Summary
Мы представляем метод, объединяющий поклеточного фиксации записи и два Фотон изображений для записи Ca2 + переходные процессы в нейрональных дендритов в острой мозга ломтиками.
Abstract
Кальций (Ca2 +) изображений является мощным инструментом для изучения пространственно-временных динамика внутриклеточных Ca2 + сигналов в нейрональных дендритов. CA2 + колебания могут возникать через различные мембраны и внутриклеточных механизмов и играть решающую роль в индукции синаптической пластичности и регулирование дендритных возбудимости. Следовательно возможность записи различных типов Ca2 + сигналов в дендритных филиалов является ценным для групп, изучая, как дендриты интегрировать информацию. Появление двух Фотон микроскопии сделал такие исследования значительно проще, решая проблемы, присущие изображений в живой ткани, такие как рассеяние света и фотоповреждения. Кроме того через сочетание обычных электрофизиологических методов с двух Фотон Ca2 + изображений, можно исследовать местные Ca2 + колебания в нейрональных дендритов параллельно с записями синаптической активности в Сома. Здесь мы опишем, как использовать этот метод для изучения динамики местных Ca2 + транзиентов (кошки) в дендриты ингибирующее интернейронов ГАМК. Этот метод может применяться также к изучению дендритных Ca2 + сигнализации в различных типов нейронов в острой мозга ломтиками.
Introduction
Вклад нейрона для сетевой активности во многом определяется динамичный характер синаптических входов, которые он получает. Традиционно преобладает метод характеризации синаптической активности нейронов полагались на записи соматических поклеточного патч зажим постсинаптических токов, вызываемые электрической стимуляции аксонов прохода. Однако только активность проксимально расположен синапсы правдиво сообщили в этом случае1. Кроме того для оценки СИНАПС конкретные механизмы, записи из пар нейронов и дендритов в определенном месте использовались для целевой синапсы интерес и механизмы дендритных интеграции, соответственно. Крупным прорывом в области физиологии синаптических была достигнута через брак оптических и электрофизиологических методов. Двух Фотон возбуждения лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM) в сочетании с Ca2 + изображений и optogenetic инструменты можно выявить огромный детали динамической организации синаптической активности на конкретных нейрональных связей в ломтики мозга в in vitro и в естественных условиях.
Несколько ключевых преимуществ сделал 2PLSM выделяется из обычных, один фотон возбуждения микроскопии2: (1) вследствие нелинейного характера возбуждения двух фотонов, флюоресценция генерируется только в том фокуса, а представляют всех излучаемых фотонов полезных сигналов (нет необходимости для обскуры); (2) больше волн, используемых в 2PLSM, проникать в ткани рассеяния более эффективно; Кроме того рассеянных фотонов слишком разреженных производить два Фотон возбуждения и фон флуоресценции; (3) фотоповреждения и Фототоксичность также ограничены в фокальной плоскости. Таким образом несмотря на высокую стоимость 2-фотонных систем по сравнению с обычными конфокальные микроскопы, 2PLSM по-прежнему является методом выбора для высокого разрешения исследования нейронов структуры и функции в густой живой ткани.
Первое применение 2PLSM в тканях рассеяния было изображение структуры и функции дендритных шипиков3. 2PLSM в сочетании с Ca2 + изображений показал что колючки функции как биохимические изолированных отсеков. Поскольку во многих типов нейронов существует однозначное соответствие между шипами и отдельных синапсы4, два Фотон Ca2 + изображений вскоре стал полезным инструментом отчетности деятельности отдельных синапсов в неповрежденной ткани5, 6,,78. Кроме того на основе 2PLSM Ca2 + изображений был успешно используется для мониторинга активности одного кальциевых каналов и нелинейных взаимодействий между внутренней и синаптическую проводимости, а также для оценки состояния и активности зависит от регулирование Ca2 + сигнализации в нейрональных дендритов5,6,,78,9,10,11.
