Summary
Ce protocole décrit une méthode fiable et reproductible pour la préparation axée sur la sublimation du formol fixé tissu destiné à la spectrométrie de masse d’imagerie.
Abstract
L’utilisation de désorption-ionisation laser assistée par matrice, spectrométrie de masse (MALDI MSI) d’imagerie a rapidement élargi, car cette technique analyse une foule de biomolécules de médicaments et de lipides à N-glycans. Bien qu’il existent de différentes techniques de préparation d’échantillon, détection des peptides de formaldéhyde préservé des tissus reste l’un des défis plus difficiles pour ce type d’analyse par spectrométrie de masse. Pour cette raison, nous avons créé et optimisé une méthodologie robuste qui conserve les informations spatiales contenues dans l’échantillon, tout en suscitant le plus grand nombre de peptides ionisables. Nous avons visait également à atteindre cet objectif de manière simple et rentable, éliminant ainsi l’erreur potentielle de partialité ou de la préparation, qui peut se produire lorsque l’utilisation automatisée instrumentation. Le résultat final est un protocole reproductible et peu coûteux.
Introduction
Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI) d’imagerie a été employée comme technique d’image basé pendant deux décennies1,2, analyser une gamme de biomolécules, y compris : lipides3, peptides2 ,4, protéines2,5, métabolites6,7, N-glycans8et des molécules synthétiques tels que les médicaments thérapeutiques9,10. Le nombre de publications démontrant l’utilité de cette technique ont fortement augmenté au cours de la dernière décennie6,11,12,13. Certaines molécules, comme les lipides, sont relativement faciles à analyser par MALDI MSI, comme ils ionisent facilement en raison de leur nature chimique et nécessitent peu de préparation à l’avance3. Toutefois, pour des cibles plus difficiles comme les peptides, les étapes requises pour ioniser efficacement ces molécules sont vastes et généralement compliqué14. Il y a actuellement très peu de publications qui visent à répondre ou à démontrent la reproductibilité dans les méthodologies utilisées pour préparer les tissus à cette technique visuelle unique15. Pour cette raison, nous avons compilé les observations et mises en oeuvre des optimisations en un seul, facile à implémenter, méthodologie ne nécessite peu ou aucun modifications, pour l’analyse des peptides d’un formaldéhyde que réticulé tissu source14.
Dans ce manuscrit, nous avons décrit une méthodologie reproductible validée, à faible coût pour la détection et la cartographie spatiale des peptides, produit des surgelés fixés au formol (FFF) et fixés au formol des sections de tissu (FFIP) inclus en paraffine. Cette méthodologie ne nécessitent ni s’appuyer sur une instrumentation spécialisée3. Plus précisément, nous abordons les nombreux aspects de la préparation de l’échantillon spécialisées nécessaire pour analyser les peptides ; étapes comme antigène récupération16 et revêtement de matrice. Notre protocole utilise aussi peu coûteux matériel et réactifs, ce qui rend cette méthode accessible à toute une communauté qui autrement seraient incapable de payer l' autre appareils robotisés17.
Le raisonnement qui sous-tend l’élaboration d’une méthode de préparation d’échantillon manuel comportait deux volets : Premièrement, l’utilisation d’un sublimator crée un revêtement uniforme et homogène des cristaux de matrice qui sont environ 1 µm de longueur18, quelque chose d’irréalisables avec arrosage plus fréquent techniques. Deuxièmement, l’ensemble relativement faible des coûts : le coût total de l’appareil de mesure était < 1500 $ AUD. Nous notons, en termes de rapport coût-efficacité, que le prix par exemple est beaucoup moins cher quand il n’y a aucun mécanisme robotique impliqué. L’utilisation de sublimation a été signalée précédemment, cependant, au meilleur de nos connaissances, des méthodes pas à pas qui décrivent ce processus et préparation des échantillons n’ont pas été signalés ni décrits dans la littérature.
