Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Summary

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca^{2 +} transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Abstract

Calcium (Ca^{2 +}) imaging is een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken de spatio dynamiek van intracellulaire Ca^{2 +} signalen in neuronale dendrites. CA^{2 +} schommelingen kunnen optreden door een verscheidenheid van membraan en intracellulaire mechanismen en een cruciale rol in de inductie van synaptische plasticiteit en regulering van dendritische prikkelbaarheid. Vandaar is de mogelijkheid om verschillende soorten Ca^{2 +} signalen opnemen in dendritische takken waardevol voor groepen bestuderen hoe dendrites informatie integreren. De komst van twee-foton microscopie heeft dergelijke studies aanzienlijk gemakkelijker gemaakt door het oplossen van de problemen die inherent zijn aan imaging in levend weefsel, zoals lichtverstrooiing en photodamage. Bovendien, door de combinatie van conventionele elektrofysiologische technieken met twee-foton Ca^{2 +} imaging, is het mogelijk te onderzoeken van lokale Ca^{2 +} schommelingen in neuronale dendrites parallel met opnames van synaptic activiteit in Soma. Hier beschrijven we hoe gebruiken deze methode voor de analyse van de dynamiek van lokale Ca^{2 +} transiënten (katten) in dendrites van GABAergic remmende interneuronen. De methode kan ook worden toegepast op het bestuderen van dendritische Ca^{2 +} signalering in verschillende neuronale in acute hersenen plakjes.

Introduction

De bijdrage van een neuron netwerk activiteit wordt grotendeels bepaald door de dynamische aard van de synaptische ingangen die zij ontvangt. Traditioneel, vertrouwd de overheersende methode van karakterisering van synaptic activiteit in de neuronen op somatische geheel-cel patch-clamp opnames van postsynaptisch stromingen opgeroepen door elektrische stimulatie van de axonen van passage. Echter is enige activiteit van de synapsen in de proximally gelegen naar waarheid gerapporteerd in dit geval¹. Bovendien, om te beoordelen de synapse-specifieke mechanismen, zijn opnames uit paren van neuronen en dendrites op een specifieke locatie gebruikt te richten op de synapsen van belang en de mechanismen van dendritische integratie, respectievelijk. Een belangrijke doorbraak op het gebied van synaptic fysiologie werd bereikt door een huwelijk van optische en elektrofysiologische technieken. Twee-foton excitatie laser scanning microscopie (2PLSM) in combinatie met Ca^{2 +} beeldvorming en optogenetic tools kan onthullen enorme details voor de dynamische organisatie van synaptic activiteit op bepaalde neuronale verbindingen in de hersenen segmenten, in vitro en in vivo.

Verschillende belangrijke voordelen gemaakt 2PLSM onderscheiden van de conventionele, één-foton excitatie microscopie²: (1) als gevolg van een niet-lineaire aard van twee-foton excitatie, de fluorescentie wordt alleen gegenereerd bij het focal volume en alle uitgestoten fotonen vertegenwoordigen nuttige signalen (geen noodzaak voor gaatje); (2) langere golflengten, gebruikt in 2PLSM, dringen het weefsel van de verstrooiing efficiënter; Daarnaast zijn verstrooide fotonen ook verdund tot twee-foton excitatie en achtergrond fluorescentie; (3) photodamage en fototoxiciteit zijn ook beperkt tot het brandvlak. Ondanks de hoge kosten van 2-foton systemen in vergelijking met conventionele confocal microscopen blijft de 2PLSM daarom een methode van keuze voor hoge resolutie onderzoek van neuronale structuur en functie in dikke levend weefsel.

De eerste toepassing van 2PLSM in de verstrooiing weefsel was om het imago van de structuur en functie van dendritische spines³. 2PLSM in combinatie met Ca^{2 +} imaging heeft geopenbaard die stekels functie als geïsoleerde biochemische compartimenten. Aangezien er in neuronale verschillende een-op-een correspondentie tussen stekels en individuele synapsen⁴, werd twee-foton Ca^{2 +} imaging spoedig een nuttig instrument rapportage van de activiteiten van individuele synapsen in onbeschadigde weefsel^{5, 6,7,8}. Bovendien werd 2PLSM gebaseerde Ca^{2 +} imaging met succes gebruikt om de activiteit van één calcium kanalen en de niet-lineaire interacties tussen de intrinsieke en synaptische conductances te controleren, alsmede om te beoordelen van de staat - en activiteiten-afhankelijk verordening van Ca^{2 +} signalering in neuronale dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}.

