Summary
Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.
Abstract
Kalsiyum (Ca2 +) görüntüleme intrasellüler Ca2 + sinyaller nöronal dendrites de kronolojik zamanmekansal dinamikleri araştırmak için güçlü bir araçtır. CA2 + dalgalanmaları membran ve hücre içi mekanizmaları çeşitli aracılığıyla ortaya ve sinaptik plastisite indüksiyon ve dendritik uyarılabilirlik düzenlenmesi önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, farklı tipteki Ca2 + sinyalleri dendritik dallarında kaydetmek için yetenek nasıl dendrites bilgi entegre eğitim grupları için değerlidir. İki fotonlu mikroskobu gelişiyle böyle çalışmaları önemli ölçüde canlı doku, ışık saçılma ve duyarlilik gibi görüntüleme için içsel sorunları çözerek kolaylaştırdı. Ayrıca, geleneksel Elektrofizyolojik teknikleri ile görüntüleme İki fotonlu Ca2 + arada yoluyla, yerel Ca2 + dalgalanmalar nöronal dendrites kayıtları ile paralel olarak sinaptik faaliyete araştırmak mümkün olduğunu Soma. Burada, GABAergic inhibitör interneurons dendrites içinde yerel Ca2 + geçişler (kediler) dinamiklerini incelemek için bu yöntemi kullanmak nasıl açıklar. Yöntem aynı zamanda akut beyin dilimleri farklı nöronal türleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitim için uygulanır.
Introduction
Ağ etkinliği için bir neuron katkısı büyük ölçüde aldığı sinaptik girişleri dinamik yapısı tarafından belirlenir. Geleneksel olarak, nöronlar sinirsel aktivite karakterize baskın yöntemi somatik hücre içi bütün yama-kelepçe kayıtların postsinaptik akıntılarının aksonlar geçiş elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış dayanıyordu. Ancak, proksimale yer sinapslarda tek faaliyet truthfully bu durum1' bildirdi. Buna ek olarak, sinaps özgü mekanizmaları değerlendirmek için kayıtları çiftinden nöronların ve dendrites belirli bir konumda sinapslarda ilgi ve dendritik Tümleştirme, mekanizmaları sırasıyla hedeflemek için kullanılmaktadır. Sinaptik fizyolojisi alanında büyük bir atılım optik ve Elektrofizyolojik teknikleri bir evlilik yoluyla elde edildi. Ca2 + görüntüleme ve optogenetic araçları ile birlikte mikroskobu (2PLSM) tarama iki fotonlu uyarma lazer beyin dilim belirli nöronal Connections sinirsel aktivite dinamik organizasyon muazzam ayrıntıları açığa in vitro ve in vivo.
Birkaç önemli avantajlar yapılan geleneksel, bir foton uyarma mikroskobu2den öne 2PLSM: (1) İki fotonlu uyarma doğrusal olmayan doğası nedeniyle, Floresans sadece odak biriminde oluşturulur ve tüm verilmiş fotonlar temsil yararlı sinyalleri (iğne deliği için gerek yoktur); (2) daha uzun dalga boylarında, 2PLSM içinde kullanılan saçılma doku daha verimli bir şekilde nüfuz; Buna ek olarak, dağınık fotonlar İki fotonlu uyarma ve arka plan Floresans üretmek için çok seyreltik; (3) odak düzlemi duyarlilik ve fototoksisite sınırlıdır. Bu nedenle, 2-Foton sistemleri ile karşılaştırıldığında geleneksel confocal mikroskoplar yüksek maliyet rağmen 2PLSM yönteminin seçimi nöronal yapıyı ve kalın canlı dokuya işlevinde yüksek çözünürlüklü incelenmesi için kalır.
Yapısı ve fonksiyonu dendritik dikenleri3görüntüye saçılma doku 2PLSM ilk uygulama oldu. 2PLSM Ca2 + görüntüleme ile birlikte bu dikenleri fonksiyonu izole biyokimyasal bölmeleri ortaya koymuştur. Beri birçok nöronal türlerinde dikenleri ve bireysel sinapslarda4arasında bire bir ilişkiyi, yakında Imaging İki fotonlu Ca2 + oldu, sağlam doku5bireysel sinapslarda Etkinlik bildirimi yararlı bir araç 6,7,8. Ayrıca, 2PLSM tabanlı Ca2 + görüntüleme başarıyla tek kalsiyum kanalları ve içsel ve sinaptik conductances arasındaki doğrusal olmayan etkileşimleri etkinliğini izlemek için hem de devlet ve etkinlik bağımlı değerlendirmek için kullanıldı düzenleme, nöronal dendrites5,6,7,8,9,10,11' sinyal Ca2 + .
