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Neuroscience

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/56776

Summary

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Abstract

La formazione immagine del calcio (Ca2 +) è un potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di Ca2 + segnali intracellulari nei dendriti neuronali. CA2 + fluttuazioni possono verificarsi attraverso una varietà di meccanismi intracellulari e di membrana e svolgono un ruolo cruciale nell'induzione di plasticità sinaptica e nella regolazione dell'eccitabilità dendritiche. Quindi, la possibilità di registrare diversi tipi di Ca2 + segnali in rami dentritici è preziosa per gruppi studiano come dendriti integrano informazioni. L'avvento della microscopia del due-fotone ha reso tali studi significativamente più facile risolvendo i problemi inerenti all'imaging in tessuto vivo, come ad esempio la dispersione della luce e photodamage. Inoltre, attraverso la combinazione di tecniche elettrofisiologiche convenzionale con due fotoni Ca2 + imaging, è possibile indagare locale Ca2 + le fluttuazioni nei dendriti neuronali in parallelo con le registrazioni di attività sinaptica Soma. Qui, descriviamo come utilizzare questo metodo per studiare la dinamica locale Ca2 + transitori (gatti) nei dendriti di interneuroni inibitori GABAergici. Il metodo può essere applicato anche allo studio dendritiche Ca2 + segnalazione in diversi tipi di un neurone in fettine di cervello acuto.

Introduction

Il contributo di un neurone per attività di rete è in gran parte determinato dalla natura dinamica degli ingressi sinaptici che riceve. Tradizionalmente, il metodo predominante di caratterizzare l'attività sinaptica nei neuroni è invocata da registrazioni di intero-cellula somatica patch clamp di correnti postsinaptiche evocate da stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. Tuttavia, unica attività delle sinapsi prossimalmente trova veritiero è segnalato in questo caso1. Inoltre, per valutare i meccanismi specifici di sinapsi, registrazioni da coppie di neuroni e da dendriti in una posizione specifica sono state utilizzate per indirizzare le sinapsi di interesse e i meccanismi di integrazione dendritiche, rispettivamente. Un importante passo avanti nel campo della fisiologia sinaptica è stato realizzato attraverso un connubio di tecniche ottiche ed elettrofisiologiche. Microscopia (2PLSM) in combinazione con Ca2 + imaging e optogenetica strumenti a scansione laser di eccitazione del due-fotone può rivelare dettagli tremende dell'organizzazione dinamica dell'attività sinaptica alle connessioni neuronali specifiche nelle fette del cervello in vitro ed in vivo.

Parecchi vantaggi chiave ha reso 2PLSM risaltare dalla microscopia convenzionale, uno-fotone eccitazione2: (1) a causa di una natura non lineare del due-fotone eccitazione, la fluorescenza viene generata solo nel volume focale, e rappresentano tutti i fotoni emessi segnali utili (senza bisogno di foro di spillo); (2) lunghezze d'onda, utilizzato in 2PLSM, penetra il tessuto di dispersione in modo più efficiente; Inoltre, sparsi i fotoni sono troppo diluiti per produrre eccitazione del due-fotone e fluorescenza di fondo; (3) photodamage e fototossicità sono limitate al piano focale. Di conseguenza, nonostante l'alto costo dei sistemi di 2 fotoni rispetto ai convenzionali microscopi confocali, il 2PLSM rimane un metodo di scelta per le indagini ad alta risoluzione della struttura neuronale e funzione nel tessuto vivente spessa.

La prima applicazione del 2PLSM nel tessuto di scattering è stato all'immagine della struttura e la funzione delle spine dendritiche3. 2PLSM in combinazione con Ca2 + formazione immagine ha rivelato tale funzione di spine come compartimenti biochimici isolati. Poiché in molti tipi di un neurone c'è una corrispondenza univoca tra spine e singole sinapsi4, due-fotone Ca2 + imaging presto divenne un utile strumento di reporting dell'attività delle singole sinapsi in tessuto intatto5, 6,7,8. Inoltre, 2PLSM-Ca2 + l'imaging basato su è stato usato con successo per monitorare l'attività dei canali del calcio singolo e le interazioni non lineari tra le conduttanze intrinseche e sinaptiche, nonché di valutare lo stato - e attività-dipendente regolamento del Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali5,6,7,8,9,10,11.