Calcium is een alomtegenwoordige intracellulaire tweede boodschapper, en haar subcellular Spatio organisatie bepaalt de richting van fysiologische reacties, van veranderingen in synaptic kracht om de regulering van de ion kanalen, dendriet en wervelkolom groei, als evenals celdood en overleving. Dendritische Ca^{2 +} waterstand optreden via activatie van meerdere trajecten. Actie potentials (APs), backpropagating naar de dendrites, open spanning-gated calcium kanalen¹² en relatief global Ca^{2 +} transiënten (katten) produceren in dendrites en stekels¹³. Synaptische transmissie wordt geassocieerd met de activering van postsynaptisch Ca^{2 +}-permeabele receptoren (NMDA, Ca^{2 +}-permeabele AMPA en kainate),^6,14,15triggering synaptic katten. Tot slot worden supralinear Ca^{2 +} gebeurtenissen gegenereerd in de dendrites onder bepaalde voorwaarden^11,12,13,16.

Twee-foton Ca^{2 +} imaging in combinatie met patch-clamp elektrofysiologische opnames maakt gebruik van synthetische Ca^{2 +}-gevoelige fluorescerende indicatoren, die meestal worden geleverd door de patch elektrode tijdens geheel-cel opnames . Een standaardmethode voor kwantificering van Ca^{2 +} dynamiek is gebaseerd op de dual indicator methode^17,18. Het maakt gebruik van twee fluorophores met goed gescheiden emissie spectra (bijvoorbeeld, een combinatie van een rode Ca^{2 +}-ongevoelig kleurstof met groene Ca^{2 +} indicatoren, zoals de Oregon groene BAPTA-1 of Fluo-4) en heeft een aantal voordelen in vergelijking met de enkele indicator methode. Ten eerste, een Ca^{2 +}-ongevoelig kleurstof wordt gebruikt om te zoeken van kleine structuren van belang (dendritische takken en stekels) waar Ca^{2 +} beeldvorming zal worden uitgevoerd. Ten tweede, de verhouding tussen de verandering in de groene en rode fluorescentie (ΔG/R) wordt berekend als een maatregel voor [Ca^{2 +}], die grotendeels ongevoelig is voor veranderingen in de basislijn fluorescentie als gevolg van fluctuaties in [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Bovendien fluorescentie wijzigingen in termen van absolute Ca^{2 +} concentraties¹⁹kunnen worden gekalibreerd.

Een algemene bezorgdheid wanneer twee-foton Ca^{2 +} imaging experimenten uitgevoerd in acute segmenten is cell gezondheid en stabiliteit van de image aquisition toe te schrijven aan de kracht van de hoge laser meestal gebruikt. Bovendien, in Ca^{2 +} imaging experimenten bestaat er bezorgdheid over de verstoring en de aanzienlijke overschatting van subcellular Ca^{2 +} dynamiek wijten aan het feit dat Ca^{2 +} indicatoren als uiterst mobiele exogene Ca^{2 fungeren +} buffers. Dus, de keuze van de Ca^{2 +} indicator en de concentratie ervan hangt af van de neuronale type, de verwachte amplitude van katten, en de experimentele vraag.

Aangepast we de methode voor twee-foton Ca^{2 +} imaging voor onderzoek van Ca^{2 +} schommelingen in de dendrites van GABAergic interneuronen^{9,10,11,20,21 , 22}. terwijl het grootste deel van de vroege Ca^{2 +} imaging studies werden gedaan in de belangrijkste neuronen, remmende interneuronen vitrine een grote verscheidenheid aan functionele Ca^{2 +} mechanismen die gescheiden zijn van die in de piramidale cellen^{20 , 23 , 24}. deze interneuron-specifieke mechanismen (bijvoorbeeld, Ca^{2 +} permeabele AMPA receptoren) kunnen spelen specifieke rollen bij het reguleren van de activiteit van de cel. Terwijl dendritische Ca^{2 +} signalering in interneuronen een verleidelijk doelwit voor verder onderzoek is, presenteert twee-foton Ca^{2 +} beeldvorming in de dendrites van deze cellen extra uitdagingen, van een dunnere diameter van dendrites en gebrek aan stekels aan een bijzonder hoge endogene Ca^{2 +} bindingscapaciteit. Als ons onderzoek focus op de studie van hippocampal interneuronen luchtvaartbedrijven, werd het volgende protocol, terwijl die van toepassing zijn verschillende neuronale populaties, aangepast om te gaan met deze uitdagingen.

