الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

Summary

هذا البروتوكول وصف أسلوب استنساخه وموثوق بها لإعداد المستندة إلى التسامي الفورمالين الثابتة الأنسجة الموجهة للتصوير الطيف الكتلي.

Abstract

استخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين، الكتلي التصوير (استخدام MSI) وقد توسعت بسرعة، منذ هذا الأسلوب بتحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية من الأدوية والدهون إلى جليكانس ن. على الرغم من وجود تقنيات إعداد نموذج مختلف، اكتشاف الببتيدات من فورمالدهايد الحفاظ على الأنسجة يبقى واحداً من أصعب التحديات لهذا النوع من التحليل الشامل والمطيافيه. لهذا السبب، نحن إنشاء وتحسين منهجية قوية تحافظ على المعلومات المكانية الواردة ضمن العينة، مع التماس أكبر عدد من الببتيدات التأين. ونحن أيضا تهدف إلى تحقيق هذا الهدف بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وبالتالي القضاء على خطأ التحيز أو إعداد المحتملة، التي يمكن أن تحدث عند استخدام الآلي الأجهزة. والنتيجة النهائية بروتوكول استنساخه وغير مكلفة.

Introduction

استخدمت الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين كأسلوب صورة القائمة للعقدين الماضيين^1،2، تحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية بما في ذلك: الدهون³، الببتيدات^{2 ،4}البروتينات^2،5، والايضات^6،7، جليكانس ن⁸والجزيئات الاصطناعية مثل العقاقير العلاجية^9،10. ازداد عدد المنشورات التي تبين مدى فائدة هذا الأسلوب إلى حد كبير على الماضي العقد^6،11،،من¹²¹³. بعض الجزيئات، مثل الدهون، سهلة نسبيا لتحليل عن طريق استخدام MSI، كما أنها تتأين سهولة نظراً لطبيعتها الكيميائية ومن ثم تتطلب إعداد مسبق قليلاً³. أكثر صعوبة من الأهداف مثل الببتيدات والخطوات المطلوبة لفعالية تتأين هذه الجزيئات غير واسعة ومعقدة عموما¹⁴. وهناك حاليا عدد قليل جداً من المنشورات التي تهدف إلى معالجة أو إثبات إمكانية تكرار نتائج في المنهجيات التي تستخدم لإعداد الأنسجة لهذه التقنية البصرية الفريدة¹⁵. ولهذا السبب، لدينا تجميع الملاحظات وتنفيذ تحسينات في واحدة، سهلة التنفيذ، المنهجية التي ينبغي أن تتطلب القليل إلى أي تعديل، لتحليل الببتيدات من فورمالدهايد تصميمهما الأنسجة المصدر¹⁴.

في هذه المخطوطة، لقد قمنا بوصف منهجية استنساخه تم التحقق من صحتها، ومنخفضة التكلفة للكشف ورسم الخرائط المكانية من الببتيدات، المتولدة من الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) أقسام الأنسجة وثابتة الفورمالين المجمدة (FFF). لا تتطلب هذه المنهجية أو الاعتماد على أي الأجهزة المتخصصة³. على وجه التحديد، علينا التصدي للجوانب العديدة لإعداد نموذج المتخصصة اللازمة لتحليل الببتيدات؛ خطوات مثل استرجاع مستضد¹⁶ ومصفوفة الطلاء. لدينا بروتوكول يستخدم أيضا معدات غير مكلفة والمواد الكاشفة، مما يجعل هذه المنهجية من الوصول إلى مجتمع أوسع الذي خلاف ذلك سيكون غير قادر على تحمل تكاليف الأجهزة الروبوتية بديل¹⁷.

كان السبب الكامن وراء تطوير أسلوب إعداد عينة يدوي شقين: أولاً، استخدام سوبليماتور يقوم بطلاء متجانسة ومتسقة من بلورات المصفوفة التي هي ~ 1 ميكرومتر في الطول¹⁸، شيء لا يمكن تحقيقه برش أكثر شيوعاً تقنيات. ثانيا، إعداد تكاليف صغيرة نسبيا: بلغت التكلفة الإجمالية لجهاز مخصص < 1500 دولار أسترالي ونلاحظ، من حيث فعالية التكاليف، السعر لكل عينة أرخص بكثير عندما يوجد لا الآلات الروبوتية. استخدام التسامي أبلغ سابقا، ومع ذلك، على حد علمنا، لم تم الإبلاغ عن المنهجيات خطوة بخطوة التي تصف هذه العملية ونماذج إعداد لا الموصوفة في الأدب.