Il calcio è un secondo messaggero intracellulare onnipresente, e relativa organizzazione subcellulare spatiotemporal determina la direzione di reazioni fisiologiche, da cambiamenti nella forza sinaptica del regolamento dello ione di canali, crescita dendrite e della colonna vertebrale, come così come la morte delle cellule e la sopravvivenza. Dendritiche Ca2 + quote altimetriche si verificano attraverso l'attivazione di vie multiple. Potenziali di azione (APs), backpropagating per i dendrites, aperto tensione-gated del calcio canali12 e produrre relativamente global Ca2 + transitori (gatti) in dendriti e spine13. Trasmissione sinaptica è associata con l'attivazione di postsinaptica Ca2 +-permeabili recettori (NMDA, Ca2 +-permeabile AMPA e kainato), attivazione sinaptica gatti6,14,15. Infine, gli eventi possono Ca2 + possono essere generati nei dendriti sotto determinate circostanze11,12,13,16.

Si avvale di due fotoni Ca2 + imaging in combinazione con le registrazioni elettrofisiologiche patch clamp sintetico Ca2 +-sensibili indicatori fluorescenti, che in genere sono trasportati attraverso l'elettrodo di patch durante le registrazioni della intero-cellula . Un metodo standard per la quantificazione delle dinamiche2 + Ca è basato sul doppio indicatore metodo17,18. Utilizza due fluorofori con spettri di emissione ben separati (ad esempio, una combinazione di un rosso Ca2 +-insensibile tintura verde Ca2 + indicatori, quali Oregon Green BAPTA-1 o Fluo-4) e ha diversi vantaggi rispetto alla Metodo unico indicatore. Prima di tutto, a Ca2 +-insensibile colorante viene utilizzato per individuare piccole strutture di interesse (rami dentritici e spine) dove verrà eseguita Ca2 + formazione immagine. In secondo luogo, il rapporto tra la variazione di fluorescenza verde e rosso (ΔG/R) viene calcolato come una misura di [Ca2 +], che è in gran parte insensibile ai cambiamenti di fluorescenza della linea di base a causa di fluttuazioni [Ca2 +]017 , 18. Inoltre, i cambiamenti di fluorescenza possono essere calibrati in termini assoluti Ca2 + concentrazioni19.

Una preoccupazione generale durante l'esecuzione di due fotoni Ca2 + imaging esperimenti in fettine acute è la salute delle cellule e la stabilità dell'acquisizione immagine a causa della laser ad alta potenza in genere utilizzata. Inoltre, in esperimenti di Ca2 + imaging, c'è preoccupazione per la perturbazione e sostanza sovrastima del servizio subcellulare2 + dinamiche per Ca dovuta al fatto che fungono da indicatori di Ca2 + altamente mobile esogeno Ca2 + buffer. Così, la scelta dell'indicatore di Ca2 + e la sua concentrazione dipende il tipo di un neurone, l'ampiezza prevista dei gatti e la questione sperimentale.

Abbiamo adattato il metodo di due fotoni Ca2 + imaging per indagine di Ca2 + fluttuazioni nei dendriti dei neuroni GABAergici interneuroni9,10,11,20,21 , 22. mentre la maggior parte del Ca2 + imaging gli studi iniziali sono stati fatti nei neuroni principali, interneuroni inibitori mostrare una varietà grande di Ca2 + meccanismi funzionali che sono distinti da quelli a cellule piramidali20 , 23 , 24. questi meccanismi di Interneurone specifici (ad es., Ca2 + permeabili i recettori AMPA) possono svolgere ruoli specifici nel regolare l'attività delle cellule. Mentre dendritiche Ca2 + segnalazione in interneuroni è un obiettivo allettante per ulteriori indagini, due-fotone Ca2 + imaging nei dendriti di queste cellule presenta sfide aggiuntive, da un diametro più sottile dei dendriti e la mancanza di spine per una particolarmente elevato Ca2 + associazione capacità endogena. Come la nostra ricerca interessi riguardano lo studio di interneuroni hippocampal, il seguente protocollo, mentre applicabili a differenti popolazioni neuronali, è stato adattato per affrontare queste sfide.

Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio a due fotoni confocale commerciale, che era dotato di due rivelatori esterni, non descanned (NDDs), modulatore elettro-ottico (EOM) e un Dodt scansione contrasto sfumatura (SGC) e installato su un tavolo ottico. Il microscopio è stato accoppiato con un laser di multiphoton costituita mode-locking a 800 nm (> 3 W, 140 fs legumi, tasso di ripetizione di 80 Hz). Il sistema di imaging è stato dotato di un impianto di perforazione di elettrofisiologia standard, tra cui una camera di aspersione con controllo della temperatura, una piattaforma di traduzione con due micromanipolatori, un amplificatore microelettrodo computerizzato, un digitalizzatore, una stimolazione unità e software di acquisizione dati.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente agli orientamenti del Comitato di protezione animale Université Laval e del Consiglio canadese su Animal Care sul benessere degli animali.