Dit protocol was uitgevoerd met een commerciële confocal twee-foton microscoop, die was uitgerust met twee externe, niet-descanned detectoren (NDDs), elektro-optische modulator (EOM), en een Dodt scannen kleurovergang contrast (SGC), en geïnstalleerd op een optische tafel. De Microscoop ging gepaard met een Ti:Sapphire multiphoton laser modus-vergrendeld bij 800 nm (> 3 W, 140 fs pulsen, 80 Hz herhaling tarief). De imaging systeem was uitgerust met een standaard electrofysiologie tuig, met inbegrip van een kamer van de perfusie met temperatuurregeling, een vertalen platform met twee micromanipulators, een computergestuurde micro-elektrode-versterker, een digitizer, een stimulatie eenheid, en de software van de overname van de gegevens.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de welzijn van de dieren bescherming Comité van Université Laval en de Canadese Raad op Animal Care.

1. voorafgaande voorbereiding (optioneel: 1 dag van tevoren bereiden)

1. Bereiden drie soorten kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) oplossing (normaal, Sucrose en hersteloplossingen, 1 L elke; Zie tabel 1). De osmolaliteit van de oplossingen voor 300 ± 10 mOsm²⁵ aanpassen en de ACSF-sacharose tot een in de buurt van-vriespunt cool (0-4 ° C).
   Opmerking: Het gebruik van een zoutarm snijden oplossing (ACSF-Sucrose) helpt behouden de levensvatbaarheid van neuronen in de oppervlakkige lagen van acute segmenten²⁶.
2. 0.75 mL patch-oplossing met een rode fluorophore (b.v.Alexa-594) voor te bereiden en een groene synthetische calcium-indicator (bijvoorbeeldOregon groene BAPTA-1; Zie tabel 1). Opnemen van biocytin (Zie tabel 1) in de patch-oplossing als post hoc morfologische identificatie van de opgenomen cellen vereist is.
3. De osmolaliteit van de oplossing voor 280 ± 5 mOsm en pH 7.35 ± 0,5 aanpassen. Bewaar deze oplossing in de koelkast of op ijs te allen tijde.
   Opmerking: Keuze van de indicator calcium moet worden gebaseerd op het dynamisch bereik en de aard van de onderzochte Ca^{2 +} evenementen.
4. Patch pipetten van borosilicaatglas haarvaten (Zie Tabel van materialen) met een trekker van de micropipet, bereiden met een ≈ 2 µm tip (Pipetteer weerstand van 3-5 MΩ) en stimulatie pipetten van borosilicaat theta-glazen capillairen (Zie tabel van Materialen) met een 2-5 µm tip.
   Opmerking: De trekker van de instellingen om pipetten van een bepaalde diameter en vorm zal worden bepaald door het type trekker gloeidraad en de testresultaten van de helling van een bepaald type van glas.

2. hippocampal Slice voorbereiding

1. Anesthetize van de muis (P13-20; de stam en het geslacht van de muis wordt bepaald door de experimentele vraag) met 1 mL Isofluraan op een papieren handdoek binnen een inademing versuffing kamer geplaatst. Wanneer het dier is diep verdoofd, zoals blijkt uit een gebrek aan beweging en langzame ademhaling, verwijderen uit de zaal versuffing en onthoofden met behulp van een guillotine.
2. De schedel bloot door het snijden van de huid met een kleine schaar aan de achterkant van de schedel naar de neus. Een kleine paar mini bot rongeurs gebruiken om een gat op het niveau van de bregma te maken. Gebruik vervolgens de schaar om een caudal-naar-rostraal knippen langs de Sagittaal hechtdraad. Begrijpen de achterkant van elke schedel klep en de lift naar boven en naar buiten om te verwijderen van de schedel die betrekking hebben op elk halfrond met de rongeurs.
3. Nadat de hersenen volledig is blootgesteld, onderboden de optische zenuwen met een kleine spatel. Verwijderen van de hersenen van de schedel en zet het in een petrischaal met continu zuurstofrijk, koude ACSF-sacharose (Zie tabel 1 voor sucrose concentratie).
   1. Als weefsel van oudere muizen vereist is, voert u een intracardiac perfusie met een injectiespuit (25G) gevuld met 20 mL ijskoud ACSF-Sucrose voorafgaand aan de winning van de hersenen te verkrijgen van goede kwaliteit segmenten.
4. Hippocampal segmenten van de uitgepakte dierlijke hersenen voor te bereiden.
   1. Laat de kilte van de hersenen voor ongeveer 2 min. plaats een stukje papier van de filter op een petrischaal ijs boordevol, overdracht van de hersenen op het filtreerpapier. De twee hemisferen ontleden.
   2. Lijm de ontleed hemisferen (de afdrukstand wordt bepaald door de experimentele doel te verkrijgen van coronale, transversale, of horizontale segmenten) op een vibratome tafel en dompel het in de lade van de vibratome gevuld met zuurstofrijk ijskoude ACSF-Sucrose. 300-µm dikke sneden bij een temperatuur van ongeveer 1 ° C maken met behulp van een vibratome koeler of het ijs rond de vibratome lade plaatsen.
   3. De segmenten met de hippocampus (maximaal 6 plakjes per halfrond) met behulp van een platte kwast, accumuleren in een bad met zuurstofrijk ACSF-Recovery verwarmd tot 37 ° C.
   4. Laat de plakjes in de ACSF-Recovery bad voor ten minste 45 min.