هذا البروتوكول يهدف إلى مساعدة الباحثين التي يستطيعون الوصول إلى استخدام مطياف كتلة، والذين عازمة على توليد المعلومات المكانية بالنسبة لجزيء بيو الفائدة¹⁹. في جوهرها، هي استخدام MSI شكلاً من أشكال النسيجي الفرز التي لا تعتمد على الأجسام المضادة أو البقع².

Protocol

تنبيه: جميع احتياطات السلامة الواجبة التطبيق ينبغي اتباعها عند تنفيذ هذا الإجراء، بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) (مثلاً، مختبر المعاطف، القفازات النتريل، سلامة النظارات، إلخ)

1-إعداد الكواشف والمعدات

1. إعداد الحلول
   1. إعداد 500 مل السائل في كارني، خلط الإيثانول 100% (EtOH)، كلوروفورم، وحمض الخليك الجليدية في 6: نسبة 3:1 v/v/v في زجاجة شوت زجاج نظيفة.
   2. لجعل السائل النيتروسليلوز (NC)، تذوب غشاء NC (تستخدم عادة في النشاف غربي) في الأسيتون أنيق، بالانفعالات لطيف، إلى تركيز نهائي من 40 ملغ/مل.
2. إعداد شرائح NC المغلفة
   1. استخدام تقنية مماثلة لتلك المستخدمة لإعداد الدم مسحات ل الفحص النسيجي²⁰ إلى إعداد NC مغلفة بالشرائح.
   2. "الماصة؛" ميليلتر 40 من نورث كارولاينا السائل على حافة واحدة من شريحة مجهر إنديوم موصل أكسيد القصدير (إيتو). استخدام شريحة الميكروسكوب زجاجية عادية، اسحب NC تحت التوتر السطحي عبر الشريحة لإنشاء طلاء حتى رقيقة.
   3. تسمح NC لتجف في درجة حرارة الغرفة 20 s والمتجر ثم حتى حاجة في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين العينات في ظل هذه الظروف إلى أجل غير مسمى شريطة المحافظة على الأنسجة وخالية من الغبار.
      ملاحظة: هذا الأسلوب من إعداد المعروف "رقيقة" وسوف ينتج طلاء موحد يعتمد على لزوجة NC، فضلا عن افتقاره إلى التوتر السطحي المستوى الذاتي على الشريحة. فقط الرعاية التي ينبغي اتخاذها عند إعداد الشرائح لا تتحرك بسرعة كبيرة جداً، مما سيخلق الشرائط NC بدلاً من تغطية كاملة.
      تنبيه: كما NC السائل يجف بسرعة كبيرة، من الضروري للعمل بسرعة لتفادي التجفيف الحل قبل قد انتشر بشكل صحيح. ينبغي أيضا توخي الحذر عند التعامل مع نورث كارولاينا في حالته السائلة، كما هو مركب نشيطة جداً ولا ينبغي الاتصال بمصدر الإشعال منع انفجار حارقة. كما يخضع NC انتقالات ماص للحرارة عند التجفيف ويمكن أن تسبب الحروق الباردة إذا سمح لفترات طويلة تتلامس مع الجلد أو الأيدي القفاز. لتقليل المخاطر المرتبطة بها جميعا، ينبغي إعداد كميات صغيرة فقط في كل مرة (< ينصح مل 1). وبمجرد جفاف أنها مستقرة في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، يمكن أن تظل NC المتفجرة عندما تكون موجودة بكميات كبيرة.
3. إنشاء دوائر بخار مخصصة
   1. قص قطعة من ورق نشاف ثخين مع زوج من مقص كبيرة بما يكفي لاحتواء الجزء السفلي نصف طبق بيتري البلاستيك القياسية (94 مم وقطرها 3 مم).
   2. قص الورقة، ترك شريط مستطيل في الوسط، بنفس حجم شريحة مجهر، ترك ما يكفي الزائدة حيث أن الورقة سوف تحافظ على موقفها في طبق بتري (تكميلية الشكل 1).