Кальций является вездесущий внутриклеточных второй messenger, и его субцеллюлярные пространственно-временных организация определяет направление физиологических реакций, от изменений в синаптической силы к регулированию Ион каналы, роста дендритов и позвоночника, как а также гибель клеток и выживания. Дендритных Ca2 + фасады происходят через активацию нескольких путей. Потенциалы действия (APs), backpropagating к дендритов, открыть напряжения закрытый кальций каналы12 и производят относительно глобальной Ca2 + транзиентов (кошки) в дендритов и колючки13. Синаптической передачи связан с активацией постсинаптических Ca2 +-проницаемой рецепторов (NMDA, Ca2 +-проницаемой АМПА и kainate), вызывает синаптических кошки6,14,15. Наконец supralinear Ca2 + события могут быть созданы в дендриты при определенных условиях11,12,13,16.
Двух Фотон Ca2 + изображений в сочетании с патч зажим электрофизиологических записей использует синтетический Ca2 +-чувствительных люминесцентные Индикаторы, которые доставляются через электрод патч во время записи поклеточного . Стандартный метод для количественной оценки Ca2 + динамики на основе двойной индикатор метод17,18. Он использует два флуорофоров с хорошо разделенных спектры выбросов (например, сочетание красного Ca2 +-нечувствительным краска с зеленым Ca2 + индикаторы, такие как Орегон Грин BAPTA-1 или Fluo-4) и имеет ряд преимуществ по сравнению с единый индикатор метод. Во-первых, Ca2 +-нечувствительным краска используется для обнаружения небольших структур интерес (дендритных филиалов и колючки) где будет выполняться Ca2 + изображений. Во-вторых отношение между изменением в зеленой и красной флуоресценцией (ΔG/R) вычисляется как мера [Ca2 +], который является в значительной степени нечувствительны к изменения в базовых флуоресценции колебаниями в [Ca2 +]017 , 18. Кроме того, изменения флюоресценции может быть откалиброван с точки зрения абсолютной Ca2 + концентрации19.
Общая озабоченность при выполнении двух Фотон Ca2 + изображений эксперименты в острых фрагментов является здоровье клеток и стабильность захвата изображений из-за высокой лазерной энергии обычно используется. Кроме того в Ca2 + изображений экспериментов, существует озабоченность по поводу возмущений и существенной переоценки субцеллюлярные Ca2 + динамики, с тем, что Ca2 + индикаторы действовать как Высокомобильные внешних Ca2 + буферы. Таким образом выбор Ca2 + индикатор и его концентрация зависит от нейронов типа, ожидаемого амплитуда кошек и экспериментальной вопрос.
Мы адаптировали метод двух Фотон Ca2 + изображений для расследования Ca2 + колебаний в дендриты ГАМК интернейронов9,10,11,20,21 , 22. в то время как основная часть ранних Ca2 + тепловизионные исследования были сделаны в главных нейронов, тормозящий интернейронов продемонстрировать большое разнообразие функциональных Ca2 + механизмов, которые отличаются от тех, кто в пирамидальных клеток20 , 23 , 24. Эти межнейронного конкретные механизмы (например, Ca2 + проницаемых АМПА рецепторов) могут играть конкретную роль в регулировании клеточной активности. Хотя дендритных Ca2 + сигнализации в интернейронов заманчиво мишенью для дальнейшего расследования, два Фотон Ca2 + изображений в дендриты этих клеток представляет дополнительные проблемы, от тонкого диаметра дендритов и отсутствием шипов для особенно высокой эндогенного Ca2 + связывающая способность. Как наши исследовательские интересы сосредоточиться на изучении гиппокампа интернейронов, следующий протокол, в то время, как это применимо к различных нейрональных популяций, была адаптирована для решения этих проблем.
Этот протокол был казнен с коммерческой Конфокальный микроскоп двух фотонов, который был оборудован двумя внешними, не descanned детекторы (NDDs), электро оптический модулятор (МНВ) и Dodt, сканирование градиент контрастности (SGC) и установлен на таблицы оптики. Микроскоп был увязан с титан-сапфировый лазер multiphoton locked режиме на 800 Нм (> 3 Вт, 140 fs импульсов, частота следования импульсов 80 Гц). Система электронного фотографирования была оснащена стандартным электрофизиологии Рог, включая камеру перфузии с контроля температуры, перевод платформы с двумя микроманипуляторы, управляемая компьютером микроэлектродные усилитель, дигитайзера, стимуляции подразделение и программное обеспечение для сбора данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими животных животных защиты Комитет Университет Лаваля и Канадского совета по лечению животных.
