Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

Published: January 16, 2018 doi: 10.3791/56778
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 4, 1, 4, 3, 1
1Mass Spectrometry Core Facility, University of Sydney, 2Proteomics Core Facility, University of Technology Sydney, 3Neuropathology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney, 4Redox Biology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור אמין עבור הכנת פורמלין קבוע רקמות המיועדים ספקטרומטר מסה דימות מבוסס-סובלימציה.

Abstract

השימוש של לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון, ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI MSI) במהירות התרחב, מאז טכניקה זו מנתחת מארח של מולקולות של סמים ושומנים כדי N-glycans. למרות טכניקות שונות של הכנת המדגם קיימים, איתור פפטידים מפורמלדהיד לשימור רקמות נשאר אחד האתגרים הקשים ביותר עבור סוג זה של ניתוח spectrometric המוני. מסיבה זו, יש יצר ואנו ממוטב מתודולוגיה חזקה ששומרת המידע המרחבי הנכלל המדגם, תוך העלאת את המספר הגדול ביותר של פפטידים ionizable. יש גם כיוונו כדי להשיג זאת באופן חסכוני ופשוט, סילוק ובכך פוטנציאליים שגיאה הטיה או הכנה, אשר יכול להתרחש בעת שימוש אוטומטי מכשור. התוצאה הסופית הוא פרוטוקול זול הדירים.

Introduction

לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI MSI) כבר מועסקים כמו טכניקה התמונה לפי שני עשורים1,2, ניתוח מגוון של מולקולות כולל: ליפידים3, פפטידים2 ,4, חלבונים2,5,6,מטבוליטים7, N-glycans8ומולקולות סינתטי כגון תרופות טיפוליות9,10. מספר פרסומים הממחיש את התועלת של טכניקה זו גדלו באופן משמעותי מעל האחרון העשור6,11,12,13. מולקולות מסוימות, כגון שומנים, הם יחסית קלים לנתח באמצעות MALDI MSI, כפי שהם ionize בקלות בשל אופיו הכימי שלהם הם דורשים הכנה מוקדמת קטן3. עם זאת, עבור מטרות יותר קשה כמו פפטידים, השלבים הנדרשים כדי ביעילות ionize מולקולות אלה הם נרחב ומורכב בדרך כלל14. כיום יש מעט מאוד פרסומים שואפים כתובת או להדגים הפארמצבטית למתודולוגיות זה מועסקים להתכונן רקמה זו טכניקה חזותי ייחודי15. מסיבה זו, יש להדר תצפיות ואנו מיושמת אופטימיזציות יחיד, קל ליישום, המתודולוגיה שבה צריך לדרוש קטנטן ללא, לניתוח של פפטידים מפורמלדהיד קישורים צולבים רקמת המקור14.

כתב יד זה, תארנו מתודולוגיה לשחזור מאומתים, בעלות נמוכה עבור איתור ומיפוי המרחבי של פפטידים, שנוצר בין קפוא פורמלין-קבועה (FFF) פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) סעיפים רקמות. מתודולוגיה זו לא דורשים או להסתמך על כל מתמחה במכשור3. באופן ספציפי, אנו הכתובת על היבטים רבים של משאבות מיוחדות צורך לנתח פפטידים; פעולות אחזור אנטיגן16 ו ציפוי מטריקס. פרוטוקול שלנו מנצל גם ציוד זול, ריאגנטים, ובכך מתודולוגיה זו לנגישים קהילה רחבה יותר מי שאחרת לא יוכלו להרשות לעצמם מכשיר רובוטי חלופי17.

ההיגיון העומד מאחורי פיתוח שיטת הכנה ידנית מדגם היתה כפולה: ראשית, השימוש של המחליף יוצר ציפוי עקבית ואחידה של גבישים מטריקס כי הם ~ 1 מיקרומטר אורך18, שעצם משהו עם ריסוס נפוץ יותר טכניקות. שנית, הגדרת עלויות קטן יחסית: העלות הכוללת של המנגנון מותאם אישית היה < אוד 1500 דולר נציין, מבחינת יחס עלות-תועלת, שהמחיר לכל דגימה זול בהרבה כאשר יש מכונות רובוטית לא מעורב. השימוש של סובלימציה דווחה בעבר, עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, מתודולוגיות צעד אחר צעד אשר מתארות את התהליך הזה לטעום הכנה יש לא היה דיווח ולא המתוארים בספרות.