Ce protocole vise à aider les chercheurs qui ont accès à un spectromètre de masse MALDI et qui ont l’intention sur le développement de l’information spatiale en relation avec une bio-molécule d’intérêt19. En substance, MALDI MSI est une forme de histologique préalable qui ne s’appuie pas sur les anticorps ou taches2.
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Protocol
ATTENTION : Toutes les précautions de sécurité en vigueur devraient suivre lors de l’exécution de cette procédure, y compris l’utilisation d’équipement de protection individuelle approprié (PPE) (p. ex., les sarraus de laboratoire, gants en nitrile, lunettes de sécurité, etc.)
1. préparation des réactifs et du matériel
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Préparation des solutions
- Pour préparer 500 mL de liquide de Carnoy, mélanger 100 % éthanol (EtOH), le chloroforme et acide acétique glacial dans un 6 : rapport de 3:1 v/v/v dans une bouteille propre Schott.
- Pour rendre liquide nitrocellulose (NC), dissoudre membrane NC (couramment utilisé en western blot) dans de l’acétone pur, par agitation douce, à une concentration finale de 40 mg/mL.
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Préparation de diapositives NC enduit
- Utilisation d’une technique similaire à celle utilisée pour la préparation du sang frottis pour examen histologique20 préparer NC enduit diapositives.
- Distribuer 40 µL de liquide NC sur une arête d’une lame de microscope d’oxyde d’étain (ITO) conducteur d’indium. À l’aide d’une lame de microscope de verre ordinaire, faites glisser la NC sous tension superficielle sur la diapositive pour créer un revêtement mince même.
- Permettre la NC sécher à température ambiante pendant 20 s et puis magasin jusqu'à ce que nécessaire à la température ambiante. Conservation des échantillons en vertu de ces conditions peut être indéfinie, pourvu que les tissus sont maintenues et exempt de poussière.
Remarque : Cette méthode de préparation est mieux connu sous le nom de « couches minces » et va produire un revêtement uniform qui dépend de la viscosité de la NC ainsi que son manque de tension superficielle s’autoniveler sur la diapositive. Les soins seul qu’il faut alors préparer les diapositives pas bouge trop vite, ce qui créeront des stries de NC plutôt que d’une couverture complète.
ATTENTION : Comme liquide NC sèche très vite, il est essentiel de travailler rapidement pour éviter la solution de séchage avant il a été correctement étalé. Aussi être prudent lorsque manipulation NC à l’état liquide, telle qu’elle est un composé hautement énergétique et ne doit pas toucher une source d’inflammation pour prévenir l’explosion incendiaire. NC subit aussi une transition endothermique lorsque séchage et peut causer des brûlures de froids si autorisés à entrer en contact prolongé avec la peau ou les mains gantées. Afin de minimiser tous risques, que de faibles quantités doivent être préparées à chaque fois (< 1 mL est recommandé). Une fois sec, il est stable à température ambiante. Cependant, NC peut rester explosif lorsqu’il est présent en grande quantité.
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Création des chambres de vapeur personnalisé
- Couper un morceau de papier buvard épais avec une paire de ciseaux assez grand pour s’adapter à la partie inférieure la moitié d’un plat de Pétri plastique standard (94 mm de diamètre et 3 mm d’épaisseur).
- Couper le papier, en laissant une bande rectangulaire dans le centre, la même taille qu’une lame de microscope, laissant assez de surplus pour que le document conserve sa position dans la boîte de Pétri (supplémentaire Figure 1).
2. préparation des coupes de tissus
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FFIP tissu21.
- Sélectionnez le bloc de tissu désiré et la section à 12 µm d’épaisseur dans un banc standard monté microtome et flotteur monture sur la NC pré-enrobé ITO diapositives.
- Plonger les lames dans le xylène douce pour enlever la paraffine résiduelle pendant 2 min et répéter l’opération une seconde fois.