Kalsiyum olduğu her yerde birden bulunan hücre içi ikinci haberci ve hücre altı kronolojik zamanmekansal kuruluşu değişikliği iyon düzenlenmesi için sinaptik gücü'nden fizyolojik tepkiler yönünü belirler kanalları, büyüme, dendrite ve omurga olarak hücre ölümü ve hayatta kalma iyi. Dendritik Ca2 + yükselmeler birden çok yolları aktivasyonu ile oluşur. Aksiyon potansiyelleri (APs), backpropagating dendrites için voltaj kalsiyum kanal12 açık ve nispeten genel Ca2 + geçişler (kedi) dendrites ve dikenleri13' te üretmek. Sinaptik iletimi postsinaptik Ca2 +harekete geçirmek ile ilişkili-geçirgen reseptörleri (NMDA, Ca2 +-geçirgen AMPA ve kainate), sinaptik tetikleme CaTs6,14,15. Son olarak, belirli koşullar11,12,13,16altında dendrites supralinear Ca2 + olaylar oluşturulabilir.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme yama-kelepçe Elektrofizyolojik kayıtlar ile birlikte istihdam sentetik Ca2 +-yama elektrot ile bütün hücreli kayıtları sırasında genellikle teslim hassas floresan göstergeleri . Miktar Ca2 + dinamiği için standart bir yol üzerinde ikili gösterge yöntemi17,18temel alır. İki fluorophores de ayrılmış emisyon spectra ile kullanır (örneğin, birleşiminden oluşan bir kırmızı Ca2 +-duyarsız boya ile yeşil Ca2 + göstergeleri, Oregon yeşil BAPTA-1 veya Fluo-4 gibi) ve zaman göre birçok avantajı vardır Tek göstergesi yöntemi. Önce bir Ca2 +-büyük küçük harf duyarlı boya küçük yapılar ilgi (dendritik şube ve dikenleri) Ca2 + görüntüleme yapılacağı yeri bulmak için kullanılır. İkinci olarak, yeşil ve kırmızı Floresans (ΔG/R) değişikliği arasındaki oran, [Ca2 +], [Ca2 +]017 dalgalanmalar nedeniyle temel Floresans değişimler büyük ölçüde duyarsız olan ölçütü olarak hesaplanır , 18. Ayrıca, Floresans değişikliklerimutlak Ca 2 + konsantrasyonları19açısından kalibre edilmesi.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme deneyler akut dilimler halinde çalışırken bir genel resim alma genellikle kullanılan yüksek lazer gücü nedeniyle kararlılığını ve hücre sağlık husustur. Ayrıca, Ca2 + görüntüleme deneyler, işte pertürbasyon ve önemli tahmindi hücre altı Ca2 + dinamikleri hakkında endişe gerçeğini Ca2 + göstergeleri son derece mobil eksojen Ca2 + hareket nedeniyle arabellekleri. Bu nedenle, Ca2 + göstergesi ve onun konsantrasyonu seçimi nöronal türü, kediler beklenen genliği ve deneysel soru bağlıdır.
Biz iki fotonlu Ca2 + görüntüleme yöntemi Ca2 + dalgalanmalar dendrites GABAergic interneurons9,10,11,20,21 incelenmesi için uyarlanmış , 22. asıl nöronlarda erken Ca2 + görüntüleme çalışmaları toplu bitmiş ise inhibitör interneurons alanındaki bu piramit hücreleri20 farklı olan fonksiyonel Ca2 + mekanizmaları çeşitli vitrin , 23 , 24. bu interneuron özgü mekanizmaları (örneğin, Ca2 + geçirgen AMPA reseptör) hücre etkinlik düzenlenmesinde belirli rol oynayabilir. İnterneurons içinde sinyal dendritik Ca2 + daha fazla araştırma yapılması için cazip bir hedef olmakla birlikte, bu hücreler dendrites içinde görüntüleme İki fotonlu Ca2 + dendrites daha ince çapı ve dikenleri için eksikliği ek sorunlar sunar özellikle yüksek endojen Ca2 + Bağlama kapasitesi. Hipokampal interneurons çalışmanın odak araştırma ilgi gibi aşağıdaki iletişim kuralı geçerli olsa da farklı nöron popülasyonları, bu sorunlarla başa çıkmak için uyarlanmıştır.