1. Предварительная подготовка (необязательно: заранее подготовить 1 день)
- Подготовка трех видов искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) решения (нормальный, сахароза и восстановления решения, 1 Л; см. таблицу 1). Отрегулируйте осмотического давления решения до 300 мОсм ± 1025 и прохладный фаго-сахароза до точки вблизи замерзания (0-4 ° C).
Примечание: Использование низким содержанием натрия режущего раствора (фаго-сахароза) помогает сохранить жизнеспособность нейронов в поверхностных слоях острых фрагментов26. - Подготовить 0,75 мл раствора патч, содержащий красный Флюорофор (например, Alexa-594) и индикатор зеленый синтетический кальция (например, Орегон Грин BAPTA-1; см. таблицу 1). Включить biocytin (см. таблицу 1) в патч решение, если требуется должность Специального морфологической идентификации зарегистрированных клеток.
- Отрегулируйте осмотического давления решение 280 ± 5 мОсм и pH до 7.35 ± 0,5. Держите раствор в холодильнике или на льду во все времена.
Примечание: Выбор индикатора кальция должен основываться на динамический диапазон и о природе исследуемого Ca2 + событий. - С помощью съемника микропипеткой, подготовьте патч пипетки из боросиликатного стекла капилляров (см. Таблицу материалы) с наконечником 2 мкм ≈ (Пипетка сопротивление MΩ 3-5) и стимуляции пипетки из капилляров тета Стекло боросиликатное (см. таблицы Материалы) с наконечником 2-5 мкм.
Примечание: Съемник параметров, чтобы сделать пипетки данного диаметра и формы будут определяться съемник накаливания типа и рамп результаты теста для данного типа стекла.
2. гиппокампа ломтик подготовка
- Анестезировать мыши (P13-20; напряжение и секс мыши определяется экспериментально вопрос) с 1 мл раствора изофлюрановая помещен на бумажное полотенце в камеру ингаляционного наркоза. Когда животное глубоко под наркозом, что подтверждается отсутствием движения и медленное дыхание, удалите его из камеры для наркоза и обезглавить с помощью гильотины.
- Разоблачить черепа путем разрезания кожи с парой небольших ножницы от задней части черепа на нос. Используйте пару небольших мини-кости rongeurs сделать отверстие на уровне bregma. Затем используйте ножницы сделать хвостового в ростральной разрез вдоль Сагиттальный шов. С rongeurs понять задней части каждого черепа лоскут и Лифт вверх и наружу удалить черепа, охватывающих каждое полушарие.
- После того, как мозг полностью разоблачил, подрезать зрительных нервов с небольшой лопаткой. Удаление мозга от черепа и положить его в чашку Петри, содержащие непрерывно кислородом, холодная фаго-сахароза (см. таблицу 1 для концентрации сахарозы).
- Если требуется ткани от старых мышей, выполняют внутрисердечной перфузии, с помощью шприца (25 Г) заполнены с 20 мл ледяной фаго-сахароза до мозга извлечения для получения хорошего качества ломтиками.
- Подготовьте гиппокампа фрагменты из извлеченного животных мозга.
- Пусть мозга холод для около 2 мин место кусок фильтровальной бумаги на льду Упакованные Петри блюдо, передачи мозг на фильтровальную бумагу. Проанализируем две полусферы.
- Клей расчлененных полушарий (ориентация определяется экспериментальная цель получения корональный, поперечные, или Горизонтальные срезы) на vibratome таблицу и погрузите его в лоток vibratome, наполненный ледяной кислородом фаго-сахароза. Сделайте толстыми ломтиками около 1 ° c при температуре 300 мкм с помощью vibratome кулер или размещения льда вокруг vibratome лоток.
- С помощью плоской кистью, накапливаются фрагменты, содержащие гиппокампа (до 6 ломтиков в полушарии) в ванну, содержащий кислородом фаго-восстановление подогретой до 37 ° C.
- Оставьте ломтики в ванне фаго-восстановления по крайней мере 45 мин.