Remarque : Si le bloc de paraffine est particulièrement envahissant ou le tissu est relativement faible par rapport au bloc de paraffine, les échantillons peuvent être chauffés à 60 ° C pour faire fondre la majorité loin avant le lavage dans le xylène. - Laver les échantillons déparaffinées en immergeant les lames dans une série graduée de solvant : 70 % v/v EtOH/eau, 100 % EtOH, de Carnoy fluide, 100 % EtOH, eau ultra pure et 100 % EtOH. La durée de chaque immersion devrait être de 30 s, à l’exception de fluide de Carnoy, qui doit durer 2 min.
ATTENTION : De Carnoy fluide et xylène doivent être stockés et utilisés dans une hotte de laboratoire, car ils sont très toxiques par inhalation.
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Tissus fixés au formol congelés (FFF)
Remarque : Les échantillons déjà, doivent être gelés appropriée selon le type d’échantillon.- Equilibrer le bloc de tissu à la température de fonctionnement du microtome pour 20 min22.
Remarque : La température de l’équilibration est dépendante du type de tissu. - Section le tissu à l’aide d’un microtome à 12 µm et dégel montage les sections sur un NC pré-préparés enduit ITO glisser.
- Stocker les diapositives dans un dessiccateur à vide sur le banc dans l’obscurité.
Remarque : Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines dans ces conditions. - Laver les échantillons en une série de solvant classée comme indiqué pour tissu FFPE (2.1.3).
Remarque : Il n’est pas nécessaire pour une étape de deparaffinisation de xylène que l’échantillon n’est pas incorporée.
- Equilibrer le bloc de tissu à la température de fonctionnement du microtome pour 20 min22.
3. méthylène Crosslink hydrolyse
- Charger les lames de l’échantillon (FFF ou FFIP) dans une boîte en plastique de glissière qui est remplie de 20 mmol tris-HCl (pH 8,8) vers le haut. Scellez la boîte et le placer dans un bain d’eau contenant 500 mL d’eau, ce qui permet de la boîte à toucher le fond. Puis chauffer pendant 15 min à 120 ° C dans une marmite à pression qui peuvent atteindre une pression de 70 kPa.
- Supprimer les diapositives, laissez-les refroidir et laissez-les sécher à température ambiante pendant 15 minutes.
4. tissu Digestion
- Une fois hydrolysée, enduire les échantillons avec 10 µL de solution de trypsine (1 mg/mL) dans l’eau ultra pure, par pipetage 10 µL de la solution sur le bord de la partie de tissu et ensuite, en utilisant la même pipette, faites glisser la gouttelette sur toute la surface du tissu sous la surface tension.
Remarque : Ne pas rayer la surface du tissu avec l’embout de la pipette et de répandre l’enzyme au-delà des frontières des bords des tissus. - Laisser les échantillons à sécher à température ambiante.
- Une fois sec, montez les échantillons à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits (tissus vers le bas) avec ruban autoclave sur chaque bord de la lame (complémentaire Figure 2).
- Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 v/v de 100 % d’acétonitrile et de 50 mM d’ammonium bicarbonate soigneusement sur le doigt de papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri, jusqu'à ce que le doigt semble être uniformément humide.
- Placez la moitié supérieure de la chambre de vapeur sur le fond la moitié, s’assurant de la diapositive de doigt et échantillon de papier aligner parfaitement et sceller la chambre autour de son Équateur avec film de paraffine.
- Laisser l’échantillon du jour au lendemain dans un incubateur à 37 ° C pour permettre une digestion complète.
5. matrice revêtement par Sublimation
- Une fois digéré, peser la lame échantillon sur un équilibre microanalytiques à 5 chiffres.
- Monter le glisser sur le doigt de refroidissement de l’appareil de sublimation et fixez-le avec du ruban de cuivre, de la même manière comme pour la chambre de vapeur (supplémentaire Figure 3).
Remarque : Pour vous assurer que la lame est contactée uniformément par le doigt de refroidissement, une couche de ruban de cuivre est placée sur le fond du doigt refroidissement pour niveler la surface. Cela garantit que la diapositive est uniformément froid qui mène au même dépôt de matrice. - Placer 300 mg de matrice de α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) dans un plat de Pétri de verre au fond de la chambre et la propagation uniformément pour créer une fine couche de cristaux de matrice.