Bu iletişim kuralı ile iki dış, Sigara descanned dedektörleri (NDDs), elektro-optik modülatör (EOM) ve degrade kontrast (SGC) tarama bir Dodt ile donatılmış ve optik bir tablo üzerinde yüklü bir ticari confocal İki fotonlu mikroskop, idam edildi. Mikroskop Ti:Sapphire multiphoton lazer modu kilitli-800 ile birleştiğinde nm (> 3 W, 140 fs bakliyat, 80 Hz tekrarlama oranı). Görüntüleme sistemi ile sıcaklık kontrolü, iki micromanipulators ile çeviri bir platform, bilgisayar kontrollü elektrot amplifikatör, bir çizim tablası, bir uyarı bir perfüzyon odası dahil olmak üzere bir standart Elektrofizyoloji teçhizat ile donatılmıştır birimi ve veri toplama yazılımı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Université Laval, Hayvan Koruma Komitesi ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ve hayvan refahı kuralları uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. ön hazırlık (isteğe bağlı: 1 gün önceden hazırlamak)
- Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (Normal, sukroz ve kurtarma çözümleri, 1 L; bkz: Tablo 1) üç tür hazırlamak. 300 ± 10 mOsm25 çözümlerinize osmolalite ayarlamak ve ACSF-Sükroz yakınındaki-donma noktası aşağı serin (0-4 ° C).
Not: Bir düşük sodyum kesme çözüm (ACSF-Sükroz) kullanımı akut dilimleri26yüzeysel katmanları nöronlarda canlılığı korunmasına yardımcı olur. - 0.75 mL kırmızı bir fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren yama çözeltisi hazırlamak ve yeşil sentetik kalsiyum göstergesi (örneğin, Oregon yeşil BAPTA-1; bkz: Tablo 1). Biocytin dahil (bkz. Tablo 1) yama-çözüm post hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre gerekiyorsa.
- Osmolalite 280 ± 5 mOsm çözümü ve pH 7.35 ± 0.5 için ayarlayın. Çözüm her zaman buzdolabında veya buz üzerinde tutun.
Not: Seçim kalsiyum göstergesinin dinamik menzili ve incelenen Ca2 + olayların niteliğine esas. - Micropipette çektirme kullanarak, borosilikat cam kılcal damarlar ( Tablo malzemelerigörmek) dan yama Pipetler ≈ 2 µm bahşiş (3-5 MΩ pipet direnç) ve borosilikat teta-cam kılcal damarlar (bakınız tablo, gelen stimülasyon Pipetler ile hazır olun Malzemeler) 2-5 µm ipucu ile.
Not: Pipetler belirli çapı ve şekil yapmak için çekici ayarı çektirme filaman türü ve rampa test sonuçlarını bir cam türü için tarafından belirlenecektir.
2. Hipokampal dilim hazırlık
- Fare anestezi (P13-20; zorlanma ve seks fare ele alınmaktadır deneysel soru tarafından belirlenir) bir inhalasyon narkoz odası içinde bir kağıt havlu üzerine yerleştirilen isoflurane 1 mL ile. Hayvan derinden, hareket ve yavaş solunum eksikliği kanıtlanan anestezi, narkoz odasından kaldırın ve bir Giyotin kullanarak başını kesmek.
- Kafatası kafatası arkasından makas burun için küçük bir çift ile deri kesim tarafından maruz. Mini kemik rongeurs küçük bir çift bregma düzeyde bir delik açmak için kullanın. Ardından makas sagittal dikiş boyunca Kaudal-için-rostral bir kesim yapmak için kullanın. Rongeurs ile her kafatası kapağı ve Asansör yukarı ve dışa doğru her hemisphere kapsayan kafatası kaldırmak için kavramak.
- Beyin tamamen maruz sonra görme sinirini küçük bir spatula ile kesme vuruşu. Beyin kafatasından kaldırmak ve sürekli oksijenli, soğuk ACSF Sükroz içeren bir Petri kabına koydum (sukroz konsantrasyon için bkz: Tablo 1 ).
- Büyük fareler dokudan gereklidir, İntrakardiyak bir perfüzyon kaliteli dilimleri elde etmek için önce beyin çıkarımı buz gibi ACSF Sükroz 20 mL ile dolu bir şırınga (25 G) kullanarak gerçekleştirin.
- Hipokampal dilimleri--dan hulâsa hayvan beyin hazırlayın.
- Bir filtre kağıt parçası üzerinde buz dolu bir Petri kabına yerleştirin, filtre kağıdı üzerine beyin transfer beyin chill yaklaşık 2 dakika süreyle izin. İki hemisferlerin incelemek.
- Disseke hemisferlerin (yönlendirmeyi koronal, enine veya yatay dilimler elde etmek için deneysel hedefi tarafından belirlenir) bir vibratome tablo tutkal ve buz gibi oksijenli ACSF Sükroz ile dolu vibratome tepsisine bırakın. 300-µm vibratome soğutucu kullanarak veya vibratome tepsi çevresinde buz yerleştirerek kalın dilim yaklaşık 1 ° C sıcaklıkta olun.