2-إعداد مقاطع الأنسجة

1. الأنسجة FFPE²¹.
   1. حدد كتلة الأنسجة المرجوة وقسم أنه في 12 ميكرون سمك في مقاعد البدلاء قياسية محملة مبضع وتعويم جبل على NC المغلفة مسبقاً إيتو الشرائح.
   2. غمر شرائح زيلين نفط جديدة لإزالة البارافين المتبقية لمدة 2 دقيقة، وكرر العملية مرة ثانية.
      ملاحظة: إذا كانت كتلة البارافين منتشر خاصة أو الأنسجة صغيرة نسبيا بالمقارنة مع كتلة البارافين، يمكن تسخين العينات عند 60 درجة مئوية لإذابة أغلبية بعيداً قبل الغسيل في زيلين نفط.
   3. تغسل العينات ديبارافينيزيد بغمر الشرائح في سلسلة المذيبات متدرج: 70% v/v EtOH المياه، 100% EtOH، كارني للسوائل، 100% EtOH، مياه نقية جداً و 100% EtOH. وينبغي أن تكون مدة غمر كل 30 ثانية، باستثناء السائل في كارني، والتي يجب أن تستمر 2 دقيقة.
      تنبيه: السائل في كارني وزيلين نفط يجب المخزنة والمستخدمة في غطاء دخان، كما أنها شديدة السمية إذا استنشق.
2. الأنسجة الثابتة الفورمالين المجمدة (FFF)
   ملاحظة: العينات يجب الفعل تجميد، على نحو مناسب وفقا لنوع العينة.
   1. حجته كتلة الأنسجة عند درجة حرارة التشغيل مبضع ل 20 دقيقة²².
      ملاحظة: درجة حرارة الموازنة تعتمد على نوع الأنسجة.
   2. قسم الأنسجة باستخدام مبضع في جبل 12 ميكرومتر وذوبان الجليد المقاطع على NC معدّة سلفا المغلفة إيتو الشريحة.
   3. تخزين الشرائح في مجفف فراغ على مقاعد البدلاء في الظلام.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات لعدة أسابيع في ظل هذه الظروف.
   4. تغسل العينات في سلسلة المذيبات متدرج كما ذكر للأنسجة FFPE (2.1.3).
      ملاحظة: ليست هناك حاجة لخطوة ديبارافينيسيشن زيلين نفط ليس هو جزءا لا يتجزأ من العينة.

3-الميثيلين التشعب التحلل المائي

1. تحميل الشرائح عينة (FFF أو FFPE) في مربع شريحة بلاستيكية التي مليئة بالأعلى 20 ملمول تريس-HCl (pH 8.8). ختم المربع ووضعه في حمام مائي، التي تحتوي على 500 مل الماء، يسمح مربع للمس الأسفل. ثم الحرارة لمدة 15 دقيقة على 120 درجة مئوية في طنجرة الضغط الذي يمكن أن تحققه ضغط تشغيل 70 كيلو باسكال.
2. إزالة الشرائح، وتسمح لهم ببارد، والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

4-الأنسجة الهضم

1. عندما تحلل، معطف العينات مع 10 ميليلتر لحل التربسين (1 ملغ/مل) في المياه النقية فائقة، قبل بيبيتينج ميليلتر 10 الحل على حافة مقطع الأنسجة، ثم استخدام نفس تلميح ماصة، اسحب الحبرية عبر السطح كله من الأنسجة تحت سطح التوتر.
   ملاحظة: تجنب خدش سطح النسيج مع طرف ماصة، وعبر نشر الإنزيم خارج حدود حواف الأنسجة.
2. تسمح العينات لتجف في درجة حرارة الغرفة.
3. وبمجرد جفاف، جبل العينات داخل الجزء العلوي من قاعة بخار شيدت سابقا (الأنسجة أسفل) مع شريط اﻷوتوكﻻف أما الحافة من الشريحة (تكميلية الشكل 2).
4. "الماصة؛" 600 ميليلتر من محلول يحتوي على مزيج 1:1 v/v من بيكربونات الأمونيوم الاسيتو الانيتريل و 50 مم 100% بعناية على ورقة نشاف الإصبع في الجزء السفلي من صحن بيتري حتى يبدو أن الإصبع الرطب بالتساوي.
5. ضع النصف العلوي من قاعة بخار في أسفل النصف، وضمان الشريحة الإصبع ونموذج ورقة محاذاة تماما، وختم الدائرة حول به خط الاستواء مع الفيلم البارافين.
6. اترك العينة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح بإكمال عملية الهضم.