פרוטוקול זה נועד לסייע לחוקרים יש גישה ספקטרומטר מסה MALDI ומי נחוש הפקת המידע המרחבי ביחס ביו-המולקולה של עניין19. בעיקרו של דבר, MALDI MSI הוא צורה של היסטולוגית ההקרנה כי אין להסתמך על נוגדנים או כתמי2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שים לב: כל אמצעי זהירות ישים צריכה להיות מלווה בעת ביצוע הליך זה, כולל השימוש של ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) (למשל, חלוקים, nitrile כפפות, בטיחות משקפיים, וכו ')

1. הכנת ראגנטים וציוד

  1. אופן ההכנה של פתרונות
    1. כדי להכין 500 מ של הנוזל של Carnoy, לערבב 100% אתנול (EtOH), כלורופורם, חומצה אצטית קרחונית 6:3:1 יחס v/v/v בבקבוק זכוכית נקי צייס.
    2. כדי להפוך את נוזלי ניטרוצלולוזה (NC), להמיס NC ממברנה (נפוץ ב סופג המערבי) אצטון מסודר, על ידי עצבנות עדין, כדי ריכוז סופי של 40 מ"ג/מ"ל.
  2. הכנת NC מצופה שקופיות
    1. שימוש בטכניקה דומה לזה שהיה בשימוש עבור הכנת דם מכפיש בדיקה היסטולוגית20 להכין NC מצופה שקופיות.
    2. פיפטה µL 40 של NC נוזלי על קצה אחד של אינדיום מוליך תחמוצת בדיל (ITO) מיקרוסקופ שקופית. סלייד זכוכית רגילה במיקרוסקופ, גררו את NC תחת מתח השקופית כדי ליצור ציפוי מבטל סרט דק אפילו.
    3. לאפשר את NC לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 20 s וחנות אז עד שהוא נדרש בטמפרטורת החדר. אחסון של דגימות בתנאים אלה יכול להיות לא מוגדר בתנאי הרקמות נשמרים, ללא אבק.
      הערה: שיטת ההכנה היא הידועה יותר בשם "סרט דק", יהיה לייצר ציפוי אחיד המסתמך על צמיגות NC, כמו גם חוסר מתח עד לרמת עצמית בשקופית. היחידה הטיפול שיש לנקוט בעת הכנת השקופיות אינה נעה מהר מדי, דבר שייצור פסים של NC יותר מאשר כיסוי מלא.
      התראה: כפי NC נוזלי מתייבש מהר מאוד, זה חיוני כדי לעבוד במהירות כדי למנוע ייבוש הפתרון לפני זה פוזר כראוי. כדאי גם לשים לב כאשר טיפול NC במצב נוזלי, כמו זה הוא תרכובת מאוד אנרגטי, לא לפנות במקור הצתה למנוע פיצוץ. מבעיר. NC עובר גם מעברים תגובה אנדותרמית כאשר ייבוש, יכול לגרום לכוויות קר אם מותר לבוא במגע ממושך עם העור או ידיים בכפפות. כדי למזער סיכונים הקשורים כולם, רק כמויות קטנות צריך להיות מוכן בכל זמן (< מומלץ 1 מ"ל). ברגע יבש זה יציב בטמפרטורת החדר. עם זאת, NC יכול להישאר. אם נוכח בכמויות גדולות.
  3. יצירה של אדי מותאם אישית צ'יימברס
    1. חותכים פיסת נייר הסופג עבה עם זוג מספריים גדולות מספיק כדי להתאים התחתון חצי צלחת פטרי פלסטיק סטנדרטי (94 מ מ קוטר, בעובי 3 מ מ).
    2. חותכים את הנייר, עוזב רצועה מלבנית במרכז, באותו גודל כמו מיקרוסקופ שקופית, עוזבת מספיק עודף כך העיתון ישמור על מעמדה צלחת פטרי (משלים איור 1).