- Düz boya fırça kullanarak, 37 ° C'ye ısıtılmış oksijenli ACSF kurtarma içeren banyo hippocampus (6 dilim başına yarıküre) içeren dilimleri birikir
- Dilimleri için en az 45 dk. ACSF-kurtarma banyoda bırakın.
3. bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları
- Amaç altında konumlandırılmış bir banyoda yerde Hipokampal bir dilim ayarla (büyütme: 40 x, sayısal Diyafram: 0,8) lazer tarama iki fotonlu mikroskop. Sürekli banyo oksijenli ACSF-normal 2.5-3 mL/dk hızında 30-32 ° C'de ısıtılmış sıvı.
- Kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) veya Dodt-SGC mikroskobu bir hücre boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgi bulmak için kullanın.
Not: hedeflenen nöron nüfus bağlı olarak bir transgenik fare modeli kolayca ilgi hücreleri bulmak için kullanılabilir. Bu durumda, bu adımı Floresan ışık kaynağı kullanımı ile yedek olabilir. - Stimülasyon pipet kırmızı fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren bir ACSF-Normal çözüm ile doldurun.
- (Bir elektriksel stimülasyon birimine bağlı) stimülasyon pipet faiz hücre olarak aynı bölgede yolgösterendir üstüne dilim ayarlayın.
- Böylece ucu doğrudan ilgi hücre yama pipet yama çözüm ile doldurma ve bir kafa Sahne Alanı'na eklemeyi sonra dilim üzerinde ayarlayın.
- Bir şırınga üçlü stopcock sığacak ve yama-pipet plastik tüp yoluyla bağlayın. Sürekli pozitif basınç yama pipet enjekte (≈ 0.1 mL) kullanarak. Stopcock "Kapat" konumda tutun.
- Amplifikatör kontrol yazilim modülü etkinleştirmek ve "VC" butonuna basarak gerilim tipi kelepçe moduna geçin. Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı (örneğin, clampex) Elektrofizyolojik sinyalleri edinmesinin açın ve o sürekli olarak izlemek gerekli olan bir kare gerilim darbe (5 mV, 10 ms), göndermek için "Membran Test" simgesine tıklayın pipet direnç değişiklikler.
- Hedef hücrenin sağ üstteki kadar yama pipet indirin. Yapımı üzerine hücre membran ile iletişim, "açık" pozisyona stopcock kapatarak baskıyı kaldırmak.
Not: Hücre zarı ile temas küçük bir artış zaman pipet direnç olarak algılanır (≈ 0,2 MΩ) görülür ve hücre üzerinde küçük bir girinti pozitif basınç tarafından neden olur. - Hafif bir negatif basınç yazılım tarafından sağlanan pipet direnç 1 GΩ ulaşıncaya kadar stopcock monte boş bir Ģırınga kullanarak düzeltme eki pipet uygulanır. Veri toplama yazılımı 'Membran Test' penceresinde hücre -60, kelepçe mV.
- Hücre açılır ve hücre içi tüm yapılandırma elde kadar negatif basınç uygulayarak devam edin. Bu hücre durum tespiti (gelen 1 GΩ için 70-500 MΩ interneuron türüne bağlı olarak) pipet direnç ve büyük kapasitif geçişler 'Membran Test' penceresindeki görünümünü ani değişiklik üzerine kuruludur.
4. İki fotonlu Ca2 + görüntüleme
- Eksitatör postsinaptik yanıtlarında ilgilenen varsa, GABAA reseptör engelleyici gabazine (10 µM) ve GABAB reseptör engelleyici CGP55845 ekleyin (2 µM) ACSF banyoda.
- Amplifikatör kontrol yazilim modülü, "CC" butonuna basarak geçerli-kelepçe için yama yapılandırma kümesi ve yanıt olarak geçerli depolarize somatik enjeksiyonları hücrenin ateş deseni kaydetmek (0.8-1.0 nA, 1 s). En az 30 dk yama çözümde mevcut göstergeler ile doldurulacak hücre için bekleyin.
Not: Hücrenin alt türü tanımlamak için hücre ateş desen ve etkin özellikleri kullanılabilir; örneğin, hücreleri hızlı yükseliyor. Kayıt ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için) kediler başlamadan önce Difüzyon yoluyla stabilize etmek için gösterge konsantrasyon için önemlidir. - AP uyarılmış kediler
- Görüntü alma yazılımı kullanarak görüntüleri alma başlatın. Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun. Görünür bir yanıt sağlamak için AP backpropagation verimliliğini önemli ölçüde mesafe GABAergic interneurons22ile düşebilir gibi proksimal dendrite (≤ 50 µm) öncelikle, seçin.