3. geheel-cel Patch-clamp opnames

1. Instellen van een hippocampal segment in plaats in een bad geplaatst onder de doelstelling (vergroting: 40 x, numerieke diafragma: 0.8) van een laser-scanner twee-foton microscoop. Voortdurend perfuse het bad met zuurstofrijk ACSF-normaal op een snelheid van 2,5-3 mL/min bij 30-32 ° C verwarmd.
2. Infrarood differentiële interferentie contrast (IR-DIC) of Dodt-SGC microscopie gebruiken om te zoeken van een cel van belang met behulp van de grootte, vorm en positie.
   Opmerking: Afhankelijk van de bevolking gerichte neuron een transgeen muismodel inzetbaar gemakkelijk om cellen te zoeken van belang. In dit geval kan deze stap worden vervangen met gebruik van een fluorescerende lichtbron.
3. Vul een pipet stimulatie met een oplossing van de ACSF-normaal met de rode fluorophore (b.v.Alexa-594).
4. De Pipet van de stimulatie (verbonden aan een eenheid van elektrische stimulatie) op de top van het segment zo ingesteld dat de tip in dezelfde regio als de cel van belang.
5. Na het vullen van de patch-pipet met patch oplossing en het aansluiten van een hoofd stadium, het over het segment zo instellen dat de tip direct boven de cel van belang is.
6. Een injectiespuit past een drieweg afsluiter en sluit deze aan op de patch-pipet door de kunststof buis. Injecteren van constante positieve druk in de patch Pipet (≈ 0,1 mL) met behulp van de spuit. Houd de afsluiter in "close" positie.
7. Activeren van de versterker module voor de software van de controle en overschakelen naar spanning-clamp modus door te klikken op de knop "VC". Open de elektrofysiologie data acquisitie software (bijvoorbeeld, clampex) voor verwerving van elektrofysiologische signalen en klik op het pictogram "Membraan Test" dat het voortdurend sturen een vierkante spanning puls (5 mV, 10 ms), die nodig is om te controleren wijzigingen in de pipet weerstand.
8. Lager is de patch pipet tot het recht op de top van de gerichte cel. Na maken contact met de celmembraan, verwijderen de druk door de afsluiter in de "open" positie.
   Opmerking: Contact met de celmembraan wordt gedetecteerd wanneer een kleine verhoging van de weerstand van de Pipet (≈ 0.2 MΩ) wordt gezien en een kleine inspringing op de cel wordt veroorzaakt door overdruk.
9. Een lichte onderdruk toepassen door de patch Pipetteer met behulp van een lege spuit gemonteerd in de afsluiter totdat de weerstand van de pipet verstrekt door de software 1 GΩ bereikt. In het venster 'Membraan Test' van de data-acquisitie software klem de cel aan -60 mV.
10. Blijven toepassen van negatieve druk totdat de cel wordt geopend en de configuratie van de gehele-cel wordt bereikt. Detectie van deze cel staat is gebaseerd op de plotselinge verandering in de pipet weerstand (vanaf 1 GΩ tot 70-500 MΩ afhankelijk van het type interneuron) en de verschijning van grote capacitieve transiënten in het venster 'Membraan Test'.