2. הכנת קטעי רקמה

  1. רקמת FFPE21.
    1. בחר את בלוק הרקמה הרצויה ואת סעיף זה עובי 12 מיקרומטר ספסל רגיל הנטען מיקרוטום ולצוף הר על גבי NC מראש מצופה איטו שקופיות.
    2. להטביע את השקופיות קסילן טריים כדי להסיר שאריות פרפין למשך 2 דקות, לחזור על הפעולה פעם נוספת.
      הערה: אם הבלוק פרפין היא נרחבת במיוחד או הרקמה הוא קטן יחסית בהשוואה לבלוק פראפין, הדגימות יכול להיות מחומם ב 60 מעלות צלזיוס להמיס הרוב משם לפני כביסה ב קסילן.
    3. לשטוף את הדגימות deparaffinized על ידי השוקע השקופיות בסדרה הממס מדורגת: 70% v/v EtOH/מים, 100% EtOH, של Carnoy נוזל, 100% EtOH, מים אולטרא טהורים ו 100% EtOH. משך הזמן של כל צלילה צריך להיות 30 s, חוץ Carnoy של הנוזל, אשר חייב להימשך 2 דקות.
      התראה: של Carnoy נוזל קסילן חייב להיות מאוחסן, בשימוש ברדס fume, כפי שהם רעילים אם נשאף.
  2. רקמות קפוא פורמלין-קבועה (FFF)
    הערה: דוגמאות צריך כבר להיות קפוא, כראוי על פי סוג הדגימה.
    1. Equilibrate רקמה מבלוק-טמפרטורת ההפעלה האזמל הקטן במשך 20 דקות22.
      הערה: טמפרטורה Equilibration תלויה בסוג של רקמות.
    2. סעיף הרקמה באמצעות מיקרוטום של הר 12 מיקרומטר, הפשרה הסעיפים על גבי NC מוכן מראש מצופה איטו שקופיות.
    3. אחסן את השקופיות desiccator ואקום על הספסל בחושך.
      הערה: דוגמאות ניתן לאחסן במשך מספר שבועות בתנאים אלה.
    4. לשטוף את הדגימות בסדרה הממס מדורגת כאמור בשביל לרקמות FFPE (2.1.3).
      הערה: יש צורך צעד deparaffinisation קסילן, כפי המדגם אינו מוטמע.

3. מתילן Crosslink הידרוליזה

  1. לטעון את השקופיות לדוגמה (FFF או FFPE) לתוך תיבת שקופיות פלסטיק אשר mmol 20 טריס-HCl (pH 8.8) מלא לפסגה. בקאדילק ולמקם אותו באמבט מים, המכיל 500 מ"ל של מים, המאפשר את תיבת לגעת בקרקעית. ואז לחמם את זה למשך 15 דקות ב 120 ° C בסיר לחץ אשר ניתן להשיג את הלחץ ההפעלה של 70 kPa.
  2. הסר את השקופיות, לאפשר להם להתקרר, תנו להן להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

4. רקמות עיכול

  1. לאחר הידרוליזה, מעיל הדגימות עם 10 µL של טריפסין פתרון (1 מ"ג/מ"ל) במים אולטרא טהורים, על ידי pipetting 10 µL של הפתרון על הקצה של סעיף הרקמה מכן, משתמש הקצה פיפטה אותו, גרור את ה-droplet על פני כל הרקמה מתחת לפני השטח המתח.
    הערה: להימנע מגרד את פני השטח רקמות עם הטיפ פיפטה, נגמר הפצת האנזים מעבר לגבולות של הקצוות רקמות.
  2. לאפשר את הדגימות לייבוש בטמפרטורת החדר.
  3. ברגע יבש, הר הדגימות בתוך החלק העליון של התא אדי נבנה בעבר (רקמות כלפי מטה) עם קלטת autoclave על אחד מקצוות השקופית (משלים איור 2).
  4. פיפטה 600 µL של פתרון המכילים מספר 1:1 v/v 100% acetonitrile ו-50 מ"מ אמוניום ביקרבונט בזהירות על גבי נייר סופג אצבע משולשת בחלק התחתון של הפטרי להופעת האצבע רטובות באופן שווה.
  5. מניחים את החלק העליון של התא אדי בתחתית חצי, הבטחת השקופית אצבעות ודגימת נייר ליישר באופן מושלם, חותם התא סביב המשווה שלה עם סרט פרפין.
  6. השאירו את הדגימה בן לילה חממה 37 ° C כדי לאפשר עיכול מלאה.

