. - Remplir une pipette de stimulation avec une solution de FSCA normale contenant le fluorophore rouge (p. ex., Alexa-594).
- La valeur de la pipette de stimulation (connectée à un appareil de stimulation électrique) sur le dessus de la tranche pour que l’astuce est dans la même région que la cellule d’intérêt.
- Après avoir remplir la pipette solution de patch et en l’attachant à un stade de tête, réglez-le sur la tranche afin que son extrémité soit directement au-dessus de la cellule d’intérêt.
- Insérer une seringue dans un robinet à trois voies et connectez-le à la pipette-à travers le tube en plastique. Injecter une pression positive constante dans la pipette (≈ 0,1 mL) à l’aide de la seringue. Garder le robinet d’arrêt en position « close ».
- Activer le module amplificateur contrôle et passer en mode voltage clamp en cliquant sur le bouton « VC ». Ouvrez le logiciel d’acquisition de données électrophysiologie (p. ex., clampex) pour l’acquisition de signaux électrophysiologiques et cliquez sur l’icône « Membrane Test » de l’avoir continuellement envoient une impulsion de tension carrée (5 mV, 10 ms), qui est nécessaire pour surveiller changements dans la résistance de la pipette.
- Abaissez la pipette jusqu'à ce qu’il est juste au-dessus de la cellule cible. Lors de prise de contact avec la membrane cellulaire, enlever la pression en tournant le robinet d’arrêt en position « ouverte ».
Remarque : Contact avec la membrane cellulaire est détecté lorsqu’une légère augmentation de la résistance de la pipette (≈ 0,2 MΩ) est considéré et une petite échancrure sur la cellule est causée par une pression positive. - Appliquer une légère pression négative à la pipette en utilisant une seringue vide insérée dans le robinet jusqu'à ce que la résistance de la pipette fournie par le logiciel atteigne 1 GΩ. Dans la fenêtre « Membrane Test » du logiciel d’acquisition de données, serrer la cellule à -60 mV.
- Continuent jusqu'à ce que la cellule est ouverte et la configuration de la cellule entière est obtenue en appliquant une pression négative. Détection de cet état de la cellule est basée sur le changement soudain de la résistance de la pipette (à partir de 1 GΩ à MΩ de 70 à 500 selon le type d’interneurones) et l’apparition de forts transitoires capacitifs dans la fenêtre « Membrane ».
4. deux photons Ca2 + imagerie
- Si vous êtes intéressé dans les réponses postsynaptiques excitateurs, ajouter le gabazine de bloqueur du récepteur GABAA (10 µM) et le bloqueur des récepteurs GABAB CGP55845 (2 µM) dans le bain du fsca.
- Dans le module amplificateur contrôle logiciel, définir la configuration de patch à courant-clamp en cliquant sur le bouton « CC » et enregistrer le modèle de mise à feu de la cellule en réponse aux injections somatiques de courant de dépolarisation (0,8 à 1,0 nA, 1 s). Attendez au moins 30 min pour la cellule à remplir avec les indicateurs présents dans la solution de patch.
Remarque : Modèle de mise à feu et les propriétés actives de la cellule peuvent être utilisées pour identifier le sous-type de la cellule ; par exemple, cellules rapide-dopage. Il est important pour la concentration de l’indicateur à stabiliser par l’intermédiaire de diffusion avant de commencer pour enregistrer les chats (voir le tableau 2 pour le dépannage). - Chats évoquée par AP
- En utilisant le logiciel d’acquisition image, commencent à acquérir des images. Localiser une dendrite d’intérêt en utilisant le signal de fluorescence rouge. Afin d’assurer une réponse visible, tout d’abord, choisissez une dendrite proximale (≤ 50 µm) car l’efficacité de rétro-propagation AP peut décliner significativement avec la distance d’interneurones GABAergiques22.
- À l’aide de le « outil de sélection rectangulaire » dans le logiciel d’acquisition image, zoomer sur la région ciblée et passer à la "xt » (IRLS) mode. L’analyse du poste dans l’ensemble de la branche dendritique d’intérêt. Avec les contrôleurs d’intensité laser dans le logiciel d’acquisition, fixer le deux photons laser à un niveau de puissance minimale où fluorescence vert de base est à peine visible, afin d’éviter la phototoxicité.