- Assembler le sublimator et fixer les deux moitiés avec le collier de fer à cheval. Suspendre l’appareil assemblé 15-20 cm au-dessus d’un bain de sable, préalablement chauffé à 220 ° C, en le plaçant dans un anneau métallique relié à un statif.
- Connecter la chambre à la source de vide, engager le vide et laissez-le se stabiliser vers le bas pour ~ 25 mTorr pendant 5 min.
- Emballez le doigt de refroidissement vers le haut avec de la glace et ajouter 50 mL d’eau. Laissez l’appareil se contenter d’un autre 5 minutes avant de procéder.
- Abaissez la chambre sur la surface du sable, assurant le sable entre complètement en contact avec le fond de la chambre et laissez-le pendant 45 min créer un revêtement idéal de 0,22 mg/cm2
ATTENTION : Il faut quand manutention verrerie à vide poussé, comme des dommages à l’appareil, alors que les évacués, peut entraîner une défaillance catastrophique de la chambre de verre. - Après 45 min, enlevez la chambre depuis le bain de sable en soulevant la bague métallique et aérer la chambre.
Remarque : Une fois que la chambre a été vidée, la lame doit être enlevée très rapidement que l’eau dans l’air commence à se condenser sur la diapositive de doigt et échantillon de gel. - Retirer la glissière et pesez-le afin d’assurer le revêtement désiré a été atteint.
Remarque : Si le revêtement insuffisant ont été réalisé, répétez simplement le processus de sublimation pour la diapositive jusqu'à ce que l’épaisseur du revêtement désiré a été atteint.
6. recristallisation
- Une fois sublimée, monter la lame de l’échantillon à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits, comme antérieure décrite (tissus vers le bas).
- Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 (v/v) de 100 % d’acétonitrile et de 0,1 % v/v d’acide trifluoroacétique dans l’eau avec précaution sur le papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri pour assurer une couche uniforme.
- Assembler la chambre, assurant la glissière de microscope et onglet papier aligner parfaitement et laisser dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
ATTENTION : Ne pas assurer l’étanchéité la chambre.
Remarque : Une fois recristallisée, la teinte jaune normalement de la matrice devrait changer en blanc, regarder moins brillante et apparaissent très même. Ceci indique que recristallisation a été effectuée correctement. - L’échantillon est maintenant prêt pour l’analyse.
7. instrumentation
- Scan de la lame dans un scanner à plat pour créer une image numérique.
- Charger l’échantillon dans le spectromètre de masse et à analyser à l’aide de la plate-forme de logiciels appropriés.
- Analyse des échantillons en mode réflectron ion positif avec une gamme de masses de 750-3 500 Da, avec une résolution spot qui s’applique au résultat souhaité. Dans la plupart des cas, 20 à 50 µm raster largeur est suffisante, mais aussi peu que 10 µm peut être utilisé15.
ATTENTION : Les lasers UV MALDI sont une source de rayonnement ionisant et ne doivent pas être lus directement. Veiller à ce que le laser est contenu au sein de l’instrument blindage avant l’opération.
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Representative Results
Si suivies correctement, ce protocole produit des images qui représentent clairement la morphologie générale du tissu sans les égratignures ou autres déformations (Figure 1). La validation idéale pour une préparation de l’échantillon correctement exécutée, est la capacité de distinguer entre les différentes structures physiques en changeant la molécule étant lus (Figure 2).
Un bon guide pour déterminer si les échantillons ont été préparés de manière incorrecte est de vérifier la présence de délocalisation ou d’agrégation de la matrice ; signatures de peptide qui s’étendent au-delà des frontières du tissu physique sont des indicateurs parfaits molécules déjà déplacés au cours de la préparation de l’échantillon. Ceci est expliqué en détail dans o ' Rourke et Padula (2017)15.