4. twee-foton Ca^{2 +} Imaging

1. Indien u interesse hebt in de excitatory postsynaptisch reacties, voeg de GABA_A receptor blocker gabazine (10 µM) en de GABA_B receptor blocker CGP55845 (2 µM) in het bad van ACSF.
2. In software-controlemodule met versterker current-clamp de patch-configuratie instellen door te klikken op de knop "CC" en van de cel afvuren patroon opnemen in reactie op somatische injecties van de huidige depolarizing (0.8-1.0 nb, 1 s). Wacht minstens 30 min voor de cel die moet worden gevuld met de indicatoren in de patch oplossing aanwezig.
   Opmerking: Het afvuren patroon en de actieve eigenschappen van de cel kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de cel subtype; bijvoorbeeld, snel-stekelige cellen. Het is belangrijk voor de concentratie van de indicator te stabiliseren door diffusie voordat u begint met record katten (Zie tabel 2 voor probleemoplossing).
3. AP-opgeroepen katten
   1. Start met behulp van de software van de overname afbeelding afbeeldingen ophalen. Zoek een dendriet van belang met behulp van de rode fluorescentie-signaal. Om te zorgen voor een zichtbare reactie, kies eerst een proximale dendriet (≤ 50 µm) als de efficiëntie van AP backpropagation aanzienlijk met de afstand in GABAergic interneuronen^{22 afnemen}.
   2. Met behulp van de 'rechthoekige tool' in de afbeelding acquisitie software, zoom in op de gerichte regio en schakel over naar de "xt" (linescan)-modus. Plaats de scan over de dendritische tak van belang. Ingesteld met de laser intensiteit controllers in de acquisitie software, de twee-foton laser op een minimaal energieniveau waar basislijn groene fluorescentie net iets zichtbaar zijn is, om te voorkomen dat fototoxiciteit.
   3. Maak in de elektrofysiologie data acquisitie software 'Protocol' venster en beeld acquisitie software, een proces van de opname van de gewenste duur met een somatische huidige injectie van de gewenste amplitude.
      1. Met behulp van de afbeelding acquisitie software, klik op de knop "Start record" en verwerven de fluorescentie voortdurend voor 1-2 s. herhalen de Beeldacquisitie 3 - 10 keer. Wacht ten minste 30 s tussen enkele scans photodamage voorkomen. Als het verwerven van linescans op meerdere punten langs een dendriet, nemen ze in willekeurige volgorde om effecten te vermijden.
4. Synaptically-opgeroepen katten
   1. Zoek een dendriet van belang met behulp van de rode fluorescentie-signaal.
   2. Het instellen van de stimulatie pipet op het oppervlak van het segment boven de dendriet van belang. Langzaam lager de stimulatie pipet vastklikt, minimaliseren van verkeer voorkom verstoring van de gehele-cel-configuratie. Plaats de pipet op 10 tot 15 µm van de dendriet.
   3. Om te visualiseren de locatie van de synaptische microdomains in aspiny dendrites, in de afbeelding acquisitie software overschakelen naar de 'xt' (linescan)-modus en de positie van de lijn langs de dendritische tak van belang.
   4. In het 'Protocol' venster (van de elektrofysiologie data acquisitie software) en de afbeelding acquisitie software, maakt u een opname-proces dat de eenheid van de stimulatie na het proces start activeert.
   5. Met behulp van de acquisitie software, klik op de "record" startknop scannen langs de dendriet voortdurend voor 1-2 s. Repeat verwerving 3 - 5 keer, wachten 30 s tussen scans om te voorkomen dat photodamage.
      Opmerking: De lengte van de scan kan worden aangepast afhankelijk van de evoked gebeurtenis kinetiek, maar moeten worden geminimaliseerd om te voorkomen dat photodamage (Zie tabel 2 voor probleemoplossing).
   6. Herhaal stap 4.5.5 in verschillende omstandigheden (bijvoorbeeld, verschillende intensiteit/lengte van stimulatie, invoering van een farmacologische blocker, enz.) afhankelijk van de specifieke vraag.
   7. Stop de overname wanneer de cel tekenen toont van verslechterende gezondheid: depolarisatie hieronder-45 mV, verhoging van de basislijn Ca^{2 +} niveau, morfologische verslechtering van dendrites (b.v., blebbing, versnippering; Zie tabel 2 voor het oplossen van).
   8. Verwerven voor het verkrijgen van oriënterende gegevens inzake de morfologie van de cel en een register bijhouden van de locatie van de stimulatie Pipet, een stapel Z -van de cel in het rode kanaal. Met behulp van de software van de overname in 'xyz " modus, stel dan de boven- en onderlichaam stapel om het imago van de gehele cel met alle processen opgenomen. De 'stap-grootte' vastgesteldop 1 µm en initiëren van de overname van de stapel met behulp van de knop "Start record".
   9. Wanneer de Z-stapel acquisitie is voltooid, gebruikt u de optie "Maximale projectie" in de software superponeren alle focal plannen van de stack te controleren op kwaliteit van acquisitie. Vervolgens trekken langzaam de patch Pipet uit het segment.
   10. Om te bevestigen het segment voor post hoc morfologische identificatie, snel verwijderen van het segment van het bad met behulp van een platte kwast, en plaats deze tussen twee filtreerpapier, in een petrischaal ACSF gevulde. De ACSF vervangen door een 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing en laat de schotel in een kamer van 4 ° C of koelkast 's nachts.