3. поклеточного фиксации записи
- Установите ломтиком гиппокампа в место в ванне под цели (увеличение: 40 x, числовая апертура: 0,8) микроскопа два фотона лазерного сканирования. Постоянно perfuse ванны с кислородом фаго-нормальный нагревают на 30-32 ° C со скоростью 2,5-3 мл/мин.
- Использование инфракрасной дифференциальной помехи контраст (IR-DIC) или Dodt-SGC микроскопии найти ячейку интерес, используя его размер, форму и положение.
Примечание: В зависимости от населения целевых нейрон, трансгенные мыши модель может использоваться легко найти клетки интереса. В этом случае этот шаг может быть заменен с использованием флуоресцентных источника света. - Заполните стимуляции пипетки с фаго-нормальный раствор, содержащий красный Флюорофор (например, Alexa-594).
- Установите стимуляции пипеткой (подключенных к единице электрической стимуляции) поверх фрагмента так, что кончик пера находится в том же регионе как клетки интереса.
- После заполнения пипеткой патч патч раствором и присоединения его к главный этап, установите его на срез таким образом, чтобы его кончик непосредственно над ячейкой интерес.
- Вписывается кран трехходовой шприц и подключить его к патч пипеткой через пластиковую трубку. Привнести постоянным положительным давлением в пипетку патч (≈ 0,1 мл) с помощью шприца. Держите кран в положение «закрыть».
- Активируйте модуль программного обеспечения управления усилителя и переключитесь в режим напряжения фиксатор, нажав на кнопку «ВК». Откройте электрофизиологии сбора данных (например, clampex) для приобретения электрофизиологических сигналов и нажмите на значок «Мембраны тест» чтобы он постоянно отправлять квадратных напряжение импульса (5 МВ, 10 мс), которая необходима для мониторинга изменения в пипетку сопротивления.
- Понизить патч пипетку до тех пор, пока это прямо на вершине целевой ячейки. После изготовления свяжитесь с клеточной мембраны, удалить давления, повернув кран в положение «открыто».
Примечание: Контакт с клеточной мембраны обнаружен, когда небольшое увеличение сопротивления пипетки (≈ 0,2 MΩ) рассматривается и небольшой отступ на cell вызвано положительным давлением. - Приложите небольшое отрицательное давление в пипетку патч, используя пустой шприц, вписывается кран до тех пор, пока сопротивление пипетки, предоставляемые программного обеспечения достигнет 1 GΩ. В окне «Мембраны Test» программного обеспечения сбора данных, зажим ячейки на -60 МВ.
- Продолжать применять отрицательное давление до тех пор, пока ячейка будет открыт и достигается поклеточного конфигурации. Обнаружение этой ячейке государства основана на внезапные изменения в пипетку сопротивления (от 1 GΩ в MΩ 70-500 в зависимости от типа межнейронного) и появление большой емкостный переходные процессы в окне «Мембраны Test».
4. два Фотон Ca2 + изображений
- Если вы заинтересованы в возбуждающих постсинаптических ответы, добавьте ГАМК-А рецепторов блокатор gabazine (10 мкм) и блокатора рецепторов ГАМКB CGP55845 (2 мкм) в бане фаго.
- В усилитель модуль управления программного обеспечения, настройки патч для тока зажим, нажав на кнопку «CC» и запишите шаблон ячейки стрельбы в ответ на соматические инъекции расшатывания ток (0,8-1,0 nA, 1 s). Подождите, по крайней мере 30 минут для ячейки, чтобы быть заполнены с показателями в патч решения.
Примечание: Клетки стрельбы шаблон и активные свойства может использоваться для идентификации ячейки подтип; например, быстро пики клетки. Это важно для показателя концентрации стабилизировать посредством диффузии перед началом записи кошек (см. таблицу 2 для устранения неполадок). - AP-вызвала кошки
- С помощью программного обеспечения получения изображений, начало получения изображений. Найдите дендритов интерес с помощью красной флуоресценцией сигнала. Для обеспечения видимой реакции, во-первых, выберите проксимальной дендритов (≤ 50 мкм) как эффективность АП метод обратного распространения ошибки может значительно снижаться с расстоянием в ГАМК интернейронов22.