1. preparazione preliminare (opzionale: preparare 1 giorno in anticipo)

  1. Preparare tre tipi di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) soluzione (normale, saccarosio e soluzioni di recupero, 1L; si veda tabella 1). Regolare l'osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm25 e raffreddare il saccarosio ACSF giù un punto vicino allo zero (0-4 ° C).
    Nota: L'uso di una soluzione di taglio basso-sodio (ACSF-saccarosio) aiuta a preservare la vitalità dei neuroni negli strati superficiali di fettine acute26.
  2. Preparare 0,75 mL di soluzione di patch contenente un fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594) e un indicatore verde sintetico calcio (ad es., Oregon Green BAPTA-1; si veda tabella 1). Includono biocitina (Vedi tabella 1) nella soluzione di patch se post hoc, identificazione morfologica delle cellule registrate è necessario.
  3. Regolare l'osmolarità della soluzione a 280 ± 5 mOsm e pH a 7,35 ± 0,5. Conservare la soluzione in frigorifero o su ghiaccio in ogni momento.
    Nota: Scelta dell'indicatore del calcio dovrebbe essere basata sulla sua gamma dinamica e la natura degli esaminatori Ca2 + eventi.
  4. Utilizzando un estrattore micropipetta, preparare pipette patch dai vasi capillari di vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali) con una punta di 2 µm ≈ (pipetta resistenza di 3-5 MΩ) e stimolazione pipette da capillari di teta-vetro borosilicato (Vedi tabella di Materiali) con una punta di 2-5 µm.
    Nota: Le impostazioni di estrattore per rendere pipette di un determinato diametro e la forma saranno determinate dal tipo di filamento di estrattore e i risultati del test di rampa per un determinato tipo di vetro.

2. hippocampal fetta preparazione

  1. Anestetizzare il mouse (P13-20; il ceppo e sesso del mouse è determinata dalla questione sperimentale affrontata) con 1 mL di isoflurane collocata su un tovagliolo di carta all'interno di una camera di narcosi per inalazione. Quando l'animale è anestetizzato, come evidenziato da una mancanza di movimento e respirazione lenta, rimuoverlo dalla camera di narcosi e decapitare utilizzando una ghigliottina.
  2. Esporre il cranio tagliando la pelle con un piccolo paio di forbici dalla parte posteriore del cranio al naso. Utilizzare un piccolo paio di Pinze ossivore mini osso per fare un buco a livello di bregma. Quindi utilizzare le forbici per fare un taglio caudale--rostrale lungo la sutura sagittale. Con le Pinze ossivore afferrare sul retro di ogni lembo di cranio e ascensore verso l'alto e verso l'esterno per rimuovere il teschio che coprono ogni emisfero.
  3. Dopo che il cervello è completamente esposto, inferiori a quelli dei nervi ottici con una spatolina. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente continuamente ossigenato, freddo ACSF-saccarosio (Vedi tabella 1 per la concentrazione di saccarosio).
    1. Se il tessuto da più vecchi topi è richiesto, eseguire una perfusione intracardiaca usando una siringa (25G) riempita con 20 mL di gelida ACSF-saccarosio prima dell'estrazione del cervello per ottenere fette di buona qualità.
  4. Preparare fette hippocampal del cervello animale estratti.
    1. Posizionare un pezzo di carta da filtro su una piastra di Petri ricco di ghiaccio, trasferire il cervello sulla carta da filtro, lasciare che il freddo di cervello per circa 2 min. Sezionare i due emisferi.
    2. Incollare gli emisferi dissecati (l'orientamento è determinato dallo scopo sperimentale per ottenere fette di coronale, trasversale o orizzontale) su una tabella del vibratome e immergetelo nel vassoio vibratome riempito con gelida ossigenato ACSF-saccarosio. Fare 300 µm fette spesse ad una temperatura di circa 1 ° C utilizzando un dispositivo di raffreddamento del vibratome o mettendo il ghiaccio intorno il vassoio del vibratome.
    3. Utilizzando un pennello piatto, si accumulano le fette contenente l'ippocampo (fino a 6 fette per emisfero) in un bagno contenente ossigenato ACSF-recupero riscaldato a 37 ° C.
    4. Lasciare le fette nel bagno ACSF-recupero per almeno 45 min.