5-مصفوفة الطلاء عبر التسامي

1. وبمجرد يهضم، تزن الشريحة عينة على توازن ميكرواناليتيكال 5 أرقام.
2. جبل الشريحة على إصبع تبريد جهاز التسامي وآمنة مع الشريط النحاس، بنفس الطريقة كما هو موضح لقاعة بخار (تكميلية الشكل 3).
   ملاحظة: للتأكد من أن الشريحة يتم الاتصال بالتساوي بأصبع التبريد، يتم وضع طبقة من الشريط النحاس على الجزء السفلي من إصبع تبريد مستوى السطح. وهذا ما يضمن أن الشريحة يتم تبريده بشكل متساو مما يؤدي إلى ترسب حتى من المصفوفة.
3. ضع 300 ملغ من حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك (شكا) مصفوفة في طبق بتري زجاج في الجزء السفلي من الدائرة وانتشارها بشكل متساو لخلق طبقة رقيقة من بلورات المصفوفة.
4. التجمع في سوبليماتور وتأمين النصفي مع المشبك حدوة الحصان. تعليق تجميع الوحدة 15-20 سم فوق حمام رملي، يسخن في 220 درجة مئوية، بوضعه في حلقة معدنية متصلة بموقف معوجة.
5. توصيل الدائرة بمصدر فراغ والانخراط في الفراغ، والسماح لها بتحقيق الاستقرار وصولاً إلى متور ~ 25 لمدة 5 دقائق.
6. حزمة إصبع تبريد إلى الأعلى مع الجليد وإضافة 50 مل الماء. السماح لجهاز لتسوية 5 دقائق أخرى قبل المتابعة.
7. انخفاض الدائرة على سطح الرمل، ضمان اتصالات الرمال تماما الجزء السفلي من الغرفة، وترك الأمر لمدة 45 دقيقة لإنشاء طلاء مثالية من 0.22 ملغم/سم²
   تنبيه: يجب توخي الحذر عند التعامل مع الأواني الزجاجية في فراغ عالية، كأي ضرر للجهاز، في حين تم إجلاء، يمكن أن يؤدي في فشل ذريع لقاعة الزجاج.
8. وبعد 45 دقيقة، إزالة الدائرة من حمام الرمل برفع حلقة معدنية والتنفيس عن الدائرة.
   ملاحظة: بمجرد قد تم تنفيس الدائرة، الشريحة يجب إزالتها بشكل سريع جداً كما سوف تبدأ المياه في الجو تتكثف على الشريحة الإصبع وعينه تجميد.
9. قم بإزالة الشريحة وتزن على كفالة الطلاء المطلوب قد تحقق.
   ملاحظة: إذا أنجز طلاء غير كافية، ببساطة تكرار عملية التسامي للشريحة حتى سمك الطلاء المطلوب قد تحقق.

6-البلورة

1. بمجرد المتسامي، جبل الشريحة عينة داخل الجزء العلوي من قاعة بخار المشيدة سابقا، كما وصف سابقا (الأنسجة إلى الأسفل).
2. "الماصة؛" 600 ميليلتر من محلول يحتوي على 1:1 (v/v) مزيج من حامض trifluoroacetic v/v الاسيتو الانيتريل و 0.1% 100% في الماء بعناية على ورقة نشاف في الجزء السفلي من صحن بيتري لضمان طلاء حتى.
3. تجميع الدائرة، وضمان الشريحة التبويب ومجهر ورقة محاذاة تماما، وترك في حاضنة 37 درجة مئوية أجل ح 1.
   تنبيه: لا ختم الدائرة.
   ملاحظة: مرة واحدة يتطلب، هوي الأصفر عادة من المصفوفة يجب تغيير إلى اللون الأبيض وتبدو أقل لامعة وتظهر جداً حتى. يشير هذا إلى أن البلورة قد أجريت بشكل صحيح.
4. النموذج جاهز الآن للتحليل.