- Использование «прямоугольного инструмента в приобретение изображений программное обеспечение, масштаб целевого региона и перейти к «xt» (linescan) режим. Позиция сканирования через дендритных филиал интерес. С контроллерами интенсивности лазера в приобретении программного обеспечения установите два фотона лазерного уровня минимальной мощности, где базовые зеленой флуоресценцией чуть видно, чтобы избежать Фототоксичность.
- Электрофизиологии данных приобретение программного обеспечения «Протокол» окна и изображения приобретения программного обеспечения создайте пробную запись требуемой продолжительности, содержащий соматических текущего инъекции требуемой амплитуды.
- С помощью программного обеспечения получения изображений, нажмите кнопку «Начать запись» и приобрести флуоресценции непрерывно в течение 1-2 s. повторить изображение приобретение 3 - 10 раз. Подождите по крайней мере 30 s между одно сканирование чтобы избежать повреждений. Если приобретения linescans в нескольких точках вдоль дендритов, принимайте их в случайном порядке, чтобы избежать эффектов порядка.
- Синаптически вызвала кошки
- Найдите дендритов интерес с помощью красной флуоресценцией сигнала.
- Установите стимуляции пипетки на поверхности среза выше дендритов интерес. Медленно опустите стимуляции дозатор на место, минимизации движение, чтобы не мешать поклеточного конфигурации. Позиция пипетки на 10-15 мкм от дендритов.
- Чтобы визуализировать расположение синаптической microdomains в aspiny дендритов, в программное обеспечение приобретения изображений переключитесь в 'xt' (linescan) режим и положение линии вдоль дендритных филиал интерес.
- В окне «Протокол» (по электрофизиологии сбора данных) и изображения приобретения программного обеспечения создайте пробную запись, вызывающее блок стимуляции после начала судебного разбирательства.
- С помощью приобретения программного обеспечения, нажмите кнопку «Начать запись» для сканирования вдоль дендритов непрерывно в течение 1-2, s. повторить приобретение 3 - 5 раз, ожидания 30 s между сканированием для предотвращения повреждений.
Примечание: Длина сканирования может быть скорректирована в зависимости от кинетики вызвала событие, но должны быть сведены к минимуму для предотвращения повреждений (см. таблицу 2 для устранения неполадок). - Повторите шаг 4.5.5 в разных условиях (например, различные интенсивности/длина стимуляции, введение фармакологических всплывающих окон и т.д.) в зависимости от конкретных вопрос.
- Остановить приобретение, когда ячейка показывает признаки ухудшения здоровья: деполяризации ниже -45 МВ, увеличение базовой Ca2 + уровень, морфологические ухудшение дендритов (например, блеббинг, фрагментация; см. таблицу 2 для устранения неполадок).
- Чтобы получить предварительную информацию о морфологии клеток и сохранить запись расположения стимуляции пипетки, приобрести Z -стек ячейки в красный канал. С помощью приобретения программного обеспечения 'xyz' режим, установите пределы верхнего и нижнего стека изображений всю ячейку со всеми процессами, которые включены. «Размер шага» на 1 мкм и начать приобретение стека, используя кнопку «Начать запись».
- При Z-приобретение стека является полным, используйте параметр «Максимум проекции» в программном обеспечении для наложения всех координационных планов стека и проверка качества приобретения. Затем медленно убрать патч пипетку из фрагмента.
- Чтобы исправить фрагмент для пост Специального морфологической идентификации, быстро удалить фрагмент из ванны с использованием плоской кистью и поместить его между двух документов фильтра, в Петри фаго заполнены. Замените ФАГО 4% раствор параформальдегида (PFA) и оставьте блюдо в комнате 4 ° C или в холодильник на ночь.
5. иммуногистохимия для Post Hoc морфологической идентификации зарегистрированных клеток
Примечание: После 1 ночь фиксации в PFA, срез может храниться в буфере (PB) фосфат с азидом натрия (0,5%) сроком до 1 месяца.
- Положите ломтик в трис буфер солевой раствор (TBS) с X-100 Тритон (0,3%) и выполнять 4 смывки (5-10 мин).
- Положите ломтик в TBS-Тритон 0,3% с 10% нормальной козьего сыворотки (НГС) за 1 ч.