3. cellule intere Patch-clamp registrazioni

  1. Impostare una fetta hippocampal in posto in un bagno posizionato sotto l'obiettivo (ingrandimento: 40x, apertura numerica: 0.8) di un microscopio a due fotoni scansione laser. Irrorare continuamente il bagno con ossigenato ACSF-normale riscaldata a 30-32 ° C a una velocità di 2,5-3 mL/min.
  2. Utilizzare contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC) o microscopia Dodt-SGC per individuare una cella di interesse utilizzando la dimensione, la forma e la posizione.
    Nota: A seconda della popolazione mirata del neurone, un modello di topo transgenico può essere utilizzato per individuare facilmente le celle di interesse. In questo caso, questo passaggio può essere sostituito con l'uso di una fonte di luce fluorescente.
  3. Riempire una pipetta di stimolazione con una soluzione di ACSF-normale che contiene il fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594).
  4. Impostare la pipetta di stimolazione (collegata a un'unità di stimolazione elettrica) sopra la fetta in modo che la punta è nella stessa regione come la cellula di interesse.
  5. Dopo aver compilato la pipetta patch con soluzione di patch e allegarlo ad una fase di testa, impostarlo sulla fetta in modo che la sua punta è direttamente sopra la cella di interesse.
  6. Inserire una siringa un rubinetto a tre vie e collegarlo al patch-pipetta attraverso il tubo di plastica. Iniettare una pressione positiva costante nella pipetta patch (≈ 0,1 mL) usando la siringa. Tenere il rubinetto in posizione "close".
  7. Attivare il modulo di software di controllo amplificatore e passare alla modalità tensione-morsetto cliccando sul pulsante "VC". Aprire il software di acquisizione dati di elettrofisiologia (ad esempio, clampex) per l'acquisizione di segnali elettrofisiologici e cliccare sull'icona "Membrana Test" di averlo continuamente invia un impulso di tensione quadrati (5 mV, 10 ms), che è necessario monitorare cambiamenti nella resistenza pipetta.
  8. Abbassare la pipetta patch fino a quando non è proprio sulla cima della cella mirata. Al momento di fare contatto con la membrana cellulare, rimuovere la pressione ruotando il rubinetto nella posizione "aperta".
    Nota: Il contatto con la membrana cellulare viene rilevato quando un piccolo aumento nella resistenza pipetta (≈ 0.2 MΩ) è visto e una piccola rientranza sulla cella è causata da pressione positiva.
  9. Esercitare una leggera pressione negativa per la pipetta patch usando una siringa vuota nel rubinetto fino a quando la resistenza di pipetta fornita dal software raggiunge 1 GΩ. Nella finestra 'Membrana Test' dei software di acquisizione dati, fissare la cella a -60 mV.
  10. Continuare ad applicare pressione negativa fino a quando la cella viene aperta e la configurazione di cellule intere è raggiunto. Rilevamento di questo stato della cellula si basa sull'improvviso cambiamento nella resistenza pipetta (da 1 GΩ a MΩ 70-500 a seconda del tipo di Interneurone) e la comparsa di grandi capacitivi transitori nella finestra 'Membrana Test'.