5. מטריקס ציפוי באמצעות סובלימציה

  1. ברגע מתעכל, שוקלים השקופית מדגם על איזון microanalytical חמש ספרות.
  2. טעינת השקופית על אצבע קירור המראה ואבטח אותו עם סרט נחושת, באותו אופן כמתואר הלשכה אדי (משלים איור 3).
    הערה: כדי להבטיח כי השקופית הוא יצר באופן שווה האצבע קירור, שכבה של הקלטת נחושת ממוקמת על החלק התחתון של האצבע קירור עד לרמת השטח. פעולה זו מבטיחה השקופית מצטנן אחיד אשר מוביל ואפילו בתצהיר של מטריקס.
  3. במקום 300 מ ג של חומצה α-cyano-4-hydroxycinnamic (CHCA) מטריקס לתוך צלחת פטרי זכוכית בחלק התחתון של תא, ממרח אחיד כדי ליצור שכבה דקה של מטריקס קריסטלים.
  4. להרכיב את המחליף ולאבטח את שני החצאים עם המלחציים פרסה. להשעות את שהורכב יחידה 15-20 ס מ מעל אמבט חול, טרופה ב 220 ° C, על-ידי הצבתו טבעת מתכת מחובר עמדה אביק.
  5. להתחבר התא המקור ואקום, לעסוק שואב האבק, לאפשר לו לייצב עד ~ 25 mTorr במשך 5 דקות.
  6. לארוז את האצבע קירור לפסגה עם קרח ולהוסיף 50 מ ל מים. לאפשר את המנגנון להסתפק 5 דקות נוספות לפני שתמשיך.
  7. הנמך את התא על פני החול, הקפדה שהחול לחלוטין קשר התחתון של החדר, ולהשאיר את זה למשך 45 דקות ליצור ציפוי מבטל אידיאלי של 0.22 מ ג/cm2
    התראה: להקפיד כאשר טיפול כלי זכוכית-ואקום גבוה, כמו כל נזק למכשירים, ואילו פינו, יכול לגרום כשל קטסטרופי של תא זכוכית.
  8. לאחר 45 דקות, להסיר לחדר האמבט חול באמצעות העלאת את טבעת מתכת, לפרוק את התא.
    הערה: כאשר יש כבר פרקו את התא, השקופית להסירו מהר מאוד כמו מים באוויר יתחיל לדחוס בשקופית אצבעות ודגימת מקפיא.
  9. הסר את השקופית, שוקל אותה כדי להבטיח ציפוי הרצוי הושגה.
    הערה: אם לא מספיק ציפוי השיגה, פשוט חזור על תהליך סובלימציה עבור השקופית עד עובי ציפוי הרצוי הושגה.

6. recrystallization

  1. ברגע סובלימציה, הר השקופית מדגם בתוך החלק העליון של התא אדי נבנה בעבר, כפי שתואר קודם (רקמות כלפי מטה).
  2. פיפטה 600 µL של פתרון המכילים מספר 1:1 (v/v) 100% acetonitrile ו- 0.1% v/v trifluoroacetic חומצה את המים בזהירות הנייר הסופג בחלק התחתון של הפטרי כדי להבטיח ציפוי מבטל אפילו.
  3. להרכיב את התא, המבטיח את השקופית של הכרטיסיה של מיקרוסקופ נייר ליישר באופן מושלם, להשאיר חממה 37 ° C עבור 1 h.
    התראה: לא חותם את התא.
    הערה: ברגע recrystallized, הגוון הצהוב בדרך כלל של המטריקס עליך שנה לבן, נראה מבריק פחות ומופיעות מאוד אפילו. אפשרות זו מציינת שאת recrystallization בוצעה כראוי.
  4. המדגם עכשיו הוא מוכן לניתוח.