5. Immunohistochemistry voor Post Hoc morfologische identificatie van de opgenomen cellen

Opmerking: Na 1 nacht van fixatie in PFA, het segment kan worden opgeslagen in de fosfaatbuffer (PB) met natriumazide (0,5%) voor maximaal 1 maand.

1. Zet het segment in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met Triton X-100 (0,3%) en het uitvoeren van 4 wasbeurten (5-10 minuten elk).
2. Zet het segment in TBS-Triton 0,3% met 10% normale geit serum (NGS) gedurende 1 uur.
3. Zet het segment in TBS-Triton 0,3% met 1% NGS en een daar-geconjugeerde fluorophore (b.v.Alexa Fluor 546-geconjugeerde streptavidine, 1:200) voor overnachting incubatie.
4. Wassen van 4 keer (5-10 min) in eetlepels
5. Monteren segmenten op Microscoop dia's en beeld met behulp van een confocal microscoop. Als u wilt een volledige cel reconstructie, het verwerven van een Z-stack (stap grootte: 1 µm) met behulp van een doelstelling van 20 x. Voor de beeldvorming een Alexa-546-geconjugeerde label, gebruik die een 543 nm laser en een 515-560 nm detectie filteren instellen.

6. analyse van katten

1. Pak de fluorescentie-waarden uit de regio's van belang (ROIs) in de beelden van de linescan van de rode en groene kanalen en het gemiddelde van de waarden van de meerdere herhalingen voor elke voorwaarde om lawaai te verminderen.
   Opmerking: Wanneer linescan acquisitie langs de dendriet is uitgevoerd, is het mogelijk om gegevens te extraheren uit meerdere ROIs, die kunnen overeenkomen met dendritische microdomains (2-5 µm), en waardoor de studie van de brandcompartimentering Ca^{2 +} signaal.
2. Voor elke ROI, express de veranderingen in Ca^{2 +} amplitude als:
   
   Opmerking: Hier G is de waarde van de fluorescentie van het groene kanaal; G₀ is de basislijn fluorescentie-waarde van het groene kanaal tijdens de pre stimulatie periode; R is de waarde van de fluorescentie van de rode kanaal¹⁸. Twee-foton excitatie uiterst gelokaliseerde en genereert geen een aanzienlijke achtergrond, is aftrekken van de achtergrond fluorescentie niet vereist.

Representative Results

Met behulp van het protocol gepresenteerd hier, verkregen we katten opgeroepen door somatische huidige injectie en door elektrische stimulatie in de dendrites van oriens/alveus interneuronen op de CA1-gebied van de hippocampus. Na het patchen van een neuron, geïdentificeerd op basis van de vorm en positie, verwierven we linescans over een proximale dendriet op meerdere punten gegeven op afstanden van het soma (figuur 1A). We hebben vastgesteld dat een daling van de amplitude van katten geïnduceerd door backpropagating APs als de afstand van het soma verhoogd (indicatief van verminderde AP amplitude of een afstand-afhankelijke daling van calcium kanaal distributie, figuur 1B). Na immunohistochemistry (met behulp van streptavidine-geconjugeerde Alexa Fluor 546), konden we halen het labelen van de biocytin van de cel en identificeren van de geregistreerde neuron als een bistratified cel met een axon bezetten stratum oriens en stratum radiatum (figuur 1 C). In het tweede experiment, een pipet stimulatie werd gebracht naar een distale dendritische site. Scanning langs de dendriet, konden we vervolgens beoordelen de amplitude van het postsynaptisch Ca^{2 +} signalen in een bepaalde tak van dendritische (figuur 2A--C) in reactie op elektrische stimulatie van de axonen van passage. De postsynaptisch katten verschilden tussen naburige dendritische microdomains (segment 1 tot en met 6; Figuur 2D), die kunnen worden geassocieerd met een spread van Ca^{2 +} signaal van de zone van initiatie en/of verschillende postsynaptisch daarbij betrokken mechanismen.