- Положите ломтик в TBS-Тритон 0,3% с 1% NGS и стрептавидина конъюгированных Флюорофор (например, конъюгированных Alexa Fluor 546 стрептавидина, 1: 200) для инкубации в одночасье.
- Вымойте 4 раза (5-10 мин) в TBS.
- Смонтируйте ломтики на Микроскоп слайды и изображения с помощью конфокального микроскопа. Иметь полный ячейки реконструкция, приобретение Z-стека (шаг размер: 1 мкм) с помощью 20 x цель. Для визуализации Alexa-546-конъюгированных метки, используйте 543 Нм лазер и 515-560 Нм при обнаружении фильтра установлен.
6. анализ кошек
- Извлечь значения флуоресценции из регионов интерес (ROI) в linescan изображения из красного и зеленого каналов и средние значения нескольких повторяется для каждого условия для снижения уровня шума.
Примечание: Когда linescan приобретение осуществляется вдоль дендритов, это возможность извлекать данные из нескольких трансформирования, которые могут соответствовать дендритных microdomains (2-5 мкм), и тем самым позволяя исследование Ca2 + сигнал разобщенности. - Для каждого ROI Экспресс изменения в Ca2 + амплитуды как:
Примечание: Здесь G значение флуоресценции из зеленого канала; G0 значение базовых флуоресценции из зеленого канала в течение периода до стимуляции; Флуоресценции R значение красного канала18. Как два фотона возбуждения является в высшей степени локализованы и не создают значительных фон, вычитание фона флуоресценции не требуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С использованием протокола, представленные здесь, мы получили кошки, вызывали соматических текущего инъекции и электростимуляции в дендриты oriens/alveus интернейронов в области СА1 гиппокампа. После исправления нейрона, определены на основе его форму и положение, мы приобрели linescans через проксимальный дендритов в нескольких точках в с учетом расстояния от Сома (рис. 1A). Мы наблюдали снижение амплитуды кошек, индуцированных backpropagating APs как расстояние от Сома увеличилась (свидетельствует о снижение амплитуды AP или расстояни зависимая снижение кальция каналов распределения, рис. 1B). После иммуногистохимия (с помощью конъюгированных стрептавидина Fluor Alexa 546) мы смогли извлечь маркировки biocytin клетки и определить записанные нейрона как bistratified ячейку с Аксон, занимая oriens слой и слой radiatum (Рисунок 1 C). во втором эксперименте, стимуляции пипеткой был доставлен в дистальной дендритных сайта. Сканирование вдоль дендритов, мы затем смогли оценить амплитуды постсинаптических Ca2 + сигналов в данной отрасли дендритных (рисунок 2A–C) в ответ на электрическую стимуляцию аксоны прохода. Постсинаптических кошки отличаются между соседними дендритных microdomains (сегмент 1-6; 2D фигуры), которые могут быть связаны с распространением Ca2 + сигнала от зоны инициирования и/или различных постсинаптических механизмов.
Рисунок 1: Пример AP-вызвала Ca2 + транзиентов. (A) максимальный проекции двух Фотон Z-стека (13 мкм) залатанное межнейронного заполнены с Alexa-594 (20 мкм). Белые линии обозначают местоположение и длину linescans. (B) следы показаны кошек, в местах, показано в а. Top трассировки показывает короткие поезда AP, порожденных через соматические текущего инъекции во время пробной записи. Шкала времени одинакова на все следы показано. (C) максимум проекция конфокальный Z-стек показаны маркировки biocytin клетки. Наибольшая: Oriens/Alveus; PYR: Pyramidale слой; RAD: Пласт Radiatum. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Постсинаптических Ca2 + переходные процессы, вызвала всплеск электрической стимуляции (3 стимулы на 100 Гц). (A) максимальный проекции двух Фотон Z-стека (148 мкм) показаны заплата межнейронного, заполнены с Alexa-594. Белые стрелки указывают на расположение аксональное терминалов в рамках пирамидальной слой, предполагая, что межнейронного — это ячейка, корзина. (B) одной фокальной плоскости, иллюстрирующие дендритных отделение, где был позиционирован электрод стимуляции. Пунктирная линия показывает расположение linescan отбирается (C1 и C2). (C) изображения, иллюстрирующие результат linescan в красный (1; Alexa-594; 20 мкм) и зеленый (2; Орегон зеленый Bapta-5N; Каналы 300 мкм). Изображения были сегментирования на меньшие сегменты для анализа распространения ответа, более 30 мкм. (D) следы показаны Ca2 + транзиентов (кошки) вызвал в сегментах, в C2. Топ трассировки показывает ответ напряжения электрической стимуляции, записанная на уровне соматических во время визуализации суда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Решение | Компонент | Концентрация (мм) |
| ФАГО нормальный | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Глюкоза | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ФАГО восстановление | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Глюкоза | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ФАГО сахароза | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Глюкоза | 10 | |
| Сахароза | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-патч решения на базе | K+- глюконат | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin ди (tris) соль | 10 | |
| ATP-трис | 2 | |
| GTP-трис | 0.2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0.02 | |
| Орегон Грин BAPTA-1 | 0.2 |
Таблица 1: раствор рецепты. Соединения и концентрации для решения, используемые в протоколе.