4. due-fotone Ca2 + Imaging

  1. Se ti interessa le risposte postsinaptiche eccitatori, aggiungere il gabazine di blocco del recettore GABAA (10 µM) e il blocco del recettore GABAB CGP55845 (2 µM) nel bagno ACSF.
  2. Nel modulo amplificatore software di controllo, impostare la configurazione di patch al corrente-morsetto cliccando sul pulsante "CC" e registrare schema di attivazione della cellula in risposta alle iniezioni somatiche di depolarizzanti corrente (0.8-1.0 nA, 1 s). Aspettare almeno 30 minuti per la cella per essere riempito con gli indicatori presenti nella soluzione patch.
    Nota: Schema di attivazione della cellula e la proprietà attive possono essere utilizzate per identificare il sottotipo della cella; per esempio, cellule fast-chiodare. È importante per la concentrazione di indicatore stabilizzare attraverso diffusione prima di avviare la registrazione gatti (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).
  3. AP-evocato gatti
    1. Utilizzando il software di acquisizione immagini, avviare l'acquisizione delle immagini. Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa. Per garantire una risposta visibile, in primo luogo, scegliere un dendrite prossimale (≤ 50 µm) come l'efficienza di AP backpropagation può diminuire in modo significativo con distanza di interneuroni GABAergici22.
    2. Utilizzando lo strumento rettangolare nel software di acquisizione immagini, ingrandire la regione di destinazione e passare per il "xt" (linescan) modalità. Posizionare la scansione attraverso il ramo dendritico di interesse. Con i controllori di intensità laser del software di acquisizione, è necessario impostare il laser del due-fotone ad un livello di potenza minimo cui fluorescenza verde della linea di base è solo leggermente visibile, per evitare di fototossicità.
    3. Nel software di elettrofisiologia per la acquisizione di dati software di acquisizione di finestra e l'immagine di «Protocollo», creare una registrazione di prova della durata desiderata contenente un'iniezione di corrente somatica dell'ampiezza desiderata.
      1. Utilizzando il software di acquisizione immagini, fare clic sul pulsante "Start record" e acquisire la fluorescenza continuamente per 1-2 s. Ripetere l'acquisizione dell'immagine 3 - 10 volte. Attendere almeno 30 s tra singole scansioni per evitare photodamage. Se l'acquisizione di scansioni in più punti lungo un dendrite, portarli in ordine casuale per evitare effetti di ordine.
  4. Sinapticamente-evocato gatti
    1. Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa.
    2. Impostare la pipetta di stimolazione sulla superficie della fetta sopra il dendrite di interesse. Abbassare lentamente la pipetta di stimolazione in posizione, riducendo al minimo movimento per evitare di disturbare la configurazione di cellule intere. Posizione la pipetta a 10-15 µm dal dendrite.
    3. Per visualizzare la posizione di microdomini sinaptici nei dendriti di Soma, il software di acquisizione immagine passare ai 'xt' (linescan) modalità e posizionare la linea lungo il ramo dendritico di interesse.
    4. Nella finestra 'Protocollo' (di software di acquisizione dati di elettrofisiologia) e software di acquisizione immagini, creare un processo di registrazione che attiva l'unità di stimolazione dopo l'inizio della prova.
    5. Utilizzando il software di acquisizione, fare clic sul pulsante "Start record" per eseguire la scansione lungo dendrite continuamente per 1-2 s. Repeat acquisizione 3 - 5 volte, in attesa di 30 s tra le scansioni per impedire il photodamage.
      Nota: La lunghezza di scansione può essere regolata a seconda della cinetica dell'evento evocati, ma deve essere ridotto al minimo per impedire il photodamage (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).
    6. Ripetere il passaggio 4.5.5 in condizioni diverse (ad esempio, diversa intensità/durata della stimolazione, l'introduzione di un blocco farmacologico, ecc.) a seconda della specifica domanda affrontata.
    7. Interrompere l'acquisizione quando la cella Mostra segni di deterioramento della salute: depolarizzazione sotto -45 mV, aumento della linea di base livello di Ca2 + , deterioramento morfologico dei dendriti (ad es., blebbing, frammentazione; Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).
    8. Per ottenere informazioni preliminari sulla morfologia della cella e tenere traccia della posizione della pipetta stimolazione, acquisire uno Z -stack della cella nel canale del rosso. Utilizzando il software di acquisizione in 'xyz' modalità, impostare i limiti superiore e inferiore dello stack per l'intera cella di immagine con tutti i processi inclusi. Dimensionare la ' passo ' a 1 µm e avvia l'acquisizione dello stack utilizzando il pulsante "Start record".
    9. Quando la Z-stack acquisizione è completo, utilizzare l'opzione di "Proiezione massima" nel software per sovrapporre tutti i piani focali dello stack e verificare la qualità di acquisizione. Quindi, ritirare lentamente la pipetta patch fuori la fetta.
    10. Per correggere la fetta per post hoc, identificazione morfologica, rapidamente rimuovere la fetta dal bagno utilizzando un pennello piatto e posizionarlo tra due fogli di carta filtro, in una capsula di Petri ACSF-riempito. Sostituire il ACSF con una soluzione di paraformaldeide (PFA) di 4% e lasciare il piatto in una camera di 4 ° C o in frigorifero durante la notte.

5. esame immuno-istochimico per Post Hoc identificazione morfologica delle cellule registrate

Nota: Dopo 1 notte della fissazione in PFA, la fetta può essere conservata in tampone fosfato (PB) con sodio azide (0,5%) per fino a 1 mese.

  1. Mettere la fetta in soluzione salina tamponata (TBS) con Triton X-100 (0,3%) ed effettuare 4 lavaggi (5-10 min).
  2. Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 10% siero di capra normale (NGS) per 1 h.
  3. Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 1% NGS ed un fluoroforo streptavidina coniugata (ad es., Alexa Fluor 546-coniugato streptavidina, 1: 200) per incubazione di notte.
  4. Lavare 4 volte (5-10 min) in TBS.
  5. Montare fette su vetrini da microscopio e immagine utilizzando un microscopio confocale. Per una ricostruzione completa delle cellule, acquisire un Z-stack (passo dimensioni: 1 µm) utilizzando un obiettivo 20x. Per l'imaging di un'etichetta di Alexa-546-coniugato, utilizzare che un laser a 543 nm e una rilevazione di 515-560 nm filtro impostato.