- 'Dikdörtgen Aracı' görüntü alma yazılımı kullanarak hedeflenen bölgesine yakınlaştırmak ve geçiş "xt" (Lınescan) modu. Pozisyon karşısında faiz dendritik Şubesi tarama. Lazer yoğunluğu denetleyicileriyle edinme yazılımında İki fotonlu lazer temel yeşil Floresans fototoksisite önlemek için sadece biraz görünür nerede en az güç düzeyinde ayarlayın.
- Elektrofizyoloji veri toplama yazılım 'Protokol' pencere ve görüntü alma yazılımı, istenen süre istenen genlik somatik bir geçerli enjeksiyon içeren bir kayıt deneme oluşturun.
- Görüntü alma yazılımı kullanarak, "kaydı Başlat" düğmesini tıklatın ve floresan sürekli olarak 1-2 s. tekrarı için resim alma 3 - 10 kez elde etmek. Bekle en az 30 s duyarlilik önlemek için tek taramalar arasında. Linescans bir dendrite boyunca birden çok noktalarda alınıyor, onları sipariş etkilerinden korunmak için rasgele sırada almak.
- Synaptically uyarılmış kediler
- Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun.
- Stimülasyon pipet faiz dendrite yukarıda dilim yüzeyinde ayarlayın. Yavaş yavaş stimülasyon pipet yerine, tüm hücreli yapılandırma rahatsız edici önlemek için hareket en aza indirin. 10-15 µm dendrite üzerinden, pipet getirin.
- Görüntü alma yazılımı sinaptik microdomains aspiny dendrites konumunu görmek için geçin 'xt' (Lınescan) modu ve hat boyunca faiz dendritik dalı konumlandırın.
- 'Protokol' penceresi (Toplam Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı) ve görüntü alma yazılımı, stimülasyon birimi deneme başladıktan sonra tetikleyen bir kayıt deneme oluşturun.
- Satın alma yazılımı kullanarak 30 bekleyen 3 - 5 kat, 1-2 s. tekrar Alım için sürekli dendrite boyunca taramak için "kaydı Başlat" düğmesine tıklatın s duyarlilik önlemek için taramalar arasında.
Not: Tarama uzunluğu uyarılmış etkinliğin Kinetik bağlı olarak ayarlanabilir, ancak duyarlilik önlemek için indirilmelidir ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için). - 4.5.5 farklı koşullarda (örneğin, farklı yoğunluk/uzunluğu stimülasyon, giriş bir farmakolojik engelleyici, vb) bağlı olarak ele alınıyor sorularınıza arasındaki adımları yineleyin.
- Hücre sağlığı bozulan belirtileri gösterdiğinde satın durdurmak: -45 aşağıda depolarizasyon mV, temel Ca2 + düzeyi, dendrites (örneğin, blebbing, parçalanma; bkz: Tablo 2 morfolojik bozulma artış sorun giderme için).
- Hücre morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipet konumunu kaydını tutmak için bir yığın Z -kırmızı kanalı hücreye alması. Satın alma yazılımı kullanarak 'xyz' modu, tüm işlemler dahil tüm hücreyi görüntüye yığın üst ve alt sınırları ayarlayın. 'Adım boyutu' 1 µm ayarla ve "Start kayıt" düğmesini kullanarak yığın alma işlemini başlatın.
- Ne zaman Z-yığın alma tamamlandığında, tüm odak planları yığının üst üste ve alım kalitesini doğrulamak için yazılımda "Maksimum projeksiyon" seçeneğini kullanın. Sonra yavaş yavaş dışarı dilim yama pipet geri çek.
- Post hoc morfolojik tanımlama için dilim düzeltmek için hızlı bir şekilde dilimi bir düz boya fırça kullanarak banyodan kaldırın ve arasında iki filtreyi bildiri, ACSF dolu bir Petri kabına yerleştirin. ACSF % 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm ile değiştirin ve 4 ° C oda veya buzdolabı bulaşık gece bırakın.
5. immünhistokimya Post Hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre için
Not: PFA fiksasyonu 1 geceden sonra dilimi fosfat tampon (PB) sodyum azid (%0,5) ile ilâ 1 ay depolanabilir.
- Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik çözüm (TBS) Triton X-100 (% 0.3) ile dilim koyun ve 4 yıkama (5-10 dk her) gerçekleştirin.
- TBS-Triton içinde dilimi koymak % 0,3 ile % 10 normal keçi serum (NGS) 1 h için.