7-الأجهزة

1. تفحص الشريحة في الماسح ضوئي مسطح لإنشاء صورة رقمية.
2. تحميل العينة في مطياف كتلة وتحليلها ثم استخدام منصة برمجيات مناسبة.
3. تحليل العينات في وضع ريفليكترون أيون إيجابية مع مجموعة شامل دا 750-3,500، مع دقة موضعية التي تنطبق على النتيجة المرجوة. في معظم الحالات، 20-50 ميكرون النقطية العرض غير كافية، ولكن أقل من 10 ميكرون يمكن أن تستخدم¹⁵.
   تحذير: استخدام الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر مصدرا من مصادر الإشعاع المؤين وينبغي أن لا ينظر إليها مباشرة. ضمان أن الليزر يرد ضمن صك التدريع قبل إجراء العملية.

Representative Results

إذا اتبعت بشكل صحيح، ينتج هذا البروتوكول الصور التي تمثل وضوح مورفولوجية إجمالية للأنسجة دون أي خدوش أو التشوهات الأخرى (الشكل 1). التحقق من صحة مثالية لإعداد نموذج يقوم بشكل صحيح، القدرة على التمييز بين مختلف الهياكل المادية عن طريق تغيير يجري جزيء شوهدت (الشكل 2).

دليل جيد لتحديد ما إذا كانت العينات قد أعدت بشكل غير صحيح للتحقق من وجود تمركز أو تجميع مصفوفة؛ تواقيع الببتيد التي تمتد إلى ما وراء حدود الأنسجة الجسدية هي مؤشرات الكمال الجزيئات تحركت أثناء إعداد عينة. وهذا هو شرح بالتفصيل في اورورك وبادلا (2017)¹⁵.

الطيف الببتيد المنتجة، يجب أن تحتوي على وفرة عالية من الجزيئات المنفصلة التي يتم توزيعها أيضا عبر^1،النطاق الجماعي الذي تم اختياره²³ (هذا هو إلى حد كبير عينة يتوقف، مع ذلك، ليس من النادر أن ترى ما يزيد على 50 تواقيع الببتيد منفصلة من الأنسجة FFPE) (الشكل 3)¹⁸.

الشكل 1 : نموذج معدّة بشكل صحيح لانسجة المخ البشري FFF. هذه العينة الأنسجة المجهزة قد تم تصويرها في 50 ميكرومتر، ويظهر هيكل ماكرو جيدة وفرق واضح بين مسألة الأبيض (WM) والمادة الرمادية (جنرال موتورز). سوف تظهر بنجاح إعداد عينات تمايز واضح في مواقع مختلفة من الأنسجة. هنا، هناك منطقة واضح التنظيم أعلى من الببتيد (ممثلة بواسطة نسبة الكتلة إلى تهمة، M/Z) 1085 في منطقة وات من الفريق "ألف التفريق" يتجلى كذلك غياب هذا الشكل المحدد في لوحة ب متبوعاً بعودتها في الفريق جيم بالمعايرة توزيع ثلاث جزيئات مختلفة في نفس القسم الأنسجة، وتبين أن بعضها شكل موحد توزيعها، بينما بعضها الآخر يقتصر على المواقع المادية المنفصلة، يمكننا أن نرى أن إعداد عينة تم أداؤه بشكل صحيح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : قسم معدّة بشكل غير صحيح من أنسجة المخ البشري FFF. هذه العينة قد تم تصويرها في 50 ميكرومتر إنما تدل على مستوى واسع النطاق للتوطن. أنماط الجزيئات الحالية عبر لوحات 1 و 2 و 3 تبين بوضوح أن هناك خلافا الرقم 1، لا يوجد تعريف واضح بين المناطق البيولوجية أو الاختلافات في وفرة الجزيئات عرض. نظراً للصور هي نفسها، بغض النظر عن جزيئات محددة للعرض، يمكننا أن نستنتج أن قد كان الطابع نظراً لإعدادها بشكل غير صحيح. حيث أن هذه أنسجة المخ، هذه النتيجة لا معنى منطقي، والبيولوجية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : الطيف الشامل العالمي للصورة التي يتم عرضها في الشكل 1. الطيف يحتوي على وفرة توقيعات الببتيد عبر الطرف الأدنى من النطاق الشامل، مع عدة قمم عالية الببتيد الجماعية الحالية كذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية رقم 1 : التخطيطي لقطع الورق نشاف المستخدمة في غرفة البخار. يتم قطع ورق نشاف سميك في شكل دائري يبلغ قطرها مم 94. علامة تبويب مستطيلة قطع أيضا بما يتناسب مع حجم شريحة الميكروسكوب الزجاجية القياسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية رقم 2 : الجمعية التخطيطي دائرة البخار. هذا التخطيطي يبين كيف ينبغي تجميع الدائرة بخار مع ملاحظة محددة من كيف الشرائح عينة وورق نشاف وشريط لاصق تتطابق مع بعضها البعض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية رقم 3 : التخطيطي التسامي قاعة الجمعية: يعرض الشكل التالي كيف يتم ترتيب الشريحة عينة، سوبليماتور، وجهاز تدفئة للسماح بالتسامي استنساخه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