7. אינסטרומנטציה

  1. סרוק את השקופית סורק משטח אופקי כדי ליצור תמונה דיגיטלית.
  2. טען את הדגימה ספקטרומטר מסה, ואז לנתח באמצעות פלטפורמת תוכנה מתאימה.
  3. לנתח את הדגימות במצב reflectron יון חיובי עם מגוון המונית של 750-3,500 דא, עם רזולוציה ספוט הרלוונטיים התוצאה הרצויה. ברוב המקרים, 20-50 מיקרומטר רסטר רוחב מספיקה, אולם מעט ככל 10 מיקרומטר יכול להיות בשימוש15.
    התראה: לייזרים MALDI UV הם מקור קרינה מייננת, צריך לא להיות שנצפו ישירות. ודא כי הלייזר נכלל בתוך כלי הגנה לפני מבצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אם בעקבות נכונה, פרוטוקול זה מייצר תמונות המייצגות בבירור המורפולוגיה ברוטו של הרקמה ללא שום שריטות או אחרים דפורמציות (איור 1). האימות אידיאלי עבור הכנה מדגם שבוצעו כראוי, הוא היכולת להבחין בין מבנים פיזיים שונים על-ידי שינוי מולקולת ה-being צפו ב (איור 2).

מדריך טוב לקביעה אם הדגימות הוכנו בצורה שגויה היא לבדוק נוכחות של delocalization או צבירת מטריקס; חתימות פפטיד שבולטים מעבר לגבולות של הרקמה פיזית הם אינדיקטורים מושלם זה המולקולות עברו במהלך הכנת הדוגמא. זה מוסבר בפירוט אורורק, Padula (2017)15.

הקשת פפטיד המיוצר צריך להכיל שפע גבוהה של מולקולות דיסקרטית פזורים על פני טווח המונים שבחרת1,23 (זה הוא במידה רבה לטעום התלויים, עם זאת, לא נדיר לראות מעל 50 פפטיד דיסקרטית חתימות מרקמות FFPE) (איור 3)18.

Figure 1
איור 1 : מדגם מוכן כהלכה של רקמת המוח האנושי FFF. . הדגם רקמות מעובד עם תמונה-50 מיקרומטר ומציגה מבנה מאקרו טוב הבדל ברור בין חומר לבן (WM) החומר האפור (GM). דוגמאות בהצלחה מוכן יראה בידול ברור של רקמות שונות מיקומים. כאן, יש אזור נקי למעלה-ויסות פפטיד (המיוצגת באמצעות יחס מסה-כדי-אחראי, מ/Z) 1085 באזור WM לוח א בידול נוסף מומחש העדר הצורה המוגדרים בחלונית B ואחריו שיבתה בלוח ג על ידי assaying את ההפצה של שלוש מולקולות שונות על אותו סעיף רקמת מראה כי חלקם בצורה אחידה מבוזרת, ואילו אחרים מוגבלים למיקומים פיזיים נפרדים, אנו יכולים לראות כי הכנת הדוגמא בוצעה כראוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : מקטע מוכן באופן שגוי של רקמת המוח האנושי FFF. הדגם עם תמונה-50 מיקרומטר, אבל מראה רמה בקנה מידה גדול של delocalization. הדפוסים של מולקולות בהווה על פני לוחות 1, 2 ו- 3 מדגימים בבירור כי, שלא כמו איור 1, יש אין הגדרה ברורה בין אזורים ביולוגי או הבדלים השפע של המולקולות מוצגות. מאז התמונות הן זהה, ללא קשר המולקולות ייבחרו לתצוגה, נוכל להסיק כי זה יש כבר מאותרים עקב מכינים באופן שגוי. מאז זה רקמת המוח, תוצאה זו לא הגיוני לוגי, ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הספקטרום המוני הכללית של התמונה המוצגת איור 1. הספקטרום מכיל שפע של פפטיד חתימות לאורך הקצה התחתון של הטווח ההמוני, במספר פסגות פפטיד מסה גבוהה נוכח גם כן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 1
משלים איור 1 : סכימטי לצורך חיתוך נייר הסופג שימוש בתא אדי. נייר הסופג עבה נחתך לצורה עגולה בקוטר של 94 מ מ. כרטיסיה מלבנית היא גם לגזור להתכתב עם הגודל של שקופית מיקרוסקופ זכוכית רגילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 2
2 איור משלים : הרכבה מפרטים טכניים של חדר אדים. הסכמות מראה איך לחדר האדים הניתנים להרכבה עם הערה ספציפית של מה השקופיות לדוגמה של נייר סופג, דבק כל להתכתב אחד עם השני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 3
איור משלים 3 : סכימטי של סובלימציה קאמרית הרכבה: איור זה מציג כמה שקופיות לדוגמה, המחליף, מכשיר חימום מסודרים כדי לאפשר סובלימציה לשחזור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה תוכנן כדי למקסם את הדור של המין מולקולרית ionizable תוך צמצום delocalization של analytes. גורמי מפתח כרוכות בשימוש אותו העיקרון דריסת בשעת החלת מטריצה, עיכול המדגם, או recrystallizing לאחר סובלימציה24; . כלומר, זה הפקדת אפילו אדי, מטריקס או אחרת, צריך יצירה ותחזוקה. Pipetting ממס מנקי recrystallization ועיכול, אחיד מתחת המדגם, מונע מכל אזור בודדים קבלת אדי הממס יותר מאשר בכל מקום אחר. זה חשוב למניעת היווצרות של עיבוי גלוי, הכולל מעכב delocalization של מולקולות פני השטח, כמו גם להבטיח כי המדגם באופן שווה מתעכל, recrystallized. זה הכרחי להשיג את התצהיר אפילו של מטריקס יראה מעט מדי בעצימות נמוכה יחסית, מגוון המינים, ימנע מדי היונים מדגם, גם הנמכת עוצמת ומגוון המינים25. כדי להשיג את התצהיר אפילו של מטריקס, ודא כי שכבת אפילו, רזה הקריסטלים מטריצה בגודל הומוגנית, ממוקמים ישירות מתחת טביעת רגלו של השקופית מיקרוסקופ על תנאי. אם השכבה הוא לא אחיד או רזה מדי, סובלימציה של המטריקס יתקדמו לאט מדי או יהיה לא אחיד26. הפוטנציאל של בעיות עם יישום ידני של הממס, אנזים מסתכם האינדיווידואל של המשתמש. רמה מסוימת של "פרקטיקה" דרוש על מנת להבטיח תוצאה הדיר, ייתכנו מספר הכנות שגוי בשוגג הראשונית. עם זאת, אם טיפול נלקח על מנת להבטיח כי התמונה הסופית על פי מאפייני המדגם "טוב" תרגמנו ולאחר מכן דוגמיות כראוי מוכן לא תוביל למסקנות שווא ביולוגי.

על מנת לעכל ביעילות דגימת רקמה המשומרים בכוהל (FFPE או FFF), זה חיוני כדי להסיר כמה שיותר crosslinks מתילן ככל האפשר לפני התצהיר טריפסין16. זו מושגת בקלות על ידי חימום הדגימה בסיר לחץ-> 100 מעלות צלזיוס, למשך זמן קצר, מבלי לגרום למעשה בועות זה יכול מכנית מביצועם המדגם. רקמות ניתן בקלות לאיבוד כאשר מטופלים באופן כזה, אז על מנת להתמודד עם זה, NC שקופיות הם מועסקים. אמנם לא קריטי, זה להבטיח את שלמות פיזית המדגם כאשר נתון החום, הלחץ של הממס האורגני. העיכול של המדגם ואז מושגת על ידי החלת את האנזים במצב המונע הפעלה שלו ומאפשר לו להתייבש, קרי מושעה במים טהורים אולטרה אז. תא אדי ואז עוקב אחר אותו עיקרון כמו recrystallization, מתן מספיק סביבה לחים כדי לאפשר תנועה המותאמות לשפות אחרות של האנזים כדי להיתקל, קליב את עמוד השדרה של חלבון, אבל לא מספיק "רטיבות" כדי לאפשר את פפטידים וכתוצאה מכך דריפט באופן משמעותי מן המיקום הראשוני שלהם26. Pipetting ישירות על השקופית לא delocalize כל analytes פני השטח, בשל ההשפעות של crosslinking שיורית של insolubility כללית של חלבונים גדולים במים.

למרות שאנחנו התמקדו היישום של מתודולוגיה זו פפטידים, יכול בקלות להחיל אותה על זרימות עבודה עבור הניתוח של מטבוליטים, שומנים, חלבונים שלמים. כמה צעדים יצטרך להסירו או בתוספת; חלבון שלם הדמיה אינה דורשת שלבים הפרוטאוליטי המחשוף, אך זרימת העבודה הבסיסית של מדגם חלוקתה, הרכבה ואחריו מטריקס סובלימציה, recrystallization וניתוח ניתן ליישם כמעט כל סוג הדגימה. כוונתנו עבור פיתוח פרוטוקול זה ולהבטיח את האמינות שלה ועל חוסן במהלך חקירות אמפירי נרחב, הייתה ליצור שיטה המצריכה מעט או ללא שינוי, משתמשת ציוד זול, והוא נוטה רחב קהילה בדרגות שונות של מכשור ומיומנות הביוכימי. אנו מקווים כי זה פותח דרכים חדשות של החקירה למעבדות זה אחרת יש לפטור טכניקה זו גם מורכב או יקר. אנו בטוחים גם סיפקנו שיטת הכנה סופית הדגימה הראשונה עבור פפטיד MSI. בזמן כתיבת המדריך, מתודולוגיות רוב היה מבוסס מכשור במידה רבה, עם דגש על נוחות בשימוש של ריסוס רובוטית מבוססי מתודולוגיות27,28,29. היה גם קטן בדרך של מתילן אמין מתודולוגיות הידרוליזה עם השערה לגבי ההליך הנכון של מכשירים כדי לשמש.

לסיכום, אנו רואים כי היישום של המתודולוגיה לעיל לרקמות FFPE ו- FFF, וכתוצאה מכך ביטחון רב יותר היעילות של MSI לניתוח של פפטידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין ניגוד אינטרסים או עניין מסחרי לחשוף

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר את סידני קרן בית הספר לרפואה, בלוז ואת קרן למימון חלק מעבודה זו דרך תוכנית מלגות דוקטורט שלהם עבור מחלת אלצהיימר ומחקר של גרנט גילוי ארק (DP160102063) הוענק למקוםטוב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryo Microtome Leica CM3050 For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides Bruker 8237001 For preparation and section of tissue.
Coplin Jars Sigma Aldrich S5516 For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker Kambrook KPR620BSS For preparation and section of tissue.
Sublimator Chem Glass NA For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made 
Sand bath NA NA For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish Sigma Aldrich CLS70165100 For sublimation procedure.
Vacuum Pump NA NA For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer 
Cold trap Chem Glass CG-4510-02 For sublimation procedure.
Hot Plate John Morris EW-15956-32.  For sublimation procedure.
Plastic petri dish Sigma Aldrich Z717223 For sublimation procedure.
37 °C incubator NA NA For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old 
Blotting paper Sigma Aldrich P7796 For sublimation procedure.
Nitrocellulose  Sigma Aldrich N8395 For washing of slides.
Acetone Sigma Aldrich 650501 For washing of slides.
Xylene Sigma Aldrich 214736 For washing of slides.
100% EtOH Sigma Aldrich 1.02428 For washing of slides.
70% EtOH Sigma Aldrich NA For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol 
Chloroform Sigma Aldrich C2432 For washing of slides.
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich ARK2183 For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8 Sigma Aldrich TRIS-RO For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water Sigma Aldrich NA For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate Sigma Aldrich A6141 For proteolytic cleavage. 
Trypsin Sigma Aldrich T0303 For proteolytic cleavage. 
CHCA Matrix Sigma Aldrich C2020 For recrystallisation.
Acetonitrile Sigma Aldrich 1.00029 For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)  Sigma Aldrich 302031 For recrystallisation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  3. Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
  4. O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
  5. O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
  6. Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
  7. Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
  8. Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
  9. Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
  10. Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
  11. Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11 (2012).
  12. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
  13. Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
  14. O'Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
  15. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
  16. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  17. Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
  18. Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
  19. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  20. Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55 (1925).
  21. Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
  22. Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
  23. Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
  24. Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  26. Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
  27. Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
  28. Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
  29. Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 131 ספקטרומטריית הדמיה מטריקס בסיוע לייזר desorption יינון מוטבע פרפין פורמלין קבוע רקמת הדמיה MALDI MSI סובלימציה
הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Rourke, M. B., Padula, M. P.,… More

O'Rourke, M. B., Padula, M. P., Smith, C., Youssef, P., Cordwell, S., Witting, P., Sutherland, G., Crossett, B. Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows. J. Vis. Exp. (131), e56778, doi:10.3791/56778 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter