Summary
Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.
Abstract
Kalzium (Ca2 +) Bildgebung ist ein mächtiges Werkzeug um die räumlich-zeitliche Dynamik der intrazellulären Ca2 + Signale in neuronalen Dendriten zu untersuchen. Ca2 + Schwankungen können durch eine Vielzahl von Membran und intrazellulären Mechanismen auftreten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion der synaptischen Plastizität und Regulierung von dendritischen Erregbarkeit. Daher ist die Möglichkeit, verschiedene Arten von Ca2 + Signale in dendritischen Filialen aufnehmen wertvoll für Gruppen studieren wie Dendriten Informationen zu integrieren. Das Aufkommen der zwei-Photonen-Mikroskopie hat solche Studien erheblich erleichtert durch die Bildgebung in lebender Gewebe, wie Lichtstreuung und lichtbedingten inhärenten Probleme zu lösen. Darüber hinaus durch Kombination von konventionellen elektrophysiologische Techniken mit zwei-Photon Ca2 + imaging, ist es möglich zu untersuchen, lokale Ca2 + Schwankungen in neuronalen Dendriten parallel mit Aufnahmen der synaptischen Aktivität in Soma. Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode verwenden, um die Dynamik der lokalen Ca2 + Transienten (Katzen) studieren in Dendriten der GABAergen inhibitorischen Interneuronen. Die Methode kann auch angewendet werden, zum Studium dendritischen Ca2 + -Signalisierung in verschiedenen neuronalen in akuten Hirnschnitten.
Introduction
Der Beitrag eines Neurons, Netzwerk-Aktivität richtet sich weitgehend nach der dynamischen Natur der synaptischen Eingänge, die er empfängt. Traditionell, stützte sich die vorherrschende Methode der Charakterisierung synaptische Aktivität in Nervenzellen auf somatische ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Ströme, hervorgerufen durch elektrische Stimulation von Axonen der Passage. Einzige Aktivität der proximal befindet sich Synapsen wird jedoch in diesem Fall1wahrheitsgemäß gemeldet. Darüber hinaus wurden um die Synapse-spezifische Mechanismen zu beurteilen, Aufnahmen von Paaren von Neuronen und von Dendriten an einem bestimmten Ort zur Synapsen von Interesse und die Mechanismen der dendritischen Integration bzw. Ziel. Ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie wurde durch eine Heirat von optischen und elektrophysiologische Techniken erreicht. Zwei-Photon Erregung Laser-scanning-Mikroskopie (2PLSM) in Kombination mit Ca2 + Bildgebung und optogenetische Tools kann enorme Details der dynamischen Organisation der synaptischen Aktivität an bestimmten neuronalen Verbindungen im Gehirnscheiben in offenbaren. Vitro und in Vivo.
Einige wesentliche Vorteile hat 2PLSM von den herkömmlichen, ein Photon Erregung Mikroskopie2abheben: (1) aufgrund einer nichtlinearen Natur der zwei-Photonen-Anregung die Fluoreszenz nur im fokalen Volumen erzeugt, und vertreten alle emittierte Photonen nützliche Signale (keine Notwendigkeit für Lochkamera); (2) längere Wellenlängen, in 2PLSM, durchdringen das Gewebe Streuung effizienter; Darüber hinaus sind die gestreute Photonen zu verdünnen, Hintergrundfluoreszenz und zwei-Photon Erregung zu produzieren; (3) lichtbedingten und Phototoxizität sind auch auf der Brennebene beschränkt. Die 2PLSM bleibt daher trotz der hohen Kosten der 2-Photonen-Systeme im Vergleich zu herkömmlichen konfokale Mikroskope, eine Methode der Wahl für hochauflösende Untersuchung der neuronalen Struktur und Funktion in dicken lebendes Gewebe.
Die erste Anwendung des 2PLSM im Streuung Gewebe war es, die Struktur und Funktion der dendritischen Dornen3Bild. 2PLSM in Kombination mit Ca2 + Bildgebung ergab, dass Wirbelsäulen-Funktion als isolierten biochemischen Fächer. Da in vielen neuronalen Arten gibt es eine 1: 1-Entsprechung zwischen Dornen und einzelne Synapsen4, wurde zwei-Photon Ca2 + imaging bald ein nützliches Werkzeug, das die Aktivität der einzelnen Synapsen bei intaktem Gewebe5Berichterstattung, 6,7,8. Darüber hinaus wurde 2PLSM-basierte Ca2 + Bildgebung erfolgreich um die Aktivität der einzelnen Calciumkanäle und die nichtlinearen Wechselwirkungen zwischen der inneren und synaptischen maßgearbeitet überwachen sowie Zustand und aktivitätsabhängige bewerten eingesetzt Regulierung von Ca2 + Signalisierung in neuronalen Dendriten5,6,7,8,9,10,11.