| Проблема | Решение |
| Не удалось патч здорового нейрон | Проверка на признаки того, что срезы нездоровой: Усохшее или опухшие клетки, видимый ядер и т.д. Если да, отменить ломтики. Также Проверьте сопротивление патч дозаторов и патч решение осмотического давления; Замените их, если значения не в соответствующем диапазоне. |
| Флуоресценции сигнал от дендритов низкий | Ждать больше ячейки, чтобы заполнить. Если препятствие мешает патч решение диффундирующих в клетку, попробуйте применить небольшое количество отрицательного давления в патч пипетки. |
| Электростимуляция не вызывая Ca2 + ответ | Проверка на наличие артефакт в электрофизиологических записи. Если отсутствует, проверка для короткого-замыкания/стимулирующее подразделение неисправности. Если он присутствует, повысить интенсивность стимуляции или переместите пипетку стимуляции ближе дендритов. Это следует отметить, что расстояние между электрод стимуляции и дендритов не должна превышать 8 мкм, чтобы предотвратить прямой деполяризации дендритов при изучении синаптических ответы. |
| Вызвала Ca2 + сигнал является слишком высокой/насыщает Ca2 + индикатор | Снизить мощность лазера. Если проблема не устранена в несколько ячеек, используйте другой Ca2 + индикатор, с нижней Ca2 + сродством. |
| Базовые Ca2 + сигнал постепенно увеличивается во время эксперимента | Ожидания на более длительный период между отдельными сканирования. Если базовый все еще растет, остановить приобретение; Он указывает, что ячейки здравоохранения вероятно снижается. |
| Амплитуда сигнала Ca2 + уменьшается во время сканирования | Снизить мощность лазера или масштаб (если применимо). |
| Дендритов фрагментации («блеббинг») после сканирования | Снизить мощность лазера или уменьшить масштаб. Если блеббинг ограничивается целевых дендритов, выбрать другой дендритов и уменьшить мощность лазера / масштаб. Если несколько дендритов блеббинг, остановите приобретения. |
| Флуоресценции сигналы «дрейфует» из линии сканирования после зачисток | Уменьшить движение на срезе, уменьшая скорость фаго перфузии. До исправления, сделать уверен, что срез сильно фиксируется на месте сети. |
Таблица 2: Устранение неполадок таблицы. Решения для общих проблем, которые могут возникнуть во время Ca2 + изображений эксперимент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, показанный здесь показано, как сочетание двух Фотон Ca2 + изображений и патч зажим электрофизиологии может использоваться для изучения дендритных Ca2 + сигнализации в нейрональных дендритов в острой мозга ломтиками. Этот метод позволяет для контроля как местные Ca2 + фасады вызванные электрической стимуляции или backpropagating ап в дендритных сегменты и ответ соматических клеток. Это делает его отличным инструментом для изучения как различные части дерева, дендритных интегрировать входов и общаться с сома. Но учитывая продолжительность эксперимента, особое внимание необходимо уделять здоровью клетки путем ограничения использования мощности лазера для обработки изображений, с тем чтобы избежать фотоповреждения дендритов. Это может быть также достигнуто путем уменьшения масштаба, уменьшение длительности проверки и увеличить скорость проверки во время загрузки изображений. Изображение межнейронного дендритов вводит дополнительные проблемы. Как дендриты этих клеток без шипов, Сканирование вдоль дендритов рекомендуется для облегчения локализации постсинаптических Ca2 + microdomains. Кроме того учитывая высокий эндогенного Ca2 + связывающая способность, Ca2 + фасады в межнейронного дендритов меньше и медленнее, чем те, которые создаются в дендриты пирамидальных клеток. Это требует приобретения нескольких linescan изображений для усреднения а также достаточно большая продолжительность отдельных linescans для того чтобы описать Ca2 + сигнал кинетики надлежащим образом.