6. analisi dei gatti

  1. Estrarre i valori di fluorescenza da regioni di interesse (ROI) nelle immagini linescan dai canali rossi e verde e media dei valori delle ripetizioni multiple per ogni condizione per ridurre il rumore.
    Nota: Quando acquisizione linescan viene eseguito lungo dendrite, è possibile estrarre dati da ROIs multipli, che possono corrispondere a dendritiche microdomini (2-5 µm), e consentendo così lo studio della compartimentazione di segnale Ca2 + .
  2. Per ogni ROI, esprimere le variazioni di Ca2 + ampiezza come:
    Equation
    Nota: Qui G è il valore di fluorescenza dal canale verde; G0 è il valore di fluorescenza di base dal canale verde durante il periodo di pre-stimolazione; R è il valore di fluorescenza dal canale rosso18. Come eccitazione del due-fotone è altamente localizzato e non genera un significativo background, sottrazione di fluorescenza di fondo non è necessario.

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Representative Results

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo ottenuto gatti evocati mediante iniezione di corrente somatica e da stimolazione elettrica nei dendriti di oriens/alveus interneuroni nella zona CA1 dell'ippocampo. Dopo la patch di un neurone, identificato basata sulla sua forma e la posizione, abbiamo acquisito scansioni attraverso un dendrite prossimale in più punti al dato Distanze dal soma (Figura 1A). Abbiamo osservato una diminuzione dell'ampiezza dei gatti indotta da backpropagating APs come la distanza dal soma aumentato (indicativo di ridotta ampiezza AP o un declino di distanza-dipendente nella distribuzione del canale del calcio, Figura 1B). Dopo esame immuno-istochimico (utilizzando streptavidina-coniugati Alexa Fluor 546), siamo stati in grado di recuperare l'etichettatura biocitina della cella e identificare il neurone registrato come una cella di bistratified con un assone che occupa strato oriens e strato radiato (Figura 1 C). nel secondo esperimento, una pipetta di stimolazione è stata portata a un sito dendritico distale. La scansione lungo dendrite, quindi siamo stati in grado di valutare l'ampiezza dei postsinaptica Ca2 + segnali in un determinato ramo dendritico (Figura 2AC) in risposta a stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. I gatti postsinaptici differivano tra vicini dendritiche microdomini (segmento 1 a 6; Figura 2D), che potrebbe essere associato con uno spread di Ca2 + segnale dalla zona dell'iniziazione e/o differenti meccanismi postsinaptici.

Figure 1
Figura 1: Esempio rappresentativo di transitori di AP-evocato Ca2 + . (A) massima proiezione di una due-fotone Z-pila (13 µm) di un interneurone patchato riempito con Alexa-594 (20 µM). Linee bianche indicano la posizione e la lunghezza delle scansioni. (B) tracce mostrando i gatti hanno suscitati nei punti indicati in traccia di A. Top Mostra il treno di AP breve generato attraverso l'iniezione di corrente somatica durante la registrazione di prova. Scala temporale è la stessa su tutte le tracce mostrate. (C) massimo proiezione di confocal Z-stack mostrando l'etichettatura biocitina della cella. O/a: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Strato radiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Postsinaptica Ca2 + transitori evocate da una raffica di stimolazione elettrica (3 stimoli a 100 Hz). (A) massima proiezione di una due-fotone Z-stack (148 µm) mostrando un interneurone patchato riempito con Alexa-594. Punte di freccia bianche punti al percorso di axonal terminali all'interno dello strato piramidale, suggerendo che l'interneurone è una cella di cestino. (B) singolo piano focale che illustrano il ramo dendritico dove è stato posizionato l'elettrodo di stimolazione. Linea tratteggiata indica la posizione di linescan mostrato in (C1 e C2). (C) immagini che illustrano il risultato di un linescan in rosso (1; Alexa-594; 20 µM) e verde (2; Oregon verde Bapta-5N; Canali di 300 µM). Le immagini sono state cestinate in segmenti più piccoli per analizzare la diffusione della risposta oltre 30 µm. (D) tracce risultati transitori Ca2 + (gatti) suscitate nei segmenti visualizzati in C2. Traccia superiore mostra la risposta in tensione alla stimolazione elettrica registrata a livello somatico durante il processo di imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzione Componente Concentrazione (mM)
ACSF-normale NaCl 124
KCl 2.5
NaH2PO4 1.25
MgSO4 2
NaHCO3 26
Glucosio 10
CaCl2 2
ACSF-recupero NaCl 124
KCl 2.5
NaH2PO4 1.25
MgSO4 3
NaHCO3 26
Glucosio 10
CaCl2 1
ACSF-saccarosio KCl 2
NaH2PO4 1.25
MgSO4 7
NaHCO3 26
Glucosio 10
Saccarosio 219
CaCl2 1
K+-Patch soluzione basata su K+- gluconato 130
HEPES 10
MgCl2 2
Sale di (tris) phosphocreatin 10
ATP-Tris 2
GTP-Tris 0.2
Biocitina 72
Alexa-594 0,02
Oregon Green-BAPTA-1 0.2

Tabella 1: ricette soluzione. Composti e le concentrazioni per soluzioni utilizzate durante il protocollo.