Calcium ist ein allgegenwärtiges intrazellulären zweite Bote, und seine subzelluläre räumlich-zeitliche Organisation bestimmt die Richtung des physiologischen Reaktionen von Änderungen in der synaptischen Stärke bei der Regulierung von Ionen-Kanäle, Dendriten und Wirbelsäule Wachstum als Zelle Tod und überleben. Dendritische Ca2 + Erhebungen erfolgen über Aktivierung des mehrere Wege. Aktionspotentiale (APs), Backpropagating, die Dendriten öffnen Voltage-gated Kalzium-Kanäle12 und produzieren relativ globale Ca2 + Transienten (Katzen) in Dendriten und Stacheln13. Synaptische Übertragung ist verbunden mit der Aktivierung der postsynaptischen Ca2 +-durchlässigen Rezeptoren (NMDA, Ca2 +-durchlässigen AMPA und Kainate),6,14,15Katzen auslösen synaptische. Schließlich werden in Dendriten unter bestimmten Bedingungen11,12,13,16Supralinear Ca2 + Ereignisse generiert.
Zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung in Kombination mit Patch-Clamp elektrophysiologische Aufnahmen beschäftigt synthetische Ca2 +-empfindliche fluoreszierenden Indikatoren, die in der Regel durch die Patch-Elektrode während der gesamten Zelle Aufnahmen geliefert werden . Eine Standardmethode zur Quantifizierung von Ca2 + Dynamik basiert auf der dual-Anzeige Methode17,18. Er verwendet zwei Fluorophore mit gut getrennten Emissionsspektren (z.B., eine Kombination aus einem roten Ca2 +-unempfindliche Farbe mit grünen Ca2 + Indikatoren, wie Oregon Green BAPTA-1 oder Fluo-4) und hat mehrere Vorteile gegenüber der einzigen Indikator Methode. Erstens, eine Ca2 +-unempfindlich Farbstoff wird verwendet, um suchen kleine Strukturen von Interesse (dendritische Verzweigungen und Stacheln) wo Ca2 + Bildgebung erfolgen. Zweitens wird das Verhältnis zwischen den grünen und roten Fluoreszenz (ΔG/R) als Maß für die [Ca2 +], berechnet, ist weitgehend unempfindlich gegen Veränderungen der Grundlinie Fluoreszenz aufgrund der schwankenden [Ca2 +]017 , 18. Darüber hinaus können Fluoreszenz Änderungen in Bezug auf absolute Ca2 + -Konzentrationen19kalibriert werden.
Eine allgemeine Beschwerde beim laufen zwei-Photon Ca2 + bildgebender Experimenten in akuten Scheiben ist Zelle Gesundheit und Stabilität der Bildaufnahme durch die hohe Laserleistung, die in der Regel verwendet. Zusätzlich in Ca2 + bildgebenden Experimenten gibt es Besorgnis über die Störung und erheblichen Überschätzung der subzellulären Ca2 + Dynamik da Ca2 + Indikatoren als hochmobile exogene Ca2 + handeln Puffer. Somit hängt die Wahl der Ca2 + Kennzeichen und seine Konzentration auf die neuronalen Art, die erwartete Amplitude der Katzen und der experimentellen Frage.
Wir die Methode der zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung für die Untersuchung von Ca2 + Schwankungen in Dendriten der GABAergen Interneuronen9,10,11,20,21 angepasst , 22. während der Großteil der frühen Ca2 + bildgebenden Studien erfolgten in den wichtigsten Neuronen, hemmende Interneurone präsentieren eine Vielzahl von funktionalen Ca2 + Mechanismen unterscheiden sich von denen in Pyramidenzellen20 , 23 , 24. diese Interneuron-spezifische Mechanismen (z.B. Ca2 + durchlässig AMPA-Rezeptoren) können bestimmte Rollen bei der Regulierung der Aktivität der Zellen spielen. Während dendritischen Ca2 + signalisieren in den Interneuronen ein verlockendes Ziel für weitere Untersuchungen ist, präsentiert zwei-Photon Ca2 + Bildgebung in Dendriten dieser Zellen zusätzliche Herausforderungen, aus einem dünneren Durchmesser von Dendriten und Mangel an Stacheln eine besonders hohe endogene Ca2 + -Bindungskapazität. Wie unsere Fokus auf die Untersuchung der hippocampalen Interneuronen Forschungsinteressen, wurde das folgende Protokoll, während auf verschiedenen neuronalen Populationen anwendbar zur Bewältigung dieser Herausforderungen angepasst.
Dieses Protokoll wurde mit einem kommerziellen konfokale zwei-Photonen-Mikroskop ausgeführt mit zwei externen, nicht descanned Detektoren (NDDs), Elektro-optischer Modulator (EOM) und ein Dodt Scannen gradient Kontrast (SGC) ausgestattet, und auf einer optischen Tisch installiert. Das Mikroskop wurde gepaart mit einem Exklusivrepräsentation multiphoton Laser modengekoppelten bei 800 nm (> 3 W, 140 fs Impulsen, 80 Hz Wiederholrate). Die imaging-System wurde mit einem standard Elektrophysiologie-Rig, einschließlich einer Perfusion Kammer mit einer Übersetzung Plattform mit zwei Mikromanipulatoren, eine computergesteuerte Mikroelektrode Verstärker, ein Digitizer, Temperaturregelung, eine Stimulation ausgestattet. Einheit und Datenerfassungs-Software.