Местные электростимуляция с помощью биполярного тета Стеклянный электрод представляет собой полезный инструмент для характеризации дендритных постсинаптических Ca2 + microdomains. Однако он все еще может активировать различные «en passant» аксонов, расположенных в данном регионе. Количество входов активирован в этом случае неизвестен и может оцениваться только с помощью дополнительных вычислительных средств. Двух Фотон глутамата uncaging27, который позволяет для одновременной стимуляции несколько отдельных синапсы, представляет собой хорошую альтернативу для выявления местных дендритных Ca2 + ответы. Этот метод широко используется для изучения основных клеток, которые четко определили возбуждающих постсинаптических структур (шипы), но не подходят для изучения интернейронов, который в целом имеют плотность низкая позвоночника. Uncaging глутамата вдоль межнейронного дендритов применительно к основной ячейки неизбежно будет активировать несколько внесинаптического механизмов Ca2 + сигнализации9,10, что делает его трудно интерпретировать наблюдения.
В течение последнего десятилетия достижения в области оптических технологий предлагаемых улучшение временное разрешение для двух Фотон Ca2 + воображения. Один из самых перспективных является произвольным доступом микроскопии (ПАНДУС) через акустооптические дефлекторы (крыльчатках)28,29. В отличие от обычных растрового сканирования РАМП сканирует выбранных точек интереса на высокой частоте, которая включена быстрая скорость инерции бесплатно крыльчатках. Это идеально подходит для одновременного изучения нескольких дендритных филиалов, как это не ограничивается пунктов, изложенных в линейной модели. Тем не менее выше временное разрешение, предлагаемые крыльчатках может оказаться ненужным, при визуализации Ca2 + события прочного сотни миллисекунд в один и тот же фокуса план. Кроме того расположение сканирования точек в структуре же интерес может быть трудно контролировать благодаря микро сугробы в подготовке фрагмент, связанный с высоким перфузии скоростью, которая необходима для качества хороший кусок. Следовательно метод на основе linescan приобретение высокого временного разрешения (500-700 Гц), представленный в этой статье еще предпочтителен, при визуализации Ca2 + сигналов в отдельных отраслях дендритных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы могут не конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Совет канадских институтов здравоохранения исследования, естественные науки и инженерных исследований (СЕНТИ обнаружения Грант) и Фондом Savoy. OC была поддержана кандидат стипендий от Сенти.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Yuste, R., Denk, W. Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature. 375, 682-684 (1995).
- Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Structure and Function of Dendritic Spines. Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).
- Sabatini, B. L., Svoboda, K. Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis. Nature. 408, 589-593 (2000).
- Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated. Nature. 399, 151-155 (1999).
- Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Plasticity of calcium channels in dendritic spines. Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).
- Carter, A. G., Sabatini, B. L. State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons. Neuron. 44, 483-493 (2004).
- Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons. J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).
- Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons. J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).
- Camiré, O., Topolnik, L. Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons. J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).
- Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials. Neuron. 24, 727-737 (1999).
- Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons. J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics. J Physiol. 551, 67-78 (2003).
- Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting. J Physiol. 558, 465-478 (2004).
- Oertner, T. G. Functional imaging of single synapses in brain slices. Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 219, pl5 (2004).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing. Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).
- Camiré, O., Topolnik, L. Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons. Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).
- Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus. eNeuro. 3, 1-26 (2016).
- Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons. J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).
- Topolnik, L. Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons. Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).
- Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors. Front Physiol. 3, 259 (2012).
- Bourque, C. W. Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation. Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors. Neuron. 19, 465-471 (1997).
- Salomé, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).
- Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector. Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).