Le spectre de peptide produit doit contenir une abondance élevée de molécules distinctes qui sont bien réparties dans l’ensemble de la gamme choisie de masse1,23 (c’est en grande partie échantillons dépendants, cependant, il n’est pas rare de voir plus de 50 signatures de peptide discrètes de tissu FFPE) (Figure 3)18.
Figure 1 : Un échantillon correctement préparé des tissus cérébraux humains FFF. Ce spécimen de tissu transformés a été photographié à 50 µm et montre bon macrostructure et une nette différence entre la substance blanche (WM) et de matière grise (GM). Échantillons préparés avec succès montrera une différenciation claire des emplacements différents tissus. Ici, il y a une zone claire de régulation du peptide (représenté par le rapport masse-à-charge, M/Z) 1085 dans la région WM de panneau A. différenciation est encore attestée par l’absence de cette forme définie dans le panneau B suivie de son retour dans le groupe C. En dosant la distribution de trois molécules différentes sur la même section de tissu et en montrant que certaines sont uniformément distribuées, tandis que d’autres se limitent à des lieux physiques distincts, nous pouvons voir que la préparation de l’échantillon a été effectuée correctement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Un article mal préparé des tissus cérébraux humains FFF. Ce spécimen a été photographié à 50 µm, mais indique un niveau à grande échelle de délocalisation. Les patrons des molécules présentes dans l’ensemble de panneaux de 1, 2 et 3 montrent clairement que, contrairement à la Figure 1, il n’y a pas de définition claire entre régions biologiques ou les différences dans l’abondance des molécules affichée. Puisque les images sont les mêmes, quel que soit les molécules sélectionnés pour l’affichage, nous pouvons conclure qu’il a été délocalisé en raison d’être mal préparés. Puisqu’il s’agit de tissu cérébral, ce résultat n’a aucun sens logique, biologique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le spectre de masse global de l’image affichée dans La figure 1. Le spectre contient une abondance de signatures de peptide à travers l’extrémité inférieure de la gamme de masse, avec des pics de haute masse peptidique plusieurs présents aussi bien. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : Schéma de découpe du papier buvard utilisé dans la chambre de vapeur. Papier buvard épais est découpée en forme circulaire avec un diamètre de 94 mm. Un onglet rectangulaire est également découpé pour correspondre à la taille d’une lame de microscope de verre standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaires Figure 2 : Schéma de montage de la chambre de vapeur. Ce schéma montre comment la chambre de vapeur doit être Assemblée avec une note spécifique de comment les diapositives échantillon, papier buvard et adhésif tous correspondent entre eux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 3 : Schéma de montage de chambre de sublimation : Cette figure illustre la façon dont la lame échantillon, sublimator et appareils de chauffage sont organisés pour permettre la sublimation reproductible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole a été conçu pour maximiser la génération des espèces moléculaires ionisables tout en éliminant les délocalisation d’analytes. Les principaux facteurs impliquent en utilisant le même principe primordial lors de l’application de matrice, digérer l’échantillon ou recristalliser après sublimation24; savoir, qu’un même dépôt de vapeur, de matrice ou autrement, doit être créée et maintenue. Pipetage solvants nettoyants pour recristallisation et digestion, uniformément sous l’échantillon, empêche toute zone individuel recevant la vapeur plus solvable que nulle part ailleurs. Ceci est important pour prévenir la formation de condensation visible et dans l’ensemble inhibe la délocalisation des molécules des surface mais aussi veiller à ce que l’échantillon est uniformément digérée et recristallisé. Il est impératif de réaliser un dépôt même de la matrice, comme trop peu montrera une intensité relativement faible et la diversité des espèces et trop supprimera les ions de l’échantillon, diminuerait aussi l’intensité et la diversité des espèces,25. Pour parvenir à un même dépôt de matrice, veiller à ce que même une couche mince de cristaux de matrice de taille homogène, sont placés directement sous l’empreinte de la lame de microscope suspendu. Si le calque est inégale ou trop mince, puis la sublimation de la matrice procédera trop lentement ou sera inégale26. Le potentiel des sujets avec application manuelle du solvant et enzyme se résume à l’expérience individuelle de l’utilisateur. Certain niveau de « pratique » est nécessaire afin d’assurer un résultat reproductible, et il peut y avoir quelques préparation incorrecte accidentelle initiale. Cependant, si il est veiller à ce que l’image finale est selon les propriétés de l’échantillon « bonne », nous avons fourni, puis des échantillons mal préparés ne conduira pas à fausses conclusions biologiques.