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Protocol
Alle Versuche wurden gemäß den Richtlinien des Tierschutzes Tier-Schutz-Ausschuss des Université Laval und des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.
1. Vorbereitung (Optional: bereiten Sie 1 Tag im Voraus)
- Bereiten Sie drei Arten von künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) Lösung (Normal, Saccharose und Recovery-Lösungen, 1 L; siehe Tabelle 1). Anpassen die Osmolalität der Lösungen für 300 ± 10 mOsm25 und kühlen der ACFS Saccharose bis zu einem in der Nähe des Gefrierpunktes (0-4 ° C).
Hinweis: Die Verwendung von eine natriumarme Schneidelösung (ACFS-Saccharose) hilft die Lebensfähigkeit der Neuronen in den oberflächlichen Schichten des akuten Scheiben26zu bewahren. - Bereiten Sie 0,75 mL Patch-Lösung, die eine rote Fluorophor (z.B.Alexa-594) enthält und eine grüne synthetische Kalzium-Indikator (z.B.Oregon Green BAPTA-1; siehe Tabelle 1). Biocytin enthalten (siehe Tabelle 1) in die Patch-Lösung, wenn post Hoc morphologische Identifikation der aufgezeichneten Zellen erforderlich ist.
- Anpassen der Osmolalität die Lösung für 280 ± 5 mOsm und pH 7,35 ± 0,5. Halten Sie die Lösung im Kühlschrank oder auf Eis zu allen Zeiten.
Hinweis: Wahl des Indikators Kalzium sollte auf die dynamische Bandbreite und die Art der untersuchten Ca2 + Ereignisse ausgesagt werden. - Mit einer Mikropipette Puller, bereiten Sie Patch Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (siehe Tabelle der Materialien) mit ≈ 2 µm Tipp (Pipette Widerstand von 3-5 MΩ) und Stimulation Pipetten aus Borosilikat Theta-Glaskapillaren (siehe Tabelle des Materialien) mit 2 bis 5 µm Spitze.
Hinweis: Die Puller-Einstellungen, um Pipetten von gleichem Durchmesser und Form werden der Abzieher-Filament-Typ und die Rampe Testergebnisse für eine bestimmte Art von Glas bestimmt.
(2) hippocampal Slice-Vorbereitung
- Die Maus zu betäuben (P13-20; vom Stamm und Geschlecht der Maus wird bestimmt durch die experimentelle Frage) mit 1 mL Isofluran auf ein Papiertuch innerhalb einer Inhalation Narkose Kammer platziert. Wenn das Tier tief betäubt ist, wie ein Mangel an Bewegung und langsame Atmung belegt, entfernen Sie sie aus der Narkose Kammer und enthaupten mit einer Guillotine.
- Setzen Sie den Schädel durch Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Schere von der Rückseite des Schädels an der Nase. Verwenden Sie ein paar kleine Mini-Knochen-Rongeurs, um ein Loch auf der Bregma Ebene zu machen. Dann verwenden Sie die Schere kaudalen, rostral Schnitt entlang der sagittale Naht zu machen. Greifen Sie mit der Rongeurs der Rückseite der einzelnen Schädel Klappe und Aufzug nach oben und nach außen, um den Schädel für jede Hemisphäre zu entfernen.
- Nachdem das Gehirn voll ausgesetzt ist, unterbieten Sie die Sehnerven mit einem kleinen Spatel. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und steckte es in eine Petrischale mit ständig sauerstoffreiches, kalten ACFS Saccharose (siehe Tabelle 1 für Saccharose-Konzentration).
- Wenn Gewebe aus älteren Mäusen erforderlich ist, führen Sie eine intrakardiale Perfusion mit einer Spritze (25G) gefüllt mit 20 mL eiskaltes ACFS Saccharose vor der Gehirn-Extraktion, um gute Qualität-Scheiben zu erhalten.
- Hippocampale Scheiben aus dem extrahierten tierischen Gehirn vorzubereiten.
- Lassen Sie die Gehirn Chill für ca. 2 min. Legen Sie ein Stück Filterpapier auf eine Petrischale mit Eis verpackt, das Gehirn auf dem Filterpapier zu übertragen. Die beiden Hemisphären zu sezieren.
- Kleben Sie die sezierten Hemisphären (die Ausrichtung richtet sich nach der experimentellen Ziel koronalen, transversale oder horizontale Scheiben zu erhalten) auf einen Vibratome Tisch und Tauchen Sie ihn in das Vibratome Fach gefüllt mit eiskalten sauerstoffreiches ACFS-Saccharose. Machen Sie 300 µm dicke Scheiben bei einer Temperatur von etwa 1 ° C durch die Verwendung einer Vibratome Kühler oder platzieren das Eis rund um das Vibratome Fach.
- Mit einem flachen Pinsel, reichern sich die Scheiben mit dem Hippocampus (bis zu 6 Scheiben pro Hemisphäre) in ein Bad mit Sauerstoff angereichertes ACFS-Recovery auf 37 ° c erhitzt
- Lassen Sie die Scheiben in der ACFS Recovery-Bad für mindestens 45 Minuten.
(3) Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahmen
- Platz in einer Badewanne positioniert im Rahmen des Ziels eine hippocampale Scheibe inmitten (Vergrößerung: 40 x, numerische Apertur: 0,8) von einem Laserscanning-zwei-Photonen-Mikroskop. Ständig Durchspülen des Bades mit sauerstoffreichem ACFS-Normal mit einer Rate von 2,5-3 mL/min bei 30-32 ° C erhitzt.
- Verwenden Sie Infrarot-differential Interferenz-Kontrast (IR-DIC) oder Mikroskopie Dodt-SGC, um eine Zelle mit seiner Größe, Form und Position zu finden.
Hinweis: Abhängig von der gezielten Neuron Bevölkerung einem transgenen Mausmodell lässt sich leicht Zellen von Interesse finden. In diesem Fall kann dieser Schritt mit einer fluoreszierenden Lichtquelle ersetzt werden. - Füllen einer Stimulation-Pipette mit einer ACFS-Normal-Lösung enthält die rote Fluorophor (z.B.Alexa-594).
- Stellen Sie die Stimulation-Pipette (angeschlossen an eine elektrische Stimulation-Einheit) auf der Oberseite der Scheibe so ein, dass die Spitze in der gleichen Region wie die Zelle von Interesse ist.
- Setzen Sie nach der Patch-Pipette mit Patch Lösung füllen und Anhängen an eine Leiter Bühne ihn über das Stück, dass seine Spitze direkt oberhalb der Zelle von Interesse ist.
- Passen Sie eine Spritze in eine drei-Wege-Hahn und verbinden Sie es mit der Patch-Pipette durch das Kunststoffrohr. Injizieren Sie konstante Überdruck in der Patch-Pipette (≈ 0,1 mL) mit der Spritze. Halten Sie der Absperrhahn in "schließen" Stellung.
- Das Steuermodul Software Verstärker aktivieren und durch Anklicken des Buttons "VC" Voltage-Clamp-Modus wechseln. Öffnen Sie die Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software (z.B., Clampex) für den Erwerb von elektrophysiologischen Signalen zu und klicken Sie auf das Symbol "Membran-Test" haben es ständig aussenden einer quadratischen Spannungsimpuls (5 mV, 10 ms), die notwendig ist, zu überwachen Widerstandsänderungen Pipette.
- Senken Sie die Patch-Pipette, bis es rechts oben auf die gezielte Zelle ist. Bei der Herstellung Kontakt mit der Zellmembran, den Druck durch Drehen der Absperrhahn in der "offenen" Position entfernen.
Hinweis: Kontakt mit der Zellmembran wird erkannt, wenn eine geringe Erhöhung der Pipette Widerstand (≈ 0,2 MΩ) sieht man eine kleine Einbuchtung auf der Zelle entsteht durch Überdruck. - Die Patch-Pipette mit einer leeren Spritze in den Absperrhahn eingebaut, bis die Pipette Widerstand der Software 1 GΩ erreicht zuweisen Sie einen leichten Unterdruck. Im Fenster "Membran-Test" der Datenerfassungs-Software, Klemmen Sie die Zelle bei-60 mV.
- Weiterhin negativen Druck, bis die Zelle geöffnet wird und die gesamte Zelle Konfiguration erreicht. Erkennung von diesem Zellstatus basiert auf die plötzliche Veränderung in der Pipette Widerstand (1 GΩ, 70-500 MΩ je nach Interneuron) und das Aussehen der großen kapazitiven Transienten im Fenster "Membran-Test".
4. zwei-Photon Ca2 + Imaging
- Bei Interesse an der exzitatorischen postsynaptischen Antworten hinzufügen, die GABA-A Rezeptor Blocker Gabazine (10 µM) und der GABA-B -Rezeptor-Blocker CGP55845 (2 µM) in der Badewanne ACFS.
- Im Kontrollmodul Software Verstärker setzen die Patch-Konfiguration an Strom-Klammer durch Klicken auf die Schaltfläche "CC" und Aufzeichnen der Zelle feuern Muster als Reaktion auf somatische Injektionen von depolarisierende Strom (0,8-1,0 nA, 1 s). Warten Sie mindestens 30 min für die Zelle mit den Indikatoren im Patch-Lösung gefüllt werden.