- Dans le logiciel électrophysiologie d’acquisition données logiciel d’acquisition de fenêtre et de l’image « Protocole », créez un essai d’enregistrement de la durée désirée contenant une injection de courant somatique de l’amplitude souhaitée.
- À l’aide de logiciels d’acquisition de l’image, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » et acquérir la fluorescence en continu pendant 1-2 répéter s. l’acquisition de l’image 3 - 10 fois. Attendez au moins 30 s entre les balayages simples pour éviter le photovieillissement. Si l’acquisition de linescans en plusieurs points le long d’une dendrite, emmenez-les dans un ordre aléatoire pour éviter les effets d’ordre.
- Synapses évoquée par les chats
- Localiser une dendrite d’intérêt en utilisant le signal de fluorescence rouge.
- Définissez la pipette de stimulation sur la surface de la tranche au-dessus de la dendrite d’intérêt. Abaissez lentement la pipette de stimulation en place, réduisant au minimum de mouvement pour ne pas perturber la configuration cellule entière. Placez la pipette à 10 à 15 µm de la dendrite.
- Pour visualiser l’emplacement des microdomaines synaptiques en dendrites d’aspiny, dans le logiciel d’acquisition image, basculez vers le 'xt' mode (IRLS) et positionner la ligne le long de la branche dendritique d’intérêt.
- Dans la fenêtre de « Protocole » (des logiciels d’acquisition de données électrophysiologie) et logiciel d’acquisition image, créer un essai d’enregistrement qui déclenche l’appareil de stimulation après le début du procès.
- En utilisant le logiciel d’acquisition, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » pour scanner le long de la dendrite en continu pendant 1-2 s. Repeat acquisition 3 - 5 fois, attendre 30 s entre les balayages pour prévenir le photovieillissement.
Remarque : La durée de scan peut être ajustée selon la cinétique de la manifestation évoquée, mais devrait être réduite au minimum pour éviter le photovieillissement (voir le tableau 2 pour le dépannage). - Répétez l’étape 4.5.5 dans des conditions différentes (par exemple, différente intensité/durée de la stimulation, l’introduction d’un bloqueur pharmacologique, etc.) selon la question traitée.
- L’acquisition s’arrête lorsque la cellule montre des signes de détérioration de la santé : dépolarisation au-dessous de -45 mV, augmentation du niveau de base niveau2 + Ca, détérioration morphologique des dendrites (p. ex., blebbing, fragmentation ; voir tableau 2 pour le dépannage).
- Pour obtenir des renseignements préliminaires sur la morphologie de la cellule et tenir un registre de l’emplacement de la pipette de stimulation, acquérir une Z -pile de la cellule dans le canal rouge. En utilisant le logiciel d’acquisition dans 'xyz' mode, défini les limites supérieures et inférieures de pile à toute la cellule d’image avec tous les processus inclus. Définir la « taille d’étape » à 1 µm et démarrer l’acquisition de la pile en utilisant le bouton « Démarrer l’enregistrement ».
- Lorsque le Z-acquisition de pile est terminée, utilisez l’option de « projection Maximum » dans le logiciel pour superposer tous les plans d’intervention de la pile et de vérifier la qualité de l’acquisition. Puis, rétracter lentement la pipette sur la tranche.
- Pour corriger la tranche pour identification morphologique post hoc , rapidement enlever la tranche de la baignoire à l’aide d’un pinceau plat et placez-le entre deux papiers filtres, dans un récipient Petri fsca. Remplacer le FSCA avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % et laisser le plat dans une pièce à 4 ° C ou le réfrigérateur une nuit.
5. immunohistochimie pour Post Hoc Identification morphologique des cellules enregistrés
Remarque : Après 1 nuit de fixation en PFA, les tranches peuvent être stockés dans un tampon phosphate (PB) avec azide de sodium (0,5 %) pendant environ 1 mois.
- Mettre les tranches dans une solution saline tampon Tris (TBS) avec Triton X-100 (0,3 %) et d’effectuer 4 lavages (5-10 min chacun).