- Dilimi koymak TBS-Triton içinde % 0,3 ile % 1 NGS bir Streptavidin Birleşik fluorophore (örneğin, Alexa Fluor 546 Birleşik Streptavidin, 1: 200) için kuluçka gecede.
- 4 yıkama TBS. içinde kez (5-10 dk)
- Dilimleri mikroskop slaytlar ve görüntü confocal mikroskop kullanarak bağlayın. Tam hücre yeniden sağlamak için bir Zelde-yığın (adım boyutu: 1 µm) 20 x amacı istimal. Alexa-546-Birleşik bir etiket görüntüleme için kullanım 543 nm lazer ve 515-560 nm algılama filtre ayarlayın.
6. kedi analizi
- Kırmızı ve yeşil kanallardan Lınescan görüntülerde faiz (ROIs) bölgelerinden Floresans verileri ayıklar ve gürültüyü azaltmak her koşul için birden fazla yinelenen değerlerin ortalamasını.
Not: Lınescan Alım dendrite gerçekleştirildiğinde, dendritik microdomains (2-5 µm) karşılık, birden çok ROIs veri ayıklamak mümkün olduğunu ve böylece Ca2 + sinyal Bölünebilme çalışma izin. - Her yatırım Getirisi için Ca2 + genlik değişimler hızlı:
Not: Burada G yeşil kanaldan; Floresans değerdir G0 temel floresan yeşil kanal öncesi stimülasyon döneminde değerdir; R kırmızı kanal18floresan değerdir. İki fotonlu uyarma son derece lokalize ve önemli bir arka plan oluşturmaz, arka plan Floresans çıkarma gerekli değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, somatik geçerli enjeksiyon ve Hipokampus CA1 alanında oriens/alveus interneurons dendrites içinde elektrik stimülasyonu tarafından uyarılmış CaTs elde edilen. Sonra belirlenen bir nöron, yama, şekil ve konumunu temel alarak, biz linescans proksimal dendrite birden çok noktalarda karşısında alınan verilen mesafeler soma (şekil 1A). Soma (azaltılmış AP genlik veya kalsiyum kanal dağıtım, şekil 1Bmesafe bağımlı düşüş göstergesi) artan mesafe olarak backpropagating APs tarafından indüklenen kediler genliği bir düşüş görülmektedir. (Alexa Fluor 546 Streptavidin Birleşik kullanarak) immünhistokimya sonra biz biocytin hücre etiketleme almak ve kaydedilen nöron bistratified hücresi olarak stratum oriens ve stratum radiatum (şekil işgal bir akson ile tanımlamak başardık 1 C). ikinci denemede stimülasyon pipet distal dendritik siteye getirildi. Dendrite tarama, biz o zaman elektrik stimülasyon aksonlar geçiş yanıt olarak verilen dendritik dalında (şekil 2A-C) postsinaptik Ca2 + sinyal genliği değerlendirmek başardık. Postsinaptik kediler komşu dendritik microdomains (Bölüm 1-6; arasında farklılık Şekil 2B), hangi Ca2 + sinyal başlatma ve/veya farklı postsinaptik mekanizmaları dahil bölgeden yayılması ile ilişkili olabilir.
Resim 1: AP uyarılmış Ca2 + geçişler temsili örneği. (A)maksimum projeksiyon İki fotonlu Z-Alexa-594 ile dolu bir yamalı interneuron (13 µm) yığını (20 µM). Beyaz çizgiler linescans uzunluğu ve konumunu gösterir. C.top izlemesinde gösterilen yerlerde elde edildi kediler gösterilen (B) izleri somatik geçerli enjeksiyonuyla deneme kayıt sırasında oluşturulan kısa AP tren gösterir. Zaman ölçeği üzerinde gösterilen tüm izlerini aynıdır. (C) maksimum projeksiyon confocal Z-biocytin hücre etiketleme gösterilen yığını. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: bir patlama elektriksel stimülasyon (100 Hz değerinde 3 uyaranlara) tarafından uyarılmış postsinaptik Ca2 + geçişler. (A)maksimum projeksiyon İki fotonlu Z-Alexa-594 ile dolu bir yamalı interneuron gösterilen yığını (148 µm). Beyaz ok uçları aksonal Terminal interneuron bir sepet hücredir düşündüren piramit katman içinde gidin. Nerede stimülasyon elektrot yerleştirildi dendritik şube gösteren (B) tek odak düzlemi. Kesikli çizgi (C1 ve C2) gösterilen Lınescan konumunu gösterir. (C) görüntüleri (1; kırmızı bir Lınescan sonucunu gösteren Alexa-594; 20 µM) ve yeşil (2; Oregon yeşil Bapta-5N; 300 µM) kanalları. Görüntüleri Ca2 + geçişler (kediler) gösterilen 30 µm. (D) izleri C2 hücresindeki görüntülenen kesimleri içinde elde edildi yanıt yayılmasını analiz etmek için daha küçük bölümler halinde binned. En iyi izleme elektriksel stimülasyon somatik düzeyinde görüntüleme duruşma sırasında kaydedilen gerilim cevaben gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çözüm | Bileşen | Konsantrasyonu (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glikoz | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-kurtarma | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glikoz | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-sükroz | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glikoz | 10 | |
| Sükroz | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-yama çözüm tabanlı | K+- glukonat | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin di (tris) tuz | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0,2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0,02 | |
| Oregon yeşil-BAPTA-1 | 0,2 |
Tablo 1: çözüm tarifleri. Bileşikler ve konsantrasyonları iletişim kuralı sırasında kullanılan çözümleri için.
| Sorun | Çözüm |
| Yapamaz-e doğru yama sağlıklı nöron | Onay işaretleri dilimleri sağlıksız için: çekmiş veya şişmiş hücreleri, görünür hücre çekirdeği, vb. Eğer öyleyse, dilimleri atmak. Ayrıca yama-pipet direnç ve yama-çözümün osmolalite doğrulayın; değerleri uygun aralığında değilse bunların yerine. |
| Dendrites sinyalini Floresans düşüktür | Hücreyi doldurmak uzun bekleyin. Bir tıkanıklık hücreye Difüzyon yama-çözüm tutuyor yama-pipet negatif basınç az miktarda uygulamak deneyin. |
| Elektriksel stimülasyon Ca2 + yanıt evoking değil | Bir eşya Elektrofizyolojik kayıt varlığı için kontrol edin. Eğer yok, onay için bir kısa-devre/uyarıcı birim arızası. Varsa, stimülasyon yoğunluğu artırmak veya stimülasyon pipet daha yakın dendrite için hareket. Stimülasyon elektrot ve dendrite arasındaki mesafe 8 um dendrites doğrudan depolarizasyon sinaptik yanıtları okurken önlemek için aşmaması gerektiğini kaydetti için olduğunu. |
| Uyarılmış Ca2 + sinyal da yüksek/karışırlar Ca2 + göstergesi | Lazer gücü düşür. Birden çok hücreyi sorun devam ederse, farklı bir göstergesi Ca2 + kullanın, ile bir alt Ca2 + ilgi. |
| Temel Ca2 + sinyal deneme sırasında giderek artmaktadır | Bireysel taramalar arasında daha uzun bir süre bekleyin. Temel artıyor, durdurmak satın alma; Bu hücrenin sağlık büyük olasılıkla kötüleştiğini gösterir. |
| Taramalar sırasında Ca2 + sinyal genliği azalır | Lazer güç azaltmak veya (varsa) vınlamak dışarı. |
| Dendrite ("blebbing") taramadan sonra parçalanan | Lazer gücü düşür yakınlaştırabilir veya uzaklaştırabilirsiniz. Blebbing için hedeflenen dendrite sınırlı ise, başka bir dendrite seçin ve lazer gücü azaltmak / vınlamak dışarı. Birden çok dendrites blebbing varsa, satın alma durdurmak. |
| Floresan sinyallerini "tarama haddimi piyango sonra geliyor" | Dilimi hareketinde ACSF perfüzyon hızını azaltarak azaltın. Önce yama, yapmak emin dilimi güçlü bir ağ tarafından yerinde sabittir. |
Tablo 2: tablo sorun giderme. Deney Imaging bir Ca2 + sırasında ortaya çıkabilecek ilgili genel sorunların çözümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada gösterilen yöntem nöronal dendrites akut beyin dilimleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitimi için iki fotonlu Ca2 + görüntüleme ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji ile birlikte nasıl kullanılacağını gösterir. Bu yöntem dendritik kesimleri ve somatik hücrenin tepkisinde elektrik stimülasyon veya backpropagating AP tarafından uyarılmış her iki yerel Ca2 + çizimleri izlenmesi için izin verir. Bu çalışma dendritik ağacının nasıl çeşitli yerlerinde girişleri entegre ve soma ile iletişim kurmak için mükemmel bir araç yapar. Ancak deneme süresi göz önüne alındığında, özellikle dikkat hücre sağlık için böylece dendrites duyarlilik önlemek için düşsel lazer güç kullanımını sınırlama tarafından ödenmesi gerekiyor. Bu aynı zamanda yakınlaştırma düzeyini azaltmak, tarama süresi azalan ve artan inceden inceye gözden geçirmek hız resim alma sırasında elde edilebilir. İnterneuron dendrites görüntüleme ek zorluklar tanıttı. Dendrites bu hücreler yok dikenleri gibi dendrite tarama postsinaptik Ca2 + microdomains lokalizasyonu kolaylaştırmak için önerilir. Buna ek olarak, bir yüksek endojen Ca2 + Bağlama kapasitesi göz önüne alındığında, daha küçük ve daha yavaş--dan o piramit hücreleri dendrites içinde oluşturulan Ca2 + yükselmeler interneuron dendrites içinde. Bu Ca2 + sinyal Kinetik uygun şekilde açıklamak için bireysel linescans yeterince uzun bir süre yanı sıra ortalama için birkaç Lınescan görüntüleri elde etme gerektirir.
İki kutuplu teta-cam elektrot kullanarak yerel elektrik stimülasyonu dendritik postsinaptik Ca2 + microdomains karakterizasyonu için yararlı bir araç temsil eder. Ancak, hala farklı "en anpasan" aksonlar belirli bir bölgesinde bulunan etkinleştirebilir. Aktif girişleri sayısı bu durumda bilinmeyen ve sadece ek Hesaplama araçları kullanarak tahmin edilebilir. Aynı anda birden çok bireysel sinapslarda uyarılması için sağlayan iki fotonlu Glutamat uncaging27, yerel dendritik Ca2 + yanıt almak için iyi bir alternatif temsil eder. Bu yöntem eksitatör postsinaptik yapıları (dikenleri) açıkça tanımladığınız, asıl hücrelerinin çalışma için yaygın olarak kullanılan ancak iyi interneurons, hangi genel olarak düşük omurga yoğunluk var çalışma için uygun değil. İnterneuron dendrite boyunca uncaging Glutamat asıl hücrelerine uygulanan gibi kaçınılmaz etkinleştirmek9,10yorumlamak zorlaştırır, sinyal verme Ca2 + birden çok extrasynaptic mekanizmaları gözlemler.
Son on yılda iki fotonlu Ca2 + görüntüleme için geliştirilmiş zamansal çözünürlük optik teknolojileri gelişmeler teklif etti. En umut verici acousto optik yansıtıcılar (AODs)28,29ile rasgele erişim mikroskobu (rampa) biridir. Tarama geleneksel raster rampa seçili makas-in ilgi yüksek frekansta atalet-Alerjik AODs hızlı hız yanında etkin tarar. Doğrusal bir desen koyulur Puan sınırlı olmadığından birden fazla dendritik dalları, eş zamanlı çalışma için idealdir. Ancak, AODs tarafından sunulan daha yüksek zamansal çözünürlük milisaniye aynı odak planı içinde yüzlerce süren Ca2 + olayları görüntüleme gereksiz olabilir. Ayrıca, Puan faiz aynı yapısı içinde tarama konum nedeniyle mikro-sürüklenir dilim müstahzarları iyi dilim kalitesi için gerekli olan yüksek perfüzyon oranı ile ilişkili denetimi için zor olabilir. Bu nedenle, bu makalede sunulan yüksek zamansal çözünürlük (500-700 Hz) Lınescan tabanlı Alım yöntemi Ca2 + sinyalleri bireysel dendritik dallarında Imaging hala tercih edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu eser Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC keşif Grant) ve Savoy Vakfı tarafından desteklenmiştir. OC NSERC bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Yuste, R., Denk, W. Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature. 375, 682-684 (1995).
- Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Structure and Function of Dendritic Spines. Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).
- Sabatini, B. L., Svoboda, K. Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis. Nature. 408, 589-593 (2000).
- Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated. Nature. 399, 151-155 (1999).
- Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Plasticity of calcium channels in dendritic spines. Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).
- Carter, A. G., Sabatini, B. L. State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons. Neuron. 44, 483-493 (2004).
- Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons. J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).
- Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons. J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).
- Camiré, O., Topolnik, L. Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons. J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).
- Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials. Neuron. 24, 727-737 (1999).
- Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons. J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics. J Physiol. 551, 67-78 (2003).
- Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting. J Physiol. 558, 465-478 (2004).
- Oertner, T. G. Functional imaging of single synapses in brain slices. Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 219, pl5 (2004).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing. Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).
- Camiré, O., Topolnik, L. Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons. Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).
- Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus. eNeuro. 3, 1-26 (2016).
- Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons. J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).
- Topolnik, L. Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons. Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).
- Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors. Front Physiol. 3, 259 (2012).
- Bourque, C. W. Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation. Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors. Neuron. 19, 465-471 (1997).
- Salomé, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).
- Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector. Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).