Hinweis: Die Zelle feuern Muster und aktiven Eigenschaften lässt sich die Zelle Untertyp zu identifizieren; z. B.schnelle Spick Zellen. Es ist wichtig für die Konzentration der Indikator zur Stabilisierung durch Diffusion vor Beginn der Aufzeichnung Katzen (siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche). - AP-evozierten Katzen
- Starten Sie mithilfe des Bild-Datenerfassungs-Software Importieren von Bildern. Suchen Sie nach einem Dendriten des Interesses über das rote Fluoreszenz-Signal. Um eine sichtbare Antwort zu gewährleisten, wählen Sie zuerst eine proximale Dendrit (≤ 50 µm), wie die Effizienz der AP Backpropagation mit Abstand in GABAergen Interneuronen22deutlich zurückgehen kann.
- Vergrößern Sie die gezielte Region und wechseln Sie zum Werkzeug "rechteckige" in der Bild-Datenerfassungs-Software, die "Xt" (womit) Modus. Positionieren Sie den Scan über die dendritische Verzweigung von Interesse. Mit dem Laser Intensität Controllern in der Software zur Datenerfassung festgesetzt des zwei-Photonen-Lasers minimal Leistung wo Grundlinie grüne Fluoreszenz nur leicht sichtbar ist, Phototoxizität zu vermeiden.
- Erstellen Sie in der Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software 'Protokoll'-Fenster und Bild-Datenerfassungs-Software eine Aufnahme-Testversion der gewünschten Dauer mit einer somatischen Stromeinspeisung der gewünschte Amplitude.
- Mit der Bild-Datenerfassungs-Software, klicken Sie auf "Aufnehmen" und erwerben Sie der Fluoreszenz kontinuierlich für 1-2 S. wiederholen die Bildaufnahme 3-10 Mal. Warten Sie mindestens 30 s zwischen Einzelscans lichtbedingten zu vermeiden. Wenn Linescans an mehreren Punkten entlang einem Dendriten zu erwerben, nehmen sie in zufälliger Reihenfolge-Effekte zu vermeiden.
- Synaptisch-evozierten Katzen
- Suchen Sie nach einem Dendriten des Interesses über das rote Fluoreszenz-Signal.
- Legen Sie die Stimulation Pipette auf der Oberfläche der Scheibe über die Dendriten von Interesse. Senken Sie langsam die Stimulation Pipette einrastet, Bewegung, um nicht zu stören, die ganz-Zell Konfiguration zu minimieren. Positionieren Sie die Pipette auf 10-15 µm aus dem Dendriten.
- Um den Speicherort der synaptischen Microdomains in Aspiny Dendriten zu visualisieren, in der Bild-Datenerfassungs-Software wechseln Sie zu der 'Xt' (womit) Modus und positionieren Sie die Linie entlang der dendritischen Zweig von Interesse.
- Erstellen Sie im "Protokoll" Fenster (der Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software) und Bild-Datenerfassungs-Software eine Aufnahme-Studie, die die Stimulationseinheit nach dem Test Start auslöst.
- Mit der Software zur Datenerfassung, klicken Sie auf "Aufnehmen", entlang der Dendrit kontinuierlich für 1-2 S. Wiederholung Erwerb 3-5mal, Scannen warten 30 s zwischen den Scans, lichtbedingten zu verhindern.
Hinweis: Die Länge der Scan kann abhängig von der evozierten Ereignis Kinetik angepasst werden, sondern sollte zur Vermeidung von lichtbedingten minimiert werden (siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche). - Wiederholen Sie Schritt 4.5.5 unter verschiedenen Bedingungen (z.B. unterschiedlicher Intensität/Länge der Stimulation, Einführung eines pharmakologischen Blocker usw.) abhängig von der konkreten Frage in Angriff genommen.
- Die Übernahme zu stoppen, wenn die Zelle Anzeichen zeigt für eine Verschlechterung der Gesundheit: Depolarisation unter-45 mV, Anstieg der Basislinie Ca2 + Level, morphologische Verschlechterung der Dendriten (z.B., Blebbing, Fragmentierung, siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche).
- Vorläufige Informationen über die Zellmorphologie und notieren Sie den Speicherort der Stimulation Pipette, einen Z -Stapel der Zelle in den Rot-Kanal zu erwerben. Mit der Software zur Datenerfassung in "Xyz" eingestellt, die Grenzen des oberen und unteren Stapel Bild die gesamte Zelle mit allen Prozessen enthalten. Die "Schrittweite" auf 1 µm und initiiert die Stack-Erfassung über die Schaltfläche "Aufnehmen".
- Wenn die Z-Stapel-Übernahme abgeschlossen ist, verwenden Sie die Option "Maximale Projektion" in der Software alle fokalen Pläne des Stapels zu überlagern und überprüfen die Qualität der Akquisition. Dann, zurücknehmen Sie langsam die Patch-Pipette aus der Scheibe.
- Beheben Sie die Scheibe für die post-Hoc morphologische Identifikation, schnell entfernen Sie die Scheibe aus dem Bad mit einem flachen Pinsel zu, und legen Sie es zwischen zwei Filterpapiere in eine Petrischale ACFS gefüllt. Ersetzen Sie der ACFS mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung und lassen Sie die Schale im 4 ° C oder im Kühlschrank über Nacht.
5. Immunohistochemistry für Post Hoc morphologische Identifikation von aufgezeichneten Zellen
Hinweis: Nach 1 Nacht der Fixierung in PFA, kann die Scheibe im Phosphatpuffer (PB) mit Natriumazid (0,5 %) bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.
- Legen Sie die Scheibe in Tris gepufferte Salzlösung (TBS) mit Triton x-100 (0,3 %) und durchführen Sie 4 Wäschen (5-10 min).
- Legen Sie die Scheibe in TBS-Triton 0,3 % mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) für 1 h.
- Setzen Sie die Scheibe in TBS-Triton 0,3 % mit 1 % NGS und einer Streptavidin konjugiert Fluorophor (z.B.Alexa Fluor 546 konjugiert Streptavidin, 1: 200) für Übernachtung Inkubation.
- Waschen Sie 4 Mal (5-10 min) in TBS.
- Montieren Sie Scheiben auf Objektträger und Bild mit einem konfokalen Mikroskop. Um eine vollständige Zelle Rekonstruktion haben, erwerben ein Z-Stapel (Schrittweite: 1 µm) mit einem 20 X Objektiv. Für imaging eine Alexa-546-konjugiert Label festgelegt verwenden Sie 543 nm Laser und eine 515-560 nm Erkennung filtern.
6. Analyse der Katzen
- Die Fluoreszenz-Werte aus den Regionen von Interesse (ROIs) in die womit Bilder von den roten und grünen Kanäle extrahieren und Durchschnittswerte der mehrere Wiederholungen für jede Bedingung um Rauschen zu reduzieren.
Hinweis: Wenn womit Erwerb entlang der Dendriten durchgeführt wird, ist es möglich, Extrahieren von Daten aus mehreren ROIs, die dendritischen Microdomains (2 bis 5 µm) entsprechen kann, und damit die Studie von Ca2 + Signal Abschottung. - Drücken Sie für jede ROI die Änderungen in Ca2 + Amplitude als:
Hinweis: Hier G ist der Fluoreszenz-Wert aus den Grün-Kanal; G0 ist der Ausgangswert für die Fluoreszenz von den Grün-Kanal während der Pre-Stimulationsdauer; R ist der Fluoreszenz-Wert aus dem roten Kanal18. Als zwei-Photon Erregung stark lokalisiert ist und keine signifikanten Hintergrund erzeugt, ist Subtraktion des Hintergrundfluoreszenz nicht erforderlich.
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Representative Results
Mit den hier vorgestellten Protokoll, erhielten wir Katzen hervorgerufen durch somatische Stromeinspeisung und die elektrische Stimulation in Dendriten von Oriens/Alveus Interneuronen im Bereich CA1 des Hippocampus. Nach Patchen eines Neurons, identifiziert auf ihre Form und Position basierend, Wir erwarben Linescans über einem proximalen Dendriten an mehreren Punkten bei Entfernungen von Soma (Abbildung 1A) gegeben. Wir beobachteten eine Abnahme der Amplitude der Katzen induziert durch Backpropagating APs als der Abstand von der Soma erhöht (indikativ reduzierten AP Amplitude oder eine Distanz-abhängige Rückgang der Kalzium-Channel-Vertrieb, Abbildung 1 b). Nach Immunohistochemistry (mit Streptavidin-konjugiert Alexa Fluor 546) konnten wir zum Abrufen der Biocytin Kennzeichnung der Zelle und identifizieren die aufgezeichneten Neuron als Bistratified Zelle mit einem Axon Stratum Oriens und Stratum Radiatum (Abbildung zu besetzen 1 C). im zweiten Experiment wurde eine Stimulation Pipette zu einer distalen dendritischen Website gebracht. Scannen entlang der Dendriten, konnten wir dann die Amplitude der postsynaptischen Ca2 + Signale in einer gegebenen dendritische Verzweigung (Abbildung 2A–C) als Reaktion auf elektrische Stimulation von Axonen der Passage zu beurteilen. Die postsynaptischen Katzen unterschieden zwischen benachbarten dendritischen Microdomains (Segment 1 bis 6; Abb. 2D), die eine Verbreitung von Ca2 + Signal aus der Zone der Einleitung und/oder verschiedene postsynaptischen Mechanismen zugeordnet werden könnten.