Problema Soluzione
Grado di patch neurone sano Controllo per i segni che le fette sono malsane: rimpicciolito o gonfiore delle cellule, i nuclei visibili, ecc. In questo caso, eliminare le fette. Inoltre di verificare la resistenza di patch-pipetta e osmolarità della soluzione patch; sostituirli se i valori non sono nell'intervallo appropriato.
Segnale di fluorescenza da dendriti è basso Aspettare a lungo per la cella riempire. Se un ostacolo è mantenendo la patch-soluzione da diffondere nella cellula, tenta di applicare una piccola quantità di pressione negativa in patch-pipetta.
Stimolazione elettrica non è che evoca una risposta di Ca2 + Verificare la presenza di un manufatto nella registrazione elettrofisiologica. Se assente, Cerca un corto-circuito/stimolando malfunzionamento unità. Se presenti, aumentare l'intensità di stimolazione o spostare la pipetta di stimolazione più vicino dendrite. Deve essere notato che la distanza tra l'elettrodo di stimolazione e il dendrite non deve superare 8 um per impedire la depolarizzazione diretta dei dendrites quando studiare risposte sinaptiche.
Evocati Ca2 + segnale è troppo alto/satura il Ca2 + indicatore Ridurre la potenza del laser. Se il problema persiste in più celle, utilizzare un indicatore diverso del Ca2 +,
con una minore affinità del Ca2 +.
Segnale Ca2 + basale sta gradualmente aumentando durante l'esperimento Attendere un periodo più lungo tra scansioni individuali. Se la previsione è ancora in aumento, interrompere
acquisizione; indica che la salute della cellula probabilmente sta declinando.
Ampiezza del Ca2 + segnale diminuisce durante le scansioni Ridurre la potenza del laser o zoom out (se applicabile).
Dendrite è la frammentazione ("blebbing") dopo la scansione Ridurre la potenza del laser o eseguire lo zoom indietro. Se blebbing è limitato a dendrite mirato, scegliere un altro dendrite e ridurre la potenza del laser / zoom indietro. Se più dendriti blebbing, smettere di acquisizione.
Segnali di fluorescenza sono "drifting" fuori dalla linea di scansione dopo spazza Movimento nella fetta riducendo la velocità di perfusione ACSF. Prima patch, fare
sono sicuro che la fetta è fortemente fissata mediante una rete.

Tabella 2: risoluzione dei problemi tabella. Soluzioni ai problemi più comuni che possono sorgere durante un Ca2 + esperimento di imaging.

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Discussion

Il metodo illustrato di seguito viene illustrato l'utilizzo della combinazione del due-fotone Ca2 + imaging ed elettrofisiologia di patch-clamp per lo studio dendritiche Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto. Questo metodo consente per il monitoraggio di entrambi i locali Ca2 + prospetti evocati da AP elettrici di stimolazione o backpropagating in segmenti dendritiche e risposta somatica della cella. Questo lo rende un ottimo strumento per studiare come le varie parti dell'albero dendritico integrano ingressi e comunicano con il soma. Ma data la lunghezza dell'esperimento, particolare attenzione deve essere pagato per la salute delle cellule limitando l'uso di potere del laser per l'imaging in modo da evitare il photodamage di dendriti. Questo può essere ottenuto anche diminuendo il livello di zoom, fare diminuire la durata della scansione, e aumentando la velocità di scansione durante l'acquisizione di immagini. Imaging dei dendrites Interneurone introduce ulteriori sfide. Come dendriti di queste cellule non sono spine, scansione lungo dendrite è consigliabile per facilitare la localizzazione di Ca2 + microdomini postsinaptici. Inoltre, dato un'alto Ca2 + associazione capacità endogena, Ca2 + aumenti nei dendriti Interneurone sono più piccoli e più lento rispetto a quelli generati in dendriti delle cellule piramidali. Ciò richiede l'acquisizione di diverse immagini di linescan per una media di oltre una durata sufficientemente lunga di scansioni individuali al fine di descrivere in modo appropriato la cinetica di segnale Ca2 + .

La stimolazione elettrica locale con elettrodo bipolare Teta-vetro rappresenta un utile strumento per la caratterizzazione di Ca2 + microdomini postsinaptici dendritiche. Tuttavia, si può ancora attivare diversi "en passant" assoni si trovano in una determinata regione. In questo caso, il numero di ingressi attivati è sconosciuto e può essere valutato solo con ulteriori strumenti computazionali. Due-fotone glutammato uncaging27, che consente per la stimolazione simultanea di più singole sinapsi, rappresenta una buona alternativa per suscitare dendritiche Ca2 + risposte locali. Questo metodo è ampiamente usato per lo studio delle cellule principali, che hanno chiaramente definito strutture postsinaptici eccitatori (spine), ma non è adatto allo studio di interneuroni, che nel complesso hanno una densità bassa della spina dorsale. Uncaging glutammato lungo dendrite Interneurone come viene applicato alle cellule principali sarebbe inevitabilmente attivare meccanismi multipli extrasynaptic di Ca2 + segnalazione9,10, rendendo difficile l'interpretazione del osservazioni.

Nell'ultimo decennio, i progressi nelle tecnologie ottiche offerto una migliore risoluzione temporale per due-fotone Ca2 + imaging. Uno dei più promettenti è la microscopia ad accesso casuale (rampa) attraverso deflettori acusto-ottico (ordinatori)28,29. A differenza dei convenzionali raster di scansione, rampa scansioni selezionati punti di interesse ad alta frequenza, che è attivata per la velocità veloce di ordinatori privo di inerzia. È ideale per lo studio simultaneo di più rami dentritici, dato che non è limitata ai punti disposti in un modello lineare. Tuttavia, la maggiore risoluzione temporale offerta dall'od può essere inutile quando la formazione immagine di Ca2 + eventi che durano centinaia di millisecondi all'interno dello stesso piano focale. Inoltre, la posizione di punti all'interno della stessa struttura di interesse di scansione può essere difficile da controllare a causa di micro-derive nelle preparazioni di fetta associati con un tasso di alta perfusione, che è necessario per la fetta di buona qualità. Quindi, il metodo di acquisizione basato su linescan alta risoluzione temporale (500-700 Hz) presentato in questo articolo è ancora preferibile quando Ca2 + segnali in singoli rami dentritici di imaging.

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Disclosures

Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio canadese istituti di ricerca sulla salute, scienze naturali e ingegneria ricerca (NSERC Discovery Grant) e la Fondazione di Savoia. OC è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato di ricerca da NSERC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Strain: Mouse CD1 Charles River 022
Isoflurane AbbVie Corporation 0B506-099
CGP 55845 hydrochloride Abcam ab120337
Calcium chloride  Sigma-Aldrich C4901
D-(+)-Glucose  Sigma-Aldrich G8270
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Magnesium chloride  Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Paraformaldehyde powder, 95% Sigma-Aldrich 158127
Potassium chloride  Sigma-Aldrich P3911
Potassium gluconate  Sigma-Aldrich P1847
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S8875
Sodium chloride  Sigma-Aldrich S5886
Sucrose  Sigma-Aldrich S9378
Triton X-100  Sigma-Aldrich T9284
Trizma base  Sigma-Aldrich T1503
Trizma hydrochloride  Sigma-Aldrich T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 71643

Sodium phosphate monobasic
monohydrate 
Sigma-Aldrich S9638
Biocytin Sigma-Aldrich B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide ThermoFisher Scientific A10438
SR95531 (Gabazine)  Abcam ab120042

Adenosine triphosphate (ATP)-Tris
Sigma-Aldrich A9062

Guanosine (GTP)-Na+
Sigma-Aldrich G8877

Oregon Green BAPTA-1
ThermoFisher Scientific O6812

Phosphocreatine di(tris) salt
Sigma-Aldrich P1937

Streptavidin-conjugated Alexa-546
ThermoFisher Scientific S11225

Patch Borosilicate Glass Capillaries
World Precision Instruments 1B100F-4

Theta Borosilicate Glass Capillaries
Sutter Instrument BT-150-10

P-97 Flaming/Brown Micropipette puller
Sutter Instrument

TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope
Leica Microsystems

Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser 
Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software Leica Microsystems

Temperature Controller TC-324B
Warner Instruments

MultiClamp 700B Amplifier
Molecular Devices

Digidata 1440A Digitizer
Molecular Devices

Confocal Translator
Siskiyou

Micromanipulator
Siskiyou

pClamp Data Acquisition Software
Molecular Devices

A365 Constant Current Stimulus Isolator
World Precision Instruments

Vibraplane Optical Table
Kinetic Systems

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References

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Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello
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Camiré, O., Topolnik, L. Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices. J. Vis. Exp. (133), e56776, doi:10.3791/56776 (2018).

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