- Mettre la tranche de SCT-Triton 0,3 % avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h.
- Mettre la tranche de SCT-Triton 0,3 % à 1 %, NGS et un fluorophore conjugué streptavidine (p. ex., Alexa Fluor 546 conjugué streptavidine, 1 : 200) pour la nuit d’incubation.
- Lavez 4 fois (5-10 min) dans les directives du SCT.
- Monter les tranches sur lames de microscope et image à l’aide d’un microscope confocal. Pour avoir une reconstitution de la cellule complète, acquérir un Z-pile (taille d’étape : 1 µm) à l’aide d’un objectif 20 x. Pour l’imagerie une étiquette Alexa-546-conjugués, utilisez qu'un laser à 543 nm et une détection de 515-560 nm filtre choisi.
6. analyse des chats
- Extraire les valeurs de la fluorescence des régions d’intérêt (ROIs) dans les images IRLS depuis les canaux rouge et verts et la moyenne des valeurs des multiples séquences répétées pour chaque condition réduire le bruit.
Remarque : Lors de l’acquisition d’IRLS est effectuée le long de la dendrite, il est possible d’extraire des données de plusieurs ROIs, qui peuvent correspondre à des microdomaines dendritiques (2 à 5 µm), et permettant ainsi l’étude de la compartimentation Ca2 + signal. - Pour chaque ROI, exprimer les changements Ca2 + amplitude comme :
NOTE : Ici G est la valeur de la fluorescence de la couche verte ; G0 est la valeur de fluorescence de base de la couche verte pendant la période de stimulation préalable ; R est la valeur de la fluorescence de la couche rouge18. Comme excitation biphotonique est très localisée et ne génère pas d’une expérience significative, soustraction de fluorescence de fond n’est pas requise.
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Representative Results
En utilisant le protocole présenté ici, nous avons obtenu des chats évoquées par injection de courant somatique et par la stimulation électrique dans les dendrites des interneurones oriens/alveus dans la région CA1 de l’hippocampe. Après patcher un neurone, identifié selon sa forme et sa position, nous avons acquis linescans travers une dendrite proximale en plusieurs points au vu des distances depuis le soma (Figure 1 a). Nous avons observé une diminution de l’amplitude des chats induite par backpropagating APs comme la distance entre le soma a augmenté (l’indicatif du verbe réduite AP amplitude ou baisse dépendant de la distance de distribution des canaux calcium, Figure 1 b). Après l’immunohistochimie (à l’aide de conjugué streptavidine Alexa Fluor 546), nous avons pu récupérer l’étiquetage de la biocytine de la cellule et identifier le neurone enregistré comme une cellule bistratified avec un axone d’occupation strate oriens et stratum radiatum (Figure 1 C). dans la seconde expérience, une pipette de stimulation a été portée à un site distal dendritique. Analyse le long de la dendrite, nous étions alors en mesure d’évaluer l’amplitude des signaux2 + Ca postsynaptiques dans une branche dendritique (Figure 2 a–C) en réponse à une stimulation électrique des axones de passage. Les chats postsynaptiques diffèrent entre voisins microdomaines dendritiques (segment 1 à 6 ; Figure 2D), qui pourrait être associé à une propagation du signal Ca2 + de la zone d’initiation et/ou de différents mécanismes post-synaptiques impliqués.
Figure 1 : Exemple représentatif des transitoires d’évoquée par AP Ca2 + . (A) Maximum projection d’un des deux photons Z-pile (13 µm) d’un interneurone patché rempli de Alexa-594 (20 µM). Lignes blanches indiquent l’emplacement et la longueur de linescans. (B) Traces montrant les chats chez aux endroits indiqués sur la trace d’a. Top montre le train AP court généré par injection de courant somatique lors de l’enregistrement du procès. Échelle de temps est le même sur toutes les traces montrés. (C) Maximum projection d’un confocal Z-pile montrant l’étiquetage de la biocytine de la cellule. S/n : Oriens/Alveus ; PYR : Stratum Pyramidale ; RAD : Stratum Radiatum. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Postsynaptique Ca2 + transitoires induites par une rafale de stimulation électrique (3 stimuli à 100Hz). (A) Maximum projection d’un des deux photons Z-pile (148 µm) montrant un interneurone patché rempli d’Alexa-594. Pointes de flèche blanches pointent vers l’emplacement des bornes axonales dans la couche pyramidale, ce qui suggère que l’interneurone est une cellule de panier. (B) plan focal unique illustrant la branche dendritique où l’électrode de stimulation a été placée. Ligne pointillée montre l’emplacement de l’IRLS montré (C1 et C2). (C) les Images illustrant le résultat d’un balayage linéaire dans le rouge (1 ; Alexa-594 ; 20 µM) et vert (2 ; Oregon Green Bapta-5N ; Canaux de 300 µM). Les images ont été mis en cellule en segments plus petits pour analyser la propagation de la réponse montrant les transitoires Ca2 + (chats) plus de 30 µm. (D) Traces induites dans les segments affichés dans C2. Haut de la page trace indique la réponse de tension à une stimulation électrique au niveau somatique a été enregistrée au cours du procès d’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Solution | Composant | Concentration (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glucose | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-récupération | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glucose | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-saccharose | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glucose | 10 | |
| Saccharose | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-Patch solution basée sur | K+- gluconate | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Sel de phosphocreatin di (tris) | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0,2 | |
| Biocytine | 72 | |
| Alexa-594 | 0,02 | |
| Oregon vert-BAPTA-1 | 0,2 |
Tableau 1 : recettes Solution. Composés et les concentrations des solutions utilisées au cours du protocole.
| Problème | Solution |
| Impossible de patcher neurone sain | Recherchez les signes que les tranches sont en mauvaise santés : ratatinée ou gonflement des cellules, les noyaux visibles, etc.. Dans l’affirmative, jeter les tranches. Vérifiez également la résistance de patch-pipette et l’osmolalité de la solution-patch ; Remplacez-les si les valeurs ne sont pas dans la plage appropriée. |
| Signal de fluorescence des dendrites est faible | Attendre plus longtemps pour la cellule à remplir. Si un obstacle empêche la patch-solution de diffusion dans la cellule, essayez d’appliquer une petite quantité de pression négative dans la pipette. |
| La stimulation électrique n’est pas susciter une réponse Ca2 + | Vérifier la présence d’un artefact dans l’enregistrement électrophysiologique. Cas d’absence, recherchez un court-courts-circuits/stimulant dysfonctionnements. Le cas échéant, augmenter l’intensité de la stimulation ou déplacer la pipette de stimulation plus près la dendrite. Il est à noter que la distance entre l’électrode de stimulation et la dendrite ne doit pas dépasser 8 um pour empêcher directe dépolarisation des dendrites en étudiant les réponses synaptiques. |
| Évoqués signal Ca2 + est trop haute/sature le Ca2 + indicateur | Réduire la puissance du laser. Si le problème persiste dans plusieurs cellules, utilisez un indicateur différent de Ca2 +, avec une plus faible affinité Ca2 +. |
| Signal référence Ca2 + augmente progressivement au cours de l’expérience | Attendre une période plus longue entre les balayages individuels. Si la ligne de base est toujours en augmentation, arrêter acquisition ; Il indique que la santé de la cellule est probablement en déclin. |
| Amplitude du Ca2 + signal diminue lors de l’analyse | Réduit la puissance du laser ou effectuer un zoom arrière (si applicable). |
| Dendrite se fragmente (« blebbing ») après la numérisation | Réduire la puissance du laser ou effectuer un zoom arrière. Si blebbing se limite à la dendrite ciblée, choisissez un autre dendrite et réduit la puissance du laser / zoom arrière. Si plusieurs dendrites sont blebbing, arrêter l’acquisition. |
| Signaux de fluorescence sont « drifting » hors de la ligne de balayage après balayages | Réduire le mouvement dans la tranche en réduisant la vitesse de perfusion du fsca. Avant l’application de correctifs, faire vous ne savez que la tranche est fermement maintenue en place par un filet. |
Tableau 2 : tableau de dépannage. Solutions aux problèmes courants qui peuvent survenir lors d’un Ca2 + expérience d’imagerie.
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Discussion
La méthode présentée ici montre comment la combinaison de deux photons Ca2 + imagerie et électrophysiologie patch clamp peut être utilisée pour l’étude dendritiques Ca2 + la signalisation dans les dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë. Cette méthode permet le suivi des deux locaux Ca2 + élévations évoquées par AP électrique de stimulation ou backpropagating segments dendritiques et somatique réponse de la cellule. Ce qui rend un excellent outil pour étudier comment les différentes parties de l’arbre dendritique intègrent entrées et communiquent avec le soma. Mais étant donné la durée de l’expérience, une attention particulière doit être payé pour la santé de la cellule en limitant l’utilisation de la puissance du laser d’imagerie afin d’éviter le photovieillissement des dendrites. Ceci peut être réalisé également en diminuant le niveau de zoom, diminuant la durée de scan et en augmentant la vitesse de balayage lors de l’acquisition de l’image. Imagerie des dendrites interneurone introduit des difficultés supplémentaires. Comme les dendrites de ces cellules ont sans épines, balayage le long de la dendrite est recommandé pour faciliter la localisation de Ca2 + microdomaines postsynaptiques. En outre, étant donné une haute Ca2 + liaison capacité endogène, Ca2 + élévations en dendrites interneurones sont plus petits et plus lentes que celles générées dans les dendrites des cellules pyramidales. Il faut acquérir plusieurs images IRLS pour établir la moyenne ainsi qu’une durée suffisamment longue de linescans individuelle afin de décrire la cinétique de Ca2 + signal convenablement.
La stimulation électrique locale à l’aide d’électrodes bipolaires thêta-verre représente un outil utile pour la caractérisation des dendritiques post-synaptiques Ca2 + microdomaines. Toutefois, il peut toujours activer différents « en passant » axones situés dans une région donnée. Dans ce cas, le nombre d’entrées activé est inconnu et peut être estimé seulement à l’aide d’outils informatiques supplémentaires. Deux photons glutamate libération27, qui permet une stimulation simultanée de plusieurs synapses individuelles, représente une bonne alternative pour local Ca2 + réactions dendritique. Cette méthode est largement utilisée pour l’étude des cellules principales, qui ont clairement défini les structures postsynaptiques excitateurs (épines), mais n’est pas bien adaptée à l’étude des interneurones, qui ensemble ont une densité faible de colonne vertébrale. Libération de glutamate le long de la dendrite interneurone telle qu’elle est appliquée aux cellules principales serait inévitablement activer plusieurs mécanismes extrasynaptic de Ca2 + 9,10, rendant difficile à interpréter de signalisation du observations.
Au cours de la dernière décennie, percées dans les technologies optiques a offert une résolution temporelle améliorée pour deux photons Ca2 + imagerie. L’un des plus prometteurs est vive microscopie (rampe) par le biais de déflecteurs acousto-optique (ces OD)28,29. Contrairement aux classiques de balayage, rampe analyse certains points d’intérêt à haute fréquence, qui est activée par la vitesse rapide de ces OD exempte d’inertie. Il est idéal pour l’étude simultanée de multiples ramifications dendritiques, car il n’est pas limité aux points énoncés dans un modèle linéaire. Cependant, la résolution temporelle plus élevée offerte par ces OD peut être inutile lorsque l’imagerie Ca2 + des évènements durant des centaines de millisecondes dans le même plan focal. En outre, l’emplacement des points au sein de la structure même de l’intérêt de la numérisation peut être difficile à contrôler en raison de la micro-dérives dans des préparations de tranches associées à un taux de perfusion élevé, ce qui est nécessaire pour la bonne tranche de qualité. La méthode d’acquisition axée sur les IRLS haute résolution temporelle (500-700 Hz) présentée dans cet article est donc toujours préférable quand Ca2 + signaux dans différentes branches dendritiques d’imagerie.
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Disclosures
Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Conseil des instituts de recherche en santé, Sciences naturelles et en génie (subvention à la découverte du CRSNG) et la Fondation Savoy. OC a été soutenu par une bourse de doctorat du CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
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