تم تصميم هذا البروتوكول إلى أقصى حد توليد الأنواع الجزيئية التأين في حين القضاء على تمركز لتحليلها. العوامل الرئيسية التي تنطوي على استخدام نفس المبدأ الأسمى عند تطبيق مصفوفة، هضم العينة، أو ريكريستاليزينج بعد التسامي²⁴؛ إلا وهي أن حتى ترسب بخار، مصفوفة أو خلاف ذلك، تحتاج إلى إنشاء وصون. بيبيتينج يغسل المذيب للبلورة والهضم، بالتساوي تحت العينة، يمنع أي منطقة فردية تلقي بخار المذيب أكثر من أي مكان آخر. هذا أمر مهم لمنع تشكيل التكثيف مرئية وعموما يحول دون تمركز الجزيئات السطحية، فضلا عن ضمان أن العينة بالتساوي هضمها ويتطلب. لا بد من تحقيق ترسب حتى من المصفوفة، كما سوف تظهر القليل جداً من كثافة منخفضة نسبيا وتنوع الأنواع، وسوف قمع الكثير الأيونات من العينة، كما خفض كثافة وتنوع الأنواع²⁵. لتحقيق ترسب حتى من المصفوفة، ضمان وضع طبقة رقيقة، وحتى من بلورات مصفوفة متجانسة الحجم، مباشرة أسفل بصمة الشريحة المجهر مع وقف التنفيذ. إذا كانت الطبقة رقيقة جداً أو غير متكافئ، ثم تسأم المصفوفة وسوف تمضي ببطء شديد أو سيكون متفاوتاً²⁶. الإمكانات القضايا مع التطبيق اليدوي للمذيبات وإنزيم يأتي إلى تجربة المستخدم الفردية. هناك حاجة إلى مستوى بعض "الممارسات" بغية ضمان نتيجة لتكرار، وقد يكون هناك بعض إعداد غير صحيحة عرضي الأولية. ومع ذلك، إذا هو الحرص على التأكد من أن الصورة النهائية وفقا لخصائص العينة "جيدة" وقد قدمنا، ثم أي عينات المعدة غير سليمة لا تؤدي إلى استنتاجات خاطئة البيولوجية.

من الضروري لفعالية هضم عينة أنسجة الاحتفاظ في فورمالدهايد (FFPE أو FFF)، إزالة أكبر عدد ممكن من كروسلينكس الميثيلين قدر الإمكان قبل التربسين ترسب¹⁶. ويتحقق ذلك بسهولة بتدفئة العينة في طنجرة الضغط على > 100 درجة مئوية، لمدة قصيرة، دون التسبب في الواقع الفقاعات يمكن ميكانيكيا ننأى العينة. الأنسجة يمكن بسهولة فقدان عندما يعامل بهذه طريقة، ذلك من أجل مكافحة هذا، تستخدم شرائح NC. في حين لا حرج، ضمان السلامة الجسدية للعينة عند التعرض للحرارة والضغط، والمذيبات العضوية. هضم العينة ثم يتحقق من خلال تطبيق الإنزيم في دولة التي تمنع التنشيط ومن ثم السماح جففه، أي تعليق في مياه نقية جداً. قاعة بخار ثم يتبع نفس المبدأ البلورة، توفير ما يكفي من بيئة رطبة للسماح بحركة المترجمة للانزيم لقاء وتنشق البروتين العمود الفقري، ولكن لا يكفي "البلل" السماح الببتيدات الناتجة الانجراف إلى حد كبير من على الموقع الأول²⁶. بيبيتينج مباشرة على الشريحة سوف لا ديلوكاليزي أي التحاليل السطحية، بسبب آثار متبقية crosslinking وإينسولوبيليتي العام للبروتينات الكبيرة في المياه.

على الرغم من أننا ركزنا على تطبيق هذه المنهجية على الببتيدات، يمكن تطبيقها بسهولة على مهام سير العمل لتحليل نواتج الأيض والدهون والبروتينات سليمة. سوف تحتاج إلى بعض الخطوات إزالتها أو زيادتها؛ تصوير البروتين سليمة لا تتطلب أي خطوات الانقسام وبروتيوليتيك، ولكن سير العمل الأساسي لتقطيع العينة وتصاعد متبوعاً بمصفوفة التسامي والبلورة، وتحليل يمكن تطبيقها على ما يقرب من أي نوع العينة. لدينا نية لتطوير هذا البروتوكول وضمان موثوقية ومتانة من خلال تحقيقات تجريبية واسعة النطاق، وكان لإنشاء أسلوب يتطلب التعديل القليل أو لا، أن يستخدم معدات غير مكلفة، وهي قابلة لمجموعة واسعة المجتمع بدرجات متفاوتة من الأدوات والمهارات الحيوية. ونأمل أن يؤدي هذا إلى فتح سبل جديدة للتحقيق للمختبرات التي سوف خلاف ذلك رفض هذا الأسلوب معقدة أو مكلفة جداً. كما أننا على ثقة أن قدمنا طريقة إعداد نموذج نهائي أول الببتيد إس. في وقت كتابة هذا التقرير، تم إلى حد كبير على أساس الأجهزة معظم المنهجيات، مع تركيز بشكل خاص على سهولة استخدام الرش الآلي على أساس منهجيات^27،،من²⁸²⁹. كما كان هناك القليل من منهجيات التحلل الميثيلين موثوق بها مع التخمين فيما يتعلق بالإجراء الصحيح والأجهزة لاستخدامها.

وفي الختام، نحن نعتبر أن تطبيق المنهجية المذكورة أعلاه على الأنسجة FFPE والاتحاد الفرنسي، سيؤدي إلى قدر أكبر من الثقة في فعالية استراتيجية موريشيوس لتحليل الببتيدات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryo Microtome	Leica	CM3050	For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides	Bruker	8237001	For preparation and section of tissue.
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker	Kambrook	KPR620BSS	For preparation and section of tissue.
Sublimator	Chem Glass	NA	For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made
Sand bath	NA	NA	For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS70165100	For sublimation procedure.
Vacuum Pump	NA	NA	For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer
Cold trap	Chem Glass	CG-4510-02	For sublimation procedure.
Hot Plate	John Morris	EW-15956-32.	For sublimation procedure.
Plastic petri dish	Sigma Aldrich	Z717223	For sublimation procedure.
37 °C incubator	NA	NA	For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old
Blotting paper	Sigma Aldrich	P7796	For sublimation procedure.
Nitrocellulose	Sigma Aldrich	N8395	For washing of slides.
Acetone	Sigma Aldrich	650501	For washing of slides.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	For washing of slides.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	For washing of slides.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol
Chloroform	Sigma Aldrich	C2432	For washing of slides.
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	ARK2183	For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate	Sigma Aldrich	A6141	For proteolytic cleavage.
Trypsin	Sigma Aldrich	T0303	For proteolytic cleavage.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	For recrystallisation.
Acetonitrile	Sigma Aldrich	1.00029	For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	For recrystallisation.