Pour efficacement digérer un échantillon de tissu préservé en formaldéhyde (FFIP ou FFF), il est indispensable d’éliminer autant des croisements de méthylène que possible avant la trypsine dépôt16. Ce résultat est facilement obtenu en chauffant l’échantillon dans un autocuiseur à > 100 ° C, pendant une courte durée, sans réellement provoquer bulles qui peuvent dissocier mécaniquement de l’échantillon. Tissu peut facilement être perdu lorsque les traités de telle manière, ainsi afin de lutter contre cela, NC diapositives sont employés. Bien que pas critique, il garantit l’intégrité physique de l’échantillon lorsqu’elles sont soumises à la chaleur, de pression et de solvant organique. Digestion de l’échantillon est alors obtenue en appliquant l’enzyme dans un État qui empêche son activation et permettant ensuite sécher, c'est-à-dire en suspension dans l’eau ultra pure. La chambre de vapeur suit alors le même principe que la recristallisation, fournissant assez de milieu humide pour permettre un mouvement localisé de l’enzyme à rencontrer et de s’attacher l’épine dorsale de protéine, mais pas assez « moiteur » afin de permettre les peptides résultants à la dérive considérable de leur emplacement initial26. Pipetage directement sur la diapositive ne sera pas délocaliser toute surface analytes, en raison des effets de la réticulation résiduelle et l’insolubilité générale des grosses protéines dans l’eau.
Bien que nous avons mis l’accent sur l’application de cette méthodologie aux peptides, il peut être appliqué aussi bien aux flux de travail pour l’analyse des métabolites, des lipides et des protéines intactes. Des mesures devront être supprimées ou augmentées ; imagerie des protéines intactes ne nécessite pas des mesures de clivage protéolytique, mais le flux de travail fondamentaux de sectionnement d’échantillon et montage suivie d’analyse, recristallisation et la sublimation de la matrice peut être appliquée à presque n’importe quel type d’échantillon. Notre intention pour le développement de ce protocole et d’assurer sa fiabilité et robustesse grâce à vastes enquêtes empiriques, était de créer une méthode qui nécessite peu ou pas de modifications, qui utilise un matériel peu coûteux et se prête à une large Communauté avec des degrés d’instrumentation et d’habileté biochimique. Nous espérons que cela ouvre de nouvelles voies d’investigation aux laboratoires qui aurait par ailleurs rejeté cette technique comme trop compliqué ou coûteux. Nous sommes également convaincus que nous avons fourni la première méthode de préparation d’échantillon définitif pour le peptide MSI. Au moment de l’écriture, la plupart des méthodologies ont été en grande partie basé sur l’instrumentation, avec un accent particulier sur la facilité d’utilisation de la robotique de pulvérisation base de méthodologies27,28,29. Il y a aussi peu de méthodologies hydrolyse méthylène fiable avec conjecture quant à la procédure correcte et l’appareil utilisé.
En conclusion, nous considérons que l’application de la méthode décrite ci-dessus aux tissus FFPE et FFF, se traduira par une plus grande confiance dans l’efficacité de MSI pour l’analyse des peptides.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts ou des intérêts commerciaux de divulguer
Acknowledgments
Les auteurs tenons à remercier la Fondation école médicale de Sydney et le Blues et la Fondation pour financer la partie de ce travail par le biais de leur programme de bourses de doctorat pour la recherche de la maladie d’Alzheimer et une subvention à la découverte de l’ARC (DP160102063) attribué à PKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
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