Abbildung 1: Repräsentatives Beispiel für AP-evozierten Ca2 + Transienten. (A) maximale Projektion von einem zwei-Photonen- Z-Stapel (13 µm) eine gepatchte Interneuron gefüllt mit Alexa-594 (20 µM). Weiße Linien kennzeichnen die Position und Länge des Linescans. (B) Spuren zeigen die Katzen löste in den Orten gezeigt in A. Top Ablaufverfolgung zeigt den kurzen AP Zug durch somatische Stromeinspeisung während der Aufnahme Test generiert. Zeitskala ist dasselbe auf allen Spuren gezeigt. (C) maximale Projektion von einem konfokalen Z-Stapel zeigen die Biocytin Kennzeichnung der Zelle. Anfrage: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Postsynaptischen Ca2 + Transienten hervorgerufen durch ein Platzen der elektrischen Stimulation (3 Stimuli bei 100 Hz). (A) maximale Projektion von einem zwei-Photonen- Z-Stapel (148 µm) zeigt eine gepatchte Interneuron gefüllt mit Alexa-594. Weiße Pfeilspitzen verweisen auf den Speicherort der axonalen Terminals innerhalb der pyramidale Schicht, was darauf hindeutet, dass die Interneuron eine Korb-Zelle ist. (B) einzelne Brennebene illustrieren die dendritische Verzweigung wo die Stimulationselektrode positioniert wurde. Gestrichelte Linie zeigt die Position des der womit gezeigt (C1 und C2). (C) Bilder illustrieren das Ergebnis einer womit in den roten Zahlen (1; Alexa-594; 20 µM) und grün (2; Oregon Green Bapta-5N; 300 µM) Kanäle. Die Bilder wurden in kleinere Segmente, die Ausbreitung der Antwort zu analysieren, über 30 µm. (D) Spuren zeigen die Ca2 + Transienten (Katzen) in den Segmenten angezeigt in C2 entlockte, Makulatur. Obere Spur zeigt die Spannung Reaktion auf elektrische Stimulation auf der somatischen Ebene während der bildgebenden Studie aufgenommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Lösung | Komponente | Konzentration (mM) |
| ACFS-Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| Nahco33 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACFS-Recovery | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| Nahco33 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACFS Saccharose | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| Nahco33 | 26 | |
| Glukose | 10 | |
| Saccharose | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-basierte Patch Lösung | K+- Gluconat | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin di (Tris) Salz | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0,2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0.02 | |
| Oregon Green-BAPTA-1 | 0,2 |
Tabelle 1: Lösung Rezepte. Verbindungen und Konzentrationen für Lösungen während des Protokolls verwendet.
| Problem | Lösung |
| Nicht in der Lage, gesunde Neuron zu patchen | Suchen Sie Anzeichen dafür, dass die Scheiben ungesund sind: geschrumpft oder geschwollen, Zellen, sichtbare Zellkerne, etc.. Wenn ja, verwerfen Sie die Scheiben. Überprüfen Sie auch den Patch-Pipette-Widerstand und die Patch-Lösung Osmolalität; ersetzen Sie sie, wenn die Werte nicht in den entsprechenden Bereich. |
| Fluoreszenzsignal aus Dendriten ist gering | Warten Sie länger, für die Zelle zu füllen. Wenn ein Hindernis die Patch-Lösung halten von in die Zelle diffundieren, versuchen Sie, eine geringe Menge der Unterdruck in der Patch-Pipette. |
| Elektrischer Stimulation ist keine Ca2 + Reaktion hervorzurufen. | Prüfen Sie, ob ein Artefakt in der elektrophysiologischen Aufnahme. If nicht vorhanden ist, suchen Sie eine short-Kurzschluss/anregende Fehlfunktion. Falls vorhanden, erhöhen Sie die Reizintensität oder verschieben Sie die Stimulation Pipette näher an die Dendriten. Es ist darauf hinzuweisen, dass der Abstand zwischen der Stimulationselektrode und die Dendriten sollte nicht mehr als 8 Umm um direkten Depolarisation der Dendriten beim Studium der synaptischer Antworten zu vermeiden. |
| Evozierten Ca2 + Signal ist zu hoch/sättigt die Ca2 +-Indikator | Verringern Sie Laserleistung. Wenn das Problem in mehreren Zellen bestehen, verwenden Sie ein anderes Ca2 + Kennzeichen, mit einer niedrigeren Ca2 + Affinität. |
| Grundlinie Ca2 + Signal steigt allmählich während des Experiments | Für einen längeren Zeitraum zwischen den einzelnen Scans warten. Wenn die Basislinie weiter zunehmen wird, stoppen Erwerb; Es zeigt, dass die Zellgesundheit wahrscheinlich rückläufig ist. |
| Amplitude des Signals Ca2 + sinkt während der scans | Verringern Sie Laserleistung oder verkleinern Sie (falls zutreffend). |
| Dendrit ist ("Blebbing") nach dem Scannen Fragmentierung. | Reduzieren Sie die Laserleistung oder verkleinern. Wenn Blebbing auf die gezielte Dendrit beschränkt ist, wählen Sie einen anderen Dendriten und Laserleistung verringern / verkleinern. Wenn mehrere Dendriten Blebbing sind, stoppen Sie Erwerb. |
| Fluoreszenz-Signale driften"aus der Scanlinie nach fegt" | Reduzieren Sie Bewegung in der Scheibe durch Verringerung der Geschwindigkeit der ACFS Perfusion. Stellen Sie vor dem Patchen, Sie sicher, dass die Scheibe stark durch ein Netz fixiert ist. |
Tabelle 2: Problembehandlung Tabelle. Lösungen für häufige Probleme, die während einer Ca2 + imaging Experiment entstehen.
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Discussion
Die hier gezeigte Methode veranschaulicht, wie die Kombination der zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung und Patch-Clamp Elektrophysiologie verwendet werden kann, für das Studium dendritischen Ca2 + Signalisierung in neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten. Diese Methode ermöglicht eine Überwachung der beiden lokalen Ca2 + Erhebungen hervorgerufen durch elektrische Stimulation oder Backpropagating AP in dendritischen Segmenten und somatische Reaktion der Zelle. Dies macht es ein ausgezeichnetes Werkzeug zu untersuchen, wie die verschiedenen Teile der dendritischen Struktur integrieren Eingänge und kommunizieren mit dem Soma. Aber angesichts der Länge des Experiments, besonderes Augenmerk geschenkt werden die Zellgesundheit durch eine Einschränkung der Nutzung der Laserleistung für imaging der lichtbedingten Dendriten zu vermeiden. Dies kann auch durch die Zoom-Stufe verringert, verringert die Dauer des Scans und Erhöhung der Scangeschwindigkeit während der Bildaufnahme. Imaging Interneuron Dendriten führt zusätzliche Herausforderungen. Dendriten dieser Zellen haben keine Stacheln, ist entlang der Dendriten Scannen empfohlen, um die Lokalisierung der postsynaptischen Ca2 + Microdomains zu erleichtern. Darüber hinaus sind eine hohe endogene Ca2 + -Bindungskapazität, Ca2 + Erhebungen im Interneuron Dendriten kleiner und langsamer als in die Dendriten der Pyramidenzellen erzeugt. Dies erfordert mehrere womit Bilder für sowie eine ausreichend lange Dauer der einzelnen Linescans im Durchschnitt um Ca2 + Signal Kinetik angemessen zu beschreiben.
Lokale elektrischer Stimulation mit bipolaren Theta-Glaselektrode stellt ein nützliches Werkzeug zur Charakterisierung von dendritischen postsynaptischen Ca2 + Microdomains. Jedoch kann es noch aktivieren verschiedene "en passant" Axone in einer bestimmten Region gelegen. Die Anzahl der Eingänge aktiviert in diesem Fall ist unbekannt und kann mit zusätzlichen Berechnungswerkzeuge nur geschätzt werden. Zwei-Photonen-Glutamat uncaging27, die gleichzeitige Stimulation der mehrere einzelne Synapsen ermöglicht, stellt eine gute Alternative für lokale dendritischen Ca2 + Antworten zu entlocken. Diese Methode ist weit verbreitet für das Studium der wichtigsten Zellen, die klar definierte exzitatorische postsynaptischen Strukturen (Stacheln), aber ist nicht geeignet für die Untersuchung von Interneuronen, die sich insgesamt haben eine niedrige Wirbelsäule Dichte. Uncaging Glutamat entlang der Interneuron Dendrit wie es zu den wichtigsten Zellen angewendet wird würde unweigerlich aktivieren mehrere extrasynaptic Mechanismen der Ca2 + 9,10, so dass es schwierig zu interpretieren-Signalisierung der Beobachtungen.
In den letzten zehn Jahren bot Fortschritte in den optischen Technologien verbesserte zeitlichen Auflösung für zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung. Einer der vielversprechendsten ist RAM Mikroskopie (Rampe) durch akusto-optischen Deflektoren (Bevollmächtigten)28,29. Anders als konventionelle Raster Scannen scannt Rampe ausgewählte Punkten des Interesses bei hoher Frequenz, die durch die hohe Geschwindigkeit der Trägheit-freie Anweisungsbefugten ermöglicht wird. Es ist ideal für die gleichzeitige Untersuchung von mehreren dendritische Verzweigungen, da es nicht auf Punkte angelegt in einem linearen Muster beschränkt. Jedoch möglicherweise die höhere zeitliche Auflösung von der Anweisungsbefugten angeboten nicht erforderlich, wenn Ca2 + -Ereignisse dauerhaft Hunderte von Millisekunden innerhalb der gleichen Brennweite Plan imaging. Darüber hinaus kann die Position der Punkte innerhalb der gleichen Struktur des Interesses Scannen schwierig sein, Kontrolle durch Mikro-Drifts bei Slice Vorbereitungen verbunden mit einer hohen Durchblutung-Rate für gutes Stück Qualität erforderlich ist. Daher ist der hoher zeitlicher Auflösung (500-700 Hz) womit basierende Erwerbsmethode in diesem Artikel vorgestellten noch vorteilhaft, wenn Ca2 + Signale in einzelne dendritische Verzweigungen imaging.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research, Natur- und ingenieurwissenschaftlichen Forschung Rat (NSERC Discovery Grant) und der Savoy-Stiftung unterstützt. OC wurde durch ein Ph.d.-Stipendium von NSERC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
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