Figuur 1: Representatief voorbeeld van AP-opgeroepen Ca^{2 +} transiënten. (A) maximale projectie van een twee-foton Z-stack (13 µm) van een gepatchte interneuron gevuld met Alexa-594 (20 µM). Witte lijnen geven de locatie en de lengte van de linescans. (B) sporen met de katten in de locaties weergegeven in A. Top trace ontlokte toont de korte AP trein gegenereerd door somatische huidige injectie tijdens de opname proces. Tijdschaal is hetzelfde op alle sporen komt te staan. (C) maximale projectie van een confocal Z-stapel tonen de biocytin labeling van de cel. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Postsynaptisch Ca^{2 +} transiënten opgeroepen door een uitbarsting van elektrische stimulatie (3 prikkels bij 100 Hz). (A) maximale projectie van een twee-foton Z-stack (148 µm) toont een gepatchte interneuron gevuld met Alexa-594. Witte pijlpunten wijst u de locatie van axonale terminals binnen de piramidale laag, suggereert dat de interneuron is een mand-cel. (B) één brandvlak illustreren de dendritische tak waar de stimulatie elektrode is geplaatst. Onderbroken lijn toont de locatie van de linescan getoond in (C1 en C2). (C) afbeeldingen ter illustratie van het resultaat van een linescan in het rood (1; Alexa-594; 20 µM) en groen (2; Oregon groene Bapta-5N; 300 µM) kanalen. De beelden werden weggegooid in kleinere segmenten te analyseren van de verspreiding van de reactie die meer dan 30 µm. (D) sporen tonen van de Ca^{2 +} transiënten (katten) in de segmenten weergegeven in C2 ontlokte. Top trace toont de reactie van de spanning aan elektrische stimulatie opgenomen op de somatische niveau tijdens de imaging-proces. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Oplossing	Component	Concentratie (mM)
ACSF-Normal	NaCl	124
	KCl	2.5
	NaH2PO4	1,25
	MgSO4	2
	NaHCO3	26
	Glucose	10
	CaCl2	2
ACSF-herstel	NaCl	124
	KCl	2.5
	NaH2PO4	1,25
	MgSO4	3
	NaHCO3	26
	Glucose	10
	CaCl2	1
ACSF-Sucrose	KCl	2
	NaH2PO4	1,25
	MgSO4	7
	NaHCO3	26
	Glucose	10
	Sacharose	219
	CaCl2	1
K+-gebaseerde oplossing van de Patch	K+- gluconaat	130
	HEPES	10
	MgCl2	2
	Phosphocreatin di (tris) zout	10
	ATP-Tris	2
	GTP-Tris	0.2
	Biocytin	72
	Alexa-594	0.02
	Oregon groen-BAPTA-1	0.2

Tabel 1: oplossing recepten. Verbindingen en concentraties voor oplossingen gebruikt tijdens het protocol.

Probleem	Oplossing
Niet in staat om gezonde neuron pleister	Controleren op tekenen dat de segmenten ongezond zijn: ineengekrompen of gezwollen cellen zichtbaar kernen, enz. Als dat zo is, gooi de plakjes. Controleer tevens of de patch-pipet weerstand en de osmolaliteit van de patch-oplossing; Vervang ze indien de waarden niet in het juiste bereik zijn.
Fluorescentie signaal van dendrites is laag	Langer wachten voor de cel in te vullen. Als er een obstructie is het bijhouden van de patch-oplossing van verspreiden in de cel, probeert toe te passen van een kleine hoeveelheid negatieve druk in de patch-pipet.
Elektrische stimulatie is niet een Ca2 + reactie oproept	Controleren op de aanwezigheid van een artefact in de elektrofysiologische opname. Bij gebreke daarvan, check voor een korte-circuit/stimulerende eenheid storing. Indien aanwezig, het verhogen van de intensiteit van de stimulatie of de stimulatie pipet dichter naar de dendriet. Het dient te worden opgemerkt dat de afstand tussen de elektrode stimulatie en de dendriet 8 um om te voorkomen dat de directe depolarisatie van dendrites, bij de studie van synaptic reacties niet moet overschrijden.
Evoked Ca2 + signaal is ook hoog/verzadigde vetzuren de Ca2 +-indicator	Laser verminderen. Als het probleem in meerdere cellen aanhoudt, gebruik maken van een verschillende Ca2 + indicator, met een lagere Ca2 + affiniteit.
Basislijn Ca2 + signaal groeit geleidelijk tijdens het experiment	Wacht voor een langere periode tussen individuele scans. Als de basislijn neemt nog steeds toe, stoppen overname; het geeft aan dat de gezondheid van de cel waarschijnlijk daalt.
Amplitude van Ca2 + signaal vermindert tijdens scans	Laser macht te verlagen of uit te zoomen (indien van toepassing).
Dendriet is fragmenteren ("blebbing") na het scannen	De kracht van de laser te verlagen of uit te zoomen. Als blebbing beperkt tot de gerichte dendriet is, kies een andere dendriet en verminderen laser / uitzoomen. Als meerdere dendrites blebbing, stoppen met overname.
Fluorescentie signalen drijven"" uit de scan-line na veegt	Verkeer in het segment door het verminderen van de snelheid van de ACSF perfusie verminderen. Voordat het patchen, zeker dat het segment sterk wordt bevestigd in plaats door een net.

Tabel 2: tabel probleemoplossing. Oplossingen voor veelvoorkomende problemen die zich tijdens een Ca^{2 voordoen kunnen +} imaging experiment.

Discussion

De methode hieronder laat zien hoe de combinatie van de twee-foton Ca^{2 +} beeldvorming en patch-clamp electrofysiologie kan worden gebruikt voor het bestuderen van dendritische Ca^{2 +} signalering in neuronale dendrites in acute hersenen plakjes. Deze methode zorgt voor het toezicht op zowel de lokale Ca^{2 +} verhogingen die door elektrische stimulatie of backpropagating AP in dendritische segmenten, en van de cel somatische reactie opgeroepen. Dit maakt het een uitstekend hulpmiddel om te bestuderen hoe verschillende delen van de dendritische tree ingangen te integreren en te communiceren met het soma. Maar gezien de lengte van het experiment, bijzondere aandacht moet worden besteed aan de gezondheid van de cel door beperking van het gebruik van laser macht voor imaging-teneinde de photodamage van dendrites. Dit kan ook worden bereikt door het zoomniveau minderen, verminderen de duur van de scan en verhoging van de snelheid van de scan tijdens Beeldacquisitie. Interneuron dendrites Imaging introduceert extra uitdagingen. Zoals de dendrites van deze cellen hebben geen stekels, wordt scannen langs de dendriet aanbevolen om de lokalisatie van postsynaptisch Ca^{2 +} microdomains. Bovendien, zijn gezien een hoge endogene Ca^{2 +} bindingscapaciteit, Ca^{2 +} waterstand in interneuron dendrites kleiner en langzamer dan die in de dendrites van piramidale cellen worden gegenereerd. Hiervoor zijn verschillende linescan afbeeldingen voor gemiddeld en een voldoende lange looptijd van individuele linescans om te beschrijven de kinetiek Ca^{2 +} signaal op de juiste manier ophalen.

Lokale elektrische stimulatie met behulp van bipolaire-thèta-glaselektrode vertegenwoordigt een nuttig instrument voor de karakterisering van dendritische postsynaptisch Ca^{2 +} microdomains. Echter kan het nog steeds verschillende "en passant" axonen in een bepaald gebied gelegen activeren. Het aantal ingangen geactiveerd in dit geval is onbekend en slechts kan worden geraamd met behulp van extra computerhulpmiddelen. Twee-foton glutamaat uncaging²⁷, waarmee voor gelijktijdige stimulatie van meerdere afzonderlijke synapsen, vertegenwoordigt een goed alternatief voor lokale dendritische Ca^{2 +} reacties opwekken. Deze methode wordt veel gebruikt voor de studie van de belangrijkste cellen, die excitatory postsynaptisch structuren (stekels) hebben duidelijk worden omschreven, maar is niet geschikt voor de studie van interneuronen, welke totale hebben een dichtheid van de lage rug. Uncaging glutamaat langs de interneuron dendriet zoals deze wordt toegepast op de belangrijkste cellen zou onvermijdelijk activeren meerdere extrasynaptic mechanismen van Ca^{2 + 9,10}, waardoor het moeilijk te interpreteren signalering de opmerkingen.

In het laatste decennium, vooruitgang in optische technologieën aangeboden verbeterde temporele resolutie voor twee-foton Ca^{2 +} imaging. Een van de meest veelbelovende is de random-access microscopie (helling) en akoestisch-optische leidschoepen (gedelegeerd)^28,29. In tegenstelling tot conventionele raster scannen, scant OPRIT geselecteerde punten van belang op hoge frequentie, die is ingeschakeld door de hoge snelheid van traagheid-vrije gedelegeerd. Het is ideaal voor de gelijktijdige studie van meerdere dendritische takken, want het is niet beperkt tot de punten die zijn vastgelegd in een lineaire patroon. De hogere temporele resolutie aangeboden door de gedelegeerd kan echter niet onnodig wanneer imaging Ca^{2 +} evenementen duurzame honderden milliseconden binnen hetzelfde brandpunt plan. Bovendien, kan de locatie van het scannen van de punten binnen dezelfde structuur van belang zijn moeilijk te controleren als gevolg van micro-driften in segment preparaten die is gekoppeld aan een hoge perfusie-tarief, die nodig voor goede segment kwaliteit is. Vandaar is de hoge temporele resolutie (500-700 Hz) overname linescan gebaseerde methode gepresenteerd in dit artikel nog beter wanneer imaging Ca^{2 +} signalen in individuele dendritische takken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems