Summary
Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.
Abstract
O uso de laser assistida por matriz dessorção/ionização, espectrometria de massa (MALDI MSI) de imagem rapidamente expandiu-se, uma vez que esta técnica analisa uma série de biomoléculas de drogas e lipídios para os N-glicanos. Embora existam várias técnicas de preparação de amostra, detectar peptídeos formol preservados os tecidos continua a ser um dos mais difíceis desafios para este tipo de análise de espectrometria de massa. Por esta razão, temos criado e otimizado de uma metodologia robusta que preserva as informações espaciais contidas dentro da amostra, enquanto a suscitar o maior número de peptídeos ionizáveis. Nós também ter mirado para alcançar este objectivo de forma simples e rentável, eliminando assim o possível erro viés ou preparação, que pode ocorrer quando usando automatizado instrumentação. O resultado final é um protocolo reprodutível e de baixo custo.
Introduction
Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI MSI) de imagem tem sido utilizada como uma técnica de imagem com base para duas décadas1,2, analisando uma série de biomoléculas incluindo: lipídios3, peptídeos2 ,4, proteínas de2,5, metabólitos6,7, os N-glicanos8e moléculas sintéticas tais como drogas terapêuticas9,10. O número de publicações, demonstrando a utilidade desta técnica tem crescido significativamente ao longo da última década,6,11,12,13. Certas moléculas, como lipídios, são relativamente fáceis de analisar através de MALDI MSI, como eles ionizam facilmente devido à sua natureza química e, portanto, requerem pouca preparação prévia3. No entanto, para alvos mais difíceis, como peptídeos, as etapas necessárias para ionizar eficazmente estas moléculas são extensos e complicados geralmente14. Atualmente, existem poucas publicações que visam endereço ou demonstram reprodutibilidade nas metodologias que são utilizadas para preparar o tecido para esta técnica visual original15. Por esta razão, nós temos compilado observações e implementado otimizações em um único, fácil de implementar, metodologia que não requer pouca ou nenhuma modificação, para a análise de peptídeos formol um reticulado tecido fonte14.
Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia reproduzível validada, de baixo custo para a detecção e mapeamento espacial de peptídeos, gerados a partir de congelados fixada em formol (FFF) e fixada em formol parafina (FFPE) cortes histologicos. Esta metodologia não exigem ou dependem de qualquer instrumentação especializada3. Especificamente, abordamos os muitos aspectos especializados da preparação da amostra necessário para analisar os peptídeos; etapas como antígeno recuperação16 e revestimento de matriz. Nosso protocolo também utiliza equipamento barato e reagentes, tornando esta metodologia acessível para uma comunidade mais alargada, que seria incapaz de pagar os aparelhos robóticos alternativo17.
O raciocínio por trás do desenvolvimento de um método de preparação de amostra manual foi dupla: em primeiro lugar, o uso de um Sublimador cria um revestimento consistente e homogêneo dos cristais de matriz que são ~ 1 µm no comprimento18, algo inatingível com pulverização mais comuns técnicas. Em segundo lugar, o conjunto relativamente pequeno de custos: o custo total do aparelho personalizado foi <$ 1500 AUD. Notamos que, em termos de custo-eficácia, o preço por exemplo é muito mais barato quando não há nenhuma maquinaria robótica envolvidos. O uso de sublimação foi relatado anteriormente, no entanto, para o melhor de nosso conhecimento, metodologias passo a passo que descrevem este processo e preparação da amostra não tem sido relatadas nem descritas na literatura.
Este protocolo destina-se a auxiliar os pesquisadores que têm acesso a um espectrômetro de massa MALDI e que têm a intenção de gerar informação espacial em relação a uma bio-molécula de interesse19. Em essência, MALDI MSI é uma forma de histológica de rastreio que não depende de anticorpos ou manchas2.
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Protocol
Atenção: Todas as precauções de segurança devem ser seguidas quando efectuar este procedimento, incluindo a utilização de equipamento de protecção adequado (EPI) (por exemplo, aventais, luvas de nitrila, óculos de segurança, etc)
1. preparação de reagentes e equipamentos
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Preparação das soluções
- Para preparar 500 mL de fluido do Carnoy, misturar 100% de etanol (EtOH), clorofórmio e ácido acético em um 6: proporção de 3:1 v/v/v num frasco Schott de vidro limpo.
- Para tornar o líquido nitrocelulose (NC), dissolva a membrana NC (comumente usada na mancha ocidental) em acetona pura, por agitação suave, a uma concentração final de 40 mg/mL.
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Preparação de slides NC revestido
- Uso uma técnica semelhante ao usado para a preparação de sangue mancha para exame histológico20 preparar NC revestido slides.
- Pipete 40 µ l de líquido NC sobre uma borda de uma lâmina de microscópio de óxido de estanho (ITO) índio condutora. Usando um microscópio de vidro normal, arraste o slide para criar um revestimento de película fina até o NC sob tensão superficial.
- Permitir que o NC secar em temperatura ambiente por 20 s e então loja até necessários à temperatura ambiente. Armazenamento das amostras sob essas condições pode ser por tempo indeterminado, desde que os tecidos são mantidos e livre de poeira.
Nota: Este método de preparação é mais conhecido como "filme fino" e irá produzir um revestimento uniforme que depende da viscosidade do NC, bem como a falta de tensão de superfície de auto-nível no slide. O único cuidado que deve ser tomado quando preparar os slides não está se movendo muito rapidamente, que irá criar estrias de NC, ao invés de uma cobertura completa.
Cuidado: Como NC líquido seca muito rapidamente, é essencial trabalhar rapidamente para evitar a secagem a solução antes que tenha sido corretamente se espalhasse. Deve também ter cuidado ao manipular NC em estado líquido, como é um composto altamente energético e não deve contatar uma fonte de ignição para evitar a explosão incendiária. NC também sofre transições endotérmicos ao secar e pode causar queimaduras de frias, se permitiu entrar em contacto prolongado com a pele ou as mãos enluvadas. Para minimizar todos os riscos, apenas pequenas quantidades devem ser preparadas em cada momento (< 1 mL é recomendado). Depois de seco é estável à temperatura ambiente. No entanto, NC pode permanecer explosiva quando presente em grandes quantidades.
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Criação de câmaras de vapor personalizado
- Corte um pedaço de papel mata-borrão grosso com uma tesoura grande o suficiente para caber no fundo metade de um prato de petri de plástico padrão (94 mm de diâmetro e 3 mm de espessura).
- Corte o papel, deixando uma faixa retangular no centro, o mesmo tamanho como uma lâmina de microscópio, deixando excesso suficiente para que o papel vai manter sua posição na caixa de Petri (complementar a Figura 1).
2. preparação de cortes de tecido
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FFPE tecido21.
- Selecione a seção em 12 µm espessura em um banco padrão montado micrótomo e flutuar de montagem para o NC pré-revestido ITO slides e bloco de tecido desejado.
- Mergulhe os slides em xilol fresca para remover a parafina residual por 2 min e repita a operação uma segunda vez.
Nota: Se o bloco de parafina é especialmente penetrante ou o tecido é relativamente pequeno em comparação com o bloco de parafina, as amostras podem ser aquecidas a 60 ° C para derreter a maioria embora antes da lavagem em xilol. - Lavar as amostras deparaffinized submergindo os slides em uma série de solvente classificado: 70% v/v EtOH/água, 100% EtOH, fluido de Carnoy, 100% EtOH, água ultra pura e 100% EtOH. A duração de cada submersão deve ser de 30 s, com exceção de fluido do Carnoy, que deve durar 2 min.
Cuidado: Do Carnoy fluido e xileno devem ser armazenados e utilizados em uma coifa, como eles são altamente tóxicos se inalado.
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Tecido congelado fixada em formol (FFF)
Nota: As amostras devem já congeladas, apropriadamente de acordo com o tipo de amostra.- Equilibrar o bloco de tecido na temperatura de funcionamento do micrótomo para 20 min22.
Nota: A temperatura de equilíbrio é depende do tipo de tecido. - Seção o tecido usando um micrótomo em 12 montagem µm e descongelar as seções em um NC pré-preparadas revestido ITO deslize.
- Armazene os slides num exsicador de vácuo no banco no escuro.
Nota: As amostras podem ser armazenadas por várias semanas sob essas condições. - Lave as amostras em uma série de solvente classificada como afirmado por tecido FFPE (2.1.3).
Nota: Não há nenhuma necessidade para uma etapa de deparaffinisation xileno como a amostra não é incorporada.
- Equilibrar o bloco de tecido na temperatura de funcionamento do micrótomo para 20 min22.
3. metileno Crosslink hidrólise
- Carrega os slides de amostra (FFF ou FFPE) em uma caixa de plástico slide que está cheio até o topo de 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Feche a caixa e coloque-o em um banho de água, contendo 500 mL de água, permitindo que a caixa para tocar o fundo. Então aquecê-lo por 15 min a 120 ° C em uma panela de pressão que pode atingir uma pressão de operação de 70 kPa.
- Remover as lâminas, permitir-lhes esfriar e deixe-os secar à temperatura ambiente por 15 min.
4. tecido digestão
- Quando hidrolisada, casaco as amostras com 10 µ l de solução de tripsina (1 mg/mL) em água ultra pura, por pipetagem 10 µ l da solução para a borda da seção de tecido em seguida, usando a mesma ponta da pipeta, arraste toda a superfície do tecido sob a superfície da gota tensão.
Nota: Evite riscar a superfície do tecido com a ponta da pipeta e sobre espalhando a enzima para além das fronteiras das bordas do tecido. - Permitir que as amostras secar à temperatura ambiente.
- Depois de seco, monte as amostras dentro da parte superior da câmara de vapor anteriormente construído (tecido voltada para baixo) com fita de autoclave em qualquer borda do slide (complementar a Figura 2).
- Pipete 600 µ l de uma solução contendo uma mistura de 1:1 v/v de bicarbonato de amónio acetonitrilo e 50 mM 100% cuidadosamente sobre o dedo de papel mata-borrão na parte inferior da caixa de Petri, até o dedo parece ser uniformemente molhado.
- Coloque a metade superior da câmara de vapor na parte inferior metade, garantindo o slide de dedo e amostra de papel alinhar perfeitamente e selar a câmara em torno de seu Equador com película de parafina.
- Deixe a amostra durante a noite em uma incubadora de 37 ° C para permitir a digestão completa.
5. matrix revestimento através de sublimação
- Uma vez digerido, pese o slide de exemplo em um equilíbrio de microanalytical de 5 dígitos.
- Montar o slide para o arrefecimento dedo do aparato de sublimação e fixe-a com fita de cobre, da mesma forma como descrito para a câmara de vapor (complementar a Figura 3).
Nota: Para garantir que o slide é contatado uniformemente pelo dedo refrigeração, uma camada de fita de cobre é colocada na parte inferior do dedo refrigerando para nivelar a superfície. Isso garante que o slide é uniformemente resfriado que leva ao mesmo deposição de matriz. - Coloque 300 mg de matriz de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) em um prato de petri de vidro na parte inferior da câmara e se espalhar uniformemente para criar uma fina camada de cristais de matriz.
- Montar o Sublimador e prenda as duas metades com a braçadeira de ferradura. Suspenda o montado unidade 15-20 cm acima de um banho de areia, pré-aquecido a 220 ° C, colocando-o em um anel de metal ligado a um stand da retorta.
- Ligue a câmara à fonte de vácuo, envolver-se o vácuo e permitir que estabilizar até mTorr ~ 25 por 5 min.
- Embalar o dedo refrigerando para o topo com gelo e adicionar 50 mL de água. Permitir que o aparelho para se contentar com um mais 5 min antes de prosseguir.
- Abaixe a câmara para a superfície da areia, garantindo que a areia completamente entra em contato com o fundo da câmara e deixá-lo por 45 min criar um revestimento ideal de 0,22 mg/cm2
PRECAUÇÃO: Deve ter cuidado ao manipular produtos vidreiros em alto vácuo, como qualquer dano ao aparelho, quando evacuado, pode resultar em uma falha catastrófica da câmara de vidro. - Depois de 45 min, remova a câmara do banho de areia, levantando-se do anel metálico e a câmara de ventilação.
Nota: Uma vez que a câmara tem sido ventilada, o slide deve ser removido muito rapidamente como água no ar começa a condensar no slide dedo e amostra de congelação. - Remover o slide e pesá-lo para assegurar o revestimento desejado foi alcançado.
Nota: Se foi conseguido revestimento insuficiente, simplesmente repita o processo de sublimação para o slide até a espessura de revestimento desejado tenha sido alcançada.
6. recristalização
- Uma vez sublimada, monte o slide de amostra para dentro da parte superior da câmara de vapor anteriormente construído, como descrito (tecido anterior voltada para baixo).
- Pipete 600 µ l de uma solução contendo uma mistura de 1:1 (v/v) de 100% acetonitrila e 0,1% v/v ácido trifluoroacético em água cuidadosamente sobre o papel mata-borrão na parte inferior da caixa de Petri para assegurar um revestimento mesmo.
- Montar a câmara, garantindo o slide papel de guia e microscópio alinhar perfeitamente e deixar em uma incubadora de 37 ° C por 1 h.
Cuidado: Não veda a câmara.
Nota: Uma vez recristalizado, normalmente amarelo hue da matriz deve mudar para branco, olhar menos brilhante e aparecem muito mesmo. Isso indica que a recristalização foi executada corretamente. - A amostra está agora pronta para análise.
7. instrumentação
- Digitalize o slide em um scanner de mesa para criar uma imagem digital.
- Carregar a amostra para o espectrômetro de massa e em seguida analisar usando a plataforma de software apropriado.
- Analise as amostras no modo de reflectron íon positivo com uma escala em massa de 750-3.500 Da, com uma resolução de ponto é aplicável para o resultado desejado. Na maioria dos casos, 20-50 µm Largura de varredura é suficiente, no entanto, tão pouco quanto 10 µm podem ser usados15.
Cuidado: MALDI UV lasers são uma fonte de radiação ionizante e não devem ser vistos diretamente. Certifique-se de que o laser está contido em instrumento de proteção antes da operação.
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Representative Results
Se seguidas corretamente, este protocolo produz imagens que representam claramente a morfologia bruta do tecido sem nenhum arranhão ou outras deformações (Figura 1). A validação ideal para uma preparação de amostra realizada corretamente, é a capacidade de distinguir entre diferentes estruturas físicas, alterando a molécula sendo vistos (Figura 2).
Um bom guia para determinar se as amostras foram preparadas incorretamente é para verificar a presença de deslocalização ou agregação de matriz; assinaturas de peptídeo que se estendem além das fronteiras do tecido físico são indicadores perfeitos que moléculas moveram durante a preparação da amostra. Isto é explicado em detalhes em O'Rourke e Padula (2017)15.
O espectro de peptídeo produzido deve conter uma grande abundância de moléculas discretas que são bem distribuídos em toda a gama de massa escolhido1,23 (isto é em grande parte da amostra dependente, no entanto, não é incomum ver superior a 50 assinaturas de peptídeo discreta do tecido FFPE) (Figura 3)18.
Figura 1 : Uma amostra corretamente preparada do tecido do cérebro humano de FFF. Esta amostra de tecido transformados tem sido fotografada em 50 µm e mostra macro boa estrutura e uma clara diferença entre a substância branca (WM) e massa cinzenta (GM). Amostras preparadas com sucesso mostrará uma diferenciação clara dos locais de diferentes tecidos. Aqui, há uma região clara da regulação do peptide (representado pela relação massa-de-carga, M/Z) 1085 na região WM do painel A. diferenciação é ainda mais demonstrada pela ausência dessa forma definida no painel B, seguido por seu retorno no painel C. Análise da distribuição de três moléculas diferentes na mesma seção tecido e mostrando que alguns estão uniformemente distribuídos, enquanto outros são limitados a discretos locais físicos, podemos ver que a preparação da amostra foi executada corretamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Uma seção incorretamente preparada de tecido do cérebro humano de FFF. Este modelo tem sido fotografado em 50 µm, mas mostra um nível de grande escala de deslocalização. Os padrões das moléculas presentes em painéis de 1, 2 e 3 demonstram claramente que, ao contrário da Figura 1, não há nenhuma definição clara entre regiões biológicas ou diferenças na abundância das moléculas exibido. Desde que as imagens são as mesmas, independentemente das moléculas selecionadas para exposição, podemos concluir que ele tem sido deslocalizado devido incorretamente sendo preparado. Já que este é o tecido cerebral, este resultado não faz sentido lógico, biológico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : O espectro de massa global da imagem exibida em Figura 1. O espectro contém uma abundância de assinaturas de peptídeo em toda a extremidade inferior da faixa de massa, com vários picos de alta massa peptídeo presentes também. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1 : Esquemático para corte um toalhete de papel usado na câmara de vapor. Papel mata-borrão grosso é cortado em uma forma circular com um diâmetro de 94 mm. Um guia retangular também é talhado para corresponder com o tamanho de um padrão de vidro de microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 2 : Esquema de montagem da câmara de vapor. Este esquema mostra como a câmara de vapor deve ser montada com nota específica de como os slides de amostra, um toalhete de papel e fita adesiva correspondem uns com os outros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 3 : Esquemático do conjunto de câmara de sublimação: Esta figura mostra como o slide de amostra, Sublimador e aparelhos de aquecimento são arranjados para permitir que a sublimação pode ser reproduzida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo foi projetado para maximizar a geração de espécies moleculares ionizáveis, eliminando a deslocalização dos analitos. Fatores-chave envolvem usando os mesmos princípios de substituição, ao aplicar a matriz, digerindo a amostra, ou recristalização após sublimação24; ou seja, que um mesmo deposição de vapor, de matriz ou caso contrário, precisa ser criado e mantido. Pipetagem lavagens de solventes para a recristalização e digestão, uniformemente debaixo da amostra, impede qualquer área individual, recebendo o vapor solvente mais do que em qualquer outro lugar. Isto é importante para prevenir a formação de condensação visível e globalmente inibe a deslocalização das moléculas de superfície, bem como assegurar que a amostra é uniformemente digerida e recristalizada. É imperativo para atingir uma mesmo deposição de matriz, como muito pouco irá mostrar uma relativamente baixa intensidade e diversidade de espécies e demais irá suprimir os íons da amostra, também reduzindo a intensidade e diversidade de espécies,25. Para alcançar uma mesmo deposição de matriz, certifique-se de que um mesmo, fina camada de cristais de matriz de tamanho homogêneo, são colocados diretamente abaixo da pegada da suspensão de microscópio. Se a camada é muito fina ou irregular, sublimação da matriz vai prosseguir muito lentamente ou será desigual26. O potencial questões com aplicação manual de solvente e enzima se resume à experiência individual do usuário. Algum nível de "prática" é necessária para garantir um resultado repetitivo, e pode haver alguma preparação inicial de incorreta acidental. No entanto, se cuidado é tomado para assegurar que a imagem final é de acordo com as propriedades da amostra "bom" ter fornecido e, em seguida, qualquer amostras inadequadamente preparadas não vão levar a conclusões falsas biológicas.
A fim de efetivamente digerir uma amostra de tecido preservada em formol (FFPE ou FFF), é essencial para remover o máximo das ligações cruzadas de metileno como possível antes da deposição de tripsina16. Isso é facilmente obtido por aquecimento a amostra em uma panela de pressão no > 100 ° C, por um período curto, sem na verdade causar bolhas que mecanicamente podem dissociar a amostra. Tecido pode ser facilmente perdido quando tratada de forma, portanto, para combater isso, NC slides são empregados. Enquanto não crítico, isso garante a integridade física da amostra quando submetido ao calor, pressão e solventes orgânicos. Digestão da amostra é então conseguida aplicando a enzima em um estado que impede sua ativação e em seguida, permitindo que seque, ou seja, suspenso em água ultra pura. A câmara de vapor, em seguida, segue o mesmo princípio como recristalização, fornecendo o suficiente de um ambiente úmido para permitir o movimento localizado da enzima para encontrar e cleave a espinha dorsal da proteína, mas não o suficiente "umidade" para permitir que os peptídeos resultantes à deriva significativamente de sua localização inicial26. Pipetagem diretamente no slide não irá delocalize qualquer superfície analitos, devido os efeitos de reticulação residual e a insolubilidade geral de grandes proteínas na água.
Embora nos focamos sobre a aplicação desta metodologia de peptídeos, pode ser facilmente aplicado para fluxos de trabalho de análise de metabólitos, lipídios e proteínas intactas. Alguns passos precisa ser removido ou aumentada; imagem de proteína intacta não requer quaisquer etapas de clivagem proteolítica, mas o fluxo de trabalho fundamental de amostra de corte e montagem, seguida de análise, recristalização e sublimação de matriz pode ser aplicada a quase qualquer tipo de amostra. Nossa intenção para o desenvolvimento deste protocolo e garantir a sua fiabilidade e robustez através de extensas investigações empíricas, era criar um método que requer pouca ou nenhuma modificação, que usa o equipamento de baixo custo e é passível de uma ampla Comunidade com vários graus de instrumentação e a habilidade bioquímica. Esperamos que isso abre novos caminhos de investigação para laboratórios que caso contrário teria demitido esta técnica como demasiado complicado ou caro. Também estamos confiantes de que temos desde o primeiro método de preparação de amostra definitiva para peptídeo MSI. No momento da escrita, a maioria das metodologias foram em grande parte baseada em instrumentação, com uma ênfase particular sobre a facilidade de uso de pulverização robótico com base em metodologias de28,de27,29. Também tem havido pouco na maneira como metodologias de hidrólise de metileno confiável com conjecturas quanto ao procedimento correto e o aparelho deve ser usado.
Em conclusão, consideramos que a aplicação da metodologia acima aos tecidos FFPE e FFF, irá resultar em maior confiança na eficácia de MSI para a análise de peptídeos.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesse ou interesse comercial para divulgar
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer a Sydney Medical School Foundation e Fundação e Blues para o financiamento de parte deste trabalho através do seu programa de bolsa de doutorado para investigação da doença de Alzheimer e uma concessão de ARC descoberta (DP160102063), atribuído a PKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
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