Summary
Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.
Abstract
L'uso di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice, spettrometria di massa (MALDI MSI) di imaging ha rapidamente ampliato, poiché questa tecnica analizza una serie di biomolecole da farmaci e lipidi per N-glicani. Anche se esistono varie tecniche di preparazione del campione, rilevare peptidi da formaldeide conservato tessuti rimane una delle sfide più difficili per questo tipo di analisi spettrometria totale. Per questo motivo, abbiamo creato e ottimizzato una solida metodologia che conserva le informazioni spaziali contenute all'interno del campione, mentre suscitando il maggior numero di peptidi ionizzabili. Abbiamo anche l'obiettivo di raggiungere questo obiettivo in modo semplice e conveniente, eliminando potenziali bias o preparazione errore, che può verificarsi quando si usa automatizzata strumentazione. Il risultato finale è un protocollo riproducibile e poco costoso.
Introduction
Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI MSI) di imaging è stata impiegata come tecnica di immagine basata per due decenni1,2, analizzando una gamma di biomolecole compreso: lipidi3, peptidi2 ,4, proteine2,5, metaboliti6,7, N-glicani8e molecole sintetiche quali farmaci terapeutici9,10. Il numero di pubblicazioni che dimostrano l'utilità di questa tecnica è cresciuti significativamente sopra l'ultimo decennio6,11,12,13. Alcune molecole, quali i lipidi, sono relativamente facili da analizzare tramite MALDI MSI, in quanto ionizzare prontamente a causa della loro natura chimica e pertanto richiedono poca preparazione preliminare3. Tuttavia, per le destinazioni più difficili come i peptidi, i passaggi necessari a ionizzare efficacemente queste molecole sono ampie e generalmente complicati14. Ci sono attualmente molto poche pubblicazioni che mirano a indirizzo o dimostrano la riproducibilità delle metodologie impiegate per preparare il tessuto per questa tecnica visiva unica15. Per questo motivo, abbiamo compilato le osservazioni e implementate ottimizzazioni in un unico, facile da implementare, metodologia che non dovrebbe richiedono poca o nessuna modificazione, per l'analisi dei peptidi da un formaldeide reticolato tessuto fonte14.
In questo manoscritto, abbiamo descritto una metodologia riproducibile validata, a basso costo per la rilevazione e la mappatura territoriale dei peptidi, generati da formalina congelati (FFF) e fissati in formalina di sezioni di tessuto paraffina (FFPE). Questa metodologia non richiede o si basano su qualsiasi strumentazione specializzata3. In particolare, ci rivolgiamo i molteplici aspetti della preparazione del campione specializzato necessario analizzare peptidi; a pochi passi come antigene recupero16 e rivestimento di matrice. Il nostro protocollo utilizza anche poco costoso attrezzature e reagenti, rendendoli accessibili a una comunità più ampia che altrimenti sarebbero in grado di permettersi l' apparato robotico alternativo17questa metodologia.
Il ragionamento dietro lo sviluppo di un metodo di preparazione manuale del campione era duplice: in primo luogo, l'uso di un sublimator crea un rivestimento omogeneo e coerenza di cristalli di matrice che sono ~ 1 µm in lunghezza18, qualcosa irraggiungibile con la spruzzatura più comuni tecniche. In secondo luogo, il relativamente piccolo set up costi: il costo totale dell'apparato personalizzato era <$ 1500 dollari australiani. Notiamo che, in termini di costo-efficacia, prezzo per esempio è molto più economico quando non c'è nessun macchinario robotico coinvolti. L'uso di sublimazione è stata segnalata precedentemente, tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, metodologie dettagliate che descrivono questo processo e preparazione dei campioni non sono stati segnalati né descritti nella letteratura.
Questo protocollo è destinato per aiutare i ricercatori che hanno accesso a uno spettrometro di massa MALDI e che sono intenti a generare informazioni spaziali in relazione a una bio-molecola di interesse19. In sostanza, MALDI MSI è una forma di istologico di screening che non si basa sugli anticorpi o macchie2.
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Protocol
Attenzione: Tutte le precauzioni di sicurezza applicabili dovrebbero essere seguite quando si esegue questa procedura, compreso l'uso di appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) (ad es., camici da laboratorio, guanti in nitrile, occhiali di sicurezza, ecc.)
1. preparazione di reagenti e attrezzature
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Preparazione delle soluzioni
- Per preparare 500 mL di liquido di Carnoy, mescolare 100% etanolo (EtOH), cloroformio ed acido acetico glaciale in un 6: rapporto di 3:1 v/v/v in una bottiglia di vetro pulita Schott.
- Per rendere liquida nitrocellulosa (NC), sciogliere membrana NC (comunemente usata nel macchiarsi occidentale) in ordinata di acetone, di movimentazione delicata, a una concentrazione finale di 40 mg/mL.
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Preparazione dei vetrini NC rivestito
- Vetrini rivestiti con uso di una tecnica simile a quella utilizzata per la preparazione di sangue sbavature per esame istologico20 preparare NC.
- Dispensare 40 µ l di liquido NC su uno spigolo di un vetrino da microscopio conduttivo Indio ossido di stagno (ITO). Utilizzando un vetrino per microscopio regolari, trascinare la NC sotto tensione superficiale attraverso la diapositiva per creare un rivestimento di film anche sottile.
- Consentire la NC ad asciugare a temperatura ambiente per 20 s e poi archivio fino a quando necessario a temperatura ambiente. Conservazione dei campioni in queste condizioni può essere indefinita condizione i tessuti sono mantenuti e privi di polvere.
Nota: Questo metodo di preparazione è meglio conosciuto come "film sottile" e produrrà un rivestimento uniforme che si basa sulla viscosità della Carolina del nord così come la sua mancanza di tensione superficiale per autolivelli sulla diapositiva. L'unica accortezza che dovrebbe essere presa quando preparare le diapositive non si muove troppo rapidamente, che creerà striature di NC, piuttosto che una copertura completa.
Attenzione: Come NC liquido si asciuga molto rapidamente, è fondamentale lavorare rapidamente per evitare l'essiccazione la soluzione prima che è stata correttamente diffusa. Dovrebbe anche prestare attenzione quando si maneggiano NC allo stato liquido, come esso è un composto altamente energetico e non venga a contatto una sorgente di accensione per evitare l'esplosione incendiarie. NC subisce anche transizioni endotermiche quando essiccazione e può causare bruciature da freddo se permesso di entrare in contatto prolungato con la pelle o le mani guantate. Per ridurre al minimo i rischi ad esso associati, solo piccole quantità devono essere preparate in ogni momento (< 1 mL è consigliato). Una volta asciutto è stabile a temperatura ambiente. Tuttavia, NC può rimanere esplosivo quando sono presenti in grandi quantità.
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Creazione delle camere a vapore su ordinazione
- Tagliare un pezzo di carta assorbente spessa con un paio di forbici abbastanza grande da contenere il fondo la metà di un piatto di petri in plastica standard (94 mm di diametro e 3 mm di spessore).
- Tagliare la carta, lasciando una striscia rettangolare al centro, la stessa dimensione di un vetrino da microscopio, lasciando abbastanza in eccesso in modo che la carta manterrà la posizione in di Petri (complementare figura 1).
2. preparazione di sezioni di tessuto
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FFPE tessuto21.
- Selezionare la sezione a 12 µm spessore in un banco standard montato microtomo e galleggiante montare sulla NC prerivestiti ITO diapositive e blocco del tessuto desiderato.
- Immergere i vetrini in xilene fresco per rimuovere residua paraffina per 2 min e ripetere l'operazione una seconda volta.
Nota: Se il blocco di paraffina è particolarmente dominante o il tessuto è relativamente piccolo rispetto al blocco di paraffina, i campioni possono essere riscaldati a 60 ° C per sciogliere la maggior parte distanza prima del lavaggio in xilene. - Lavare i campioni Sparaffinatura immergendo i vetrini in una serie graduata di solvente: 70% v/v EtOH/acqua, 100% EtOH, liquido di Carnoy, 100% EtOH, acqua ultra pura e 100% EtOH. La durata di ogni immersione deve essere 30 s, fatta eccezione per il liquido di Carnoy, che deve durare per 2 min.
Attenzione: Xilene e del liquido di Carnoy deve essere memorizzati e utilizzati in una cappa aspirante, in quanto sono altamente tossici se inalato.
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Tessuto formalina-fisso congelati (FFF)
Nota: I campioni devono già essere congelati, in modo appropriato secondo il tipo di campione.- Equilibrare il blocco di tessuto alla temperatura di funzionamento del microtomo per 20 min22.
Nota: Temperatura di equilibrazione è dipenda dal tipo di tessuto. - Far scorrere la sezione il tessuto usando un microtomo a 12 µm e disgelo montare le sezioni su un pre-preparati NC rivestito ITO.
- Conservare i vetrini in un essiccatore sotto vuoto in panchina nel buio.
Nota: I campioni possono essere conservati per diverse settimane in queste condizioni. - Lavare i campioni in una serie di solvente Classificato come indicato per tessuto FFPE (2.1.3).
Nota: non c'è nessuna necessità di un passo di deparaffinisation di xilene come il campione non è incorporato.
- Equilibrare il blocco di tessuto alla temperatura di funzionamento del microtomo per 20 min22.
3. metilene Crosslink idrolisi
- Caricare la slide di esempio (FFF o FFPE) in una scatola di plastica slide che è riempita nella parte superiore di 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Chiudete la scatola e posizionarlo in un bagno di acqua, contenente 500 mL di acqua, permettendo la casella per toccare il fondo. Quindi riscaldare per 15 min a 120 ° C in una pentola a pressione che può raggiungere una pressione di esercizio di 70 kPa.
- Rimuovere le diapositive, lasciarli raffreddare e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 15 min.
4. tessuto digestione
- Una volta idrolizzato, rivestire con 10 µ l di soluzione di tripsina (1mg/mL) i campioni in acqua ultra-pura, di pipettaggio 10 µ l della soluzione sul bordo della sezione di tessuto, quindi, utilizzando la stessa punta della pipetta, trascinare la goccia su tutta la superficie del tessuto sotto la superficie tensione.
Nota: Evitare di graffiare la superficie del tessuto con la punta della pipetta e sopra diffusione l'enzima oltre i confini dei bordi del tessuto. - Consentire ai campioni di asciugare a temperatura ambiente.
- Una volta asciutto, è possibile montare i campioni all'interno della parte superiore della camera di vapore precedentemente costruita (tessuto rivolto verso il basso) con nastro autoclave su dei bordi della diapositiva (complementare figura 2).
- Pipettare 600 µ l di una soluzione contenente un mix 1:1 v/v 100% acetonitrile e 50mm di bicarbonato di ammonio attentamente sul dito carta assorbente nella parte inferiore del piatto petri fino a quando il dito sembra essere uniformemente umido.
- Posizionare la metà superiore della camera del vapore sul fondo metà, assicurando la diapositiva di dito e campione di carta allineare perfettamente e sigillare la camera intorno suo equatore con la pellicola di paraffina.
- Lasciar riposare il campione in un incubatore a 37 ° C per consentire la completa digestione.
5. matrice rivestimento tramite sublimazione
- Una volta digerito, pesare il vetrino su un equilibrio microanalitico di 5 cifre.
- Montare il vetrino sul dito raffreddamento dell'apparato di sublimazione e fissarlo con nastro di rame, nello stesso modo come descritto per la camera di vapore (complementare figura 3).
Nota: Per garantire che la diapositiva viene contattata uniformemente dal dito raffreddamento, uno strato di nastro di rame è posto sulla parte inferiore del dito raffreddamento per livellare la superficie. Questo assicura che la diapositiva viene raffreddata uniformemente che conduce anche deposizione della matrice. - Inserire 300 mg di matrice di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) in una capsula Petri vetro nella parte inferiore della sezione e diffusione uniformemente per creare un sottile strato di cristalli di matrice.
- Il sublimator di assemblare e fissare le due metà con il morsetto a ferro di cavallo. Sospendere l'unità assemblate 15-20 cm sopra un bagno di sabbia, preriscaldato a 220 ° C, collocandolo in un anello di metallo collegato ad uno stand della storta.
- Collegare la camera alla fonte del vuoto, il vuoto di coinvolgere e consentirle di stabilizzare fino a ~ 25 mTorr per 5 min.
- Pack il raffreddamento dito verso l'alto con ghiaccio e aggiungere 50 mL di acqua. Consentire l'apparato a stabilirsi per ulteriori 5 minuti prima di procedere.
- Abbassare la camera sulla superficie della sabbia, garantendo che la sabbia completamente contatto con il fondo della camera e lasciarlo per 45 min creare un rivestimento ideale di 0,22 mg/cm2
Attenzione: Prestare particolare attenzione dovrebbe essere movimentazione vetro ad alto vuoto, come eventuali danni all'apparato, mentre evacuati, può provocare fallimento catastrofico della camera del vetro. - Dopo 45 min, rimuovere la camera il bagno di sabbia sollevando l'anello metallico e sfiatare la camera.
Nota: Una volta che la camera è stata ventilata, la diapositiva deve essere rimosso molto rapidamente come acqua nell'aria inizia a condensare sulla diapositiva dito e campione congelamento. - Rimuovere il vetrino e pesarlo affinché il rivestimento desiderato è stato raggiunto.
Nota: Se insufficiente rivestimento è stato realizzato, semplicemente ripetere il processo di sublimazione per la diapositiva fino a quando lo spessore di rivestimento desiderato è stato raggiunto.
6. ricristallizzazione
- Una volta sublimata, montare il vetrino all'interno la sommità della camera vapore precedentemente costruita, come descritto precedente (tessuto rivolto verso il basso).
- Pipettare 600 µ l di una soluzione contenente un mix 1:1 (v/v) di 100% acetonitrile e 0.1% v/v l'acido trifluoroacetico in acqua con attenzione sulla carta assorbente nella parte inferiore del piatto petri per garantire un rivestimento anche.
- Assemblare la camera, garantendo la diapositiva di microscopio e scheda di carta siano perfettamente allineate e lasciare in un incubatore a 37 ° C per 1 h.
Attenzione: Non sigillare la camera.
Nota: Una volta ricristallizzato, la tonalità normalmente gialla della matrice dovrebbe cambiare in bianco, aspetto meno lucida e appaiono molto anche. Questo indica che ricristallizzazione è stato eseguito correttamente. - Il campione è pronto per l'analisi.
7. Strumentazione
- Analizzare il vetrino in uno scanner piano per creare un'immagine digitale.
- Caricare il campione nello spettrometro di massa e quindi analizzare utilizzando la piattaforma di software appropriato.
- Analizzare i campioni in modalità reflectron ioni positivi con un intervallo di massa Da 750-3.500, con una risoluzione di spot che è applicabile al risultato desiderato. Nella maggior parte dei casi, 20-50 µm larghezza della trama è sufficiente, tuttavia poco quanto 10 µm può essere usato15.
Attenzione: MALDI UV laser sono una fonte di radiazioni ionizzanti e non deve essere visto direttamente. Assicurarsi che il laser è contenuto all'interno dello strumento schermatura prima dell'operazione.
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Representative Results
Se seguita correttamente, questo protocollo produce immagini che rappresentano chiaramente la morfologia lorda del tessuto senza alcun graffio o altre deformazioni (Figura 1). La convalida ideale per una preparazione del campione la corretta esecuzione, è la capacità di distinguere tra diverse strutture fisiche modificando la molecola essere guardato (Figura 2).
Una buona guida per determinare se i campioni sono stati preparati in modo non corretto è quello di verificare la presenza di delocalizzazione o di aggregazione di matrice; firme di peptide che si estendono oltre i bordi del tessuto fisico sono indicatori perfetti che molecole sono stati spostati durante la preparazione del campione. Questo è spiegato in dettaglio in O'Rourke e Padula (2017)15.
Lo spettro di peptide prodotto dovrebbe contenere un'elevata abbondanza di molecole discreti che sono ben distribuiti in tutto il range di massa selezionate1,23 (questo è in gran parte di esempio dipendenti, tuttavia, non è raro vedere oltre 50 firme di peptide discreti da tessuto FFPE) (Figura 3)18.
Figura 1 : Un campione correttamente preparato del tessuto di cervello umano FFF. Questo esemplare di tessuto procedato è stato ripreso a 50 µm e Mostra buona macro struttura e una chiara differenza tra materia bianca (WM) e materia grigia (GM). Campioni preparati con successo mostrerà chiara differenziazione delle posizioni differenti del tessuto. Qui, c'è una regione chiara di up-regolazione del peptide (rappresentato dal rapporto massa / carica, M/Z) 1085 nella regione WM del pannello A. differenziazione è dimostrata anche dall'assenza di quella forma definita nel pannello B seguito dal suo ritorno nel pannello C. Analizzando la distribuzione di tre molecole diverse sullo stesso tratto di tessuto e mostrando che alcuni sono uniformemente distribuiti, mentre altri sono limitati a discrete posizioni fisiche, possiamo vedere che la preparazione del campione è stata eseguita correttamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Una sezione erroneamente preparata di tessuto cerebrale umano FFF. Questo esemplare è stato ripreso a 50 µm ma mostra un livello su larga scala di delocalizzazione. I modelli delle molecole presenti attraverso pannelli 1, 2 e 3 dimostrano chiaramente che, a differenza di Figura 1, c'è una chiara definizione tra regioni biologiche o le differenze nell'abbondanza delle molecole visualizzati. Poiché le immagini sono le stesse, indipendentemente dalle molecole selezionate per la visualizzazione, possiamo concludere che esso ha stato delocalizzato dovuto essere preparato in modo non corretto. Poiché si tratta di tessuto cerebrale, questo risultato non ha senso logico, biologico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Lo spettro di massa globale dell'immagine visualizzata nel Figura 1. Lo spettro contiene un'abbondanza di firme di peptide attraverso l'estremità inferiore della gamma di massa, con diversi picchi di alta massa peptide presente pure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1 : Schematico per taglio carta assorbente usata nella camera di vapore. Spessa carta assorbente è tagliato in una forma circolare con un diametro di 94 mm. Una scheda rettangolare è anche tagliare a corrispondere con la dimensione di un vetrino per microscopio standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 2 : Schema di montaggio della camera del vapore di. Questo schema Mostra come la camera di vapore deve essere montata con nota specifica di come le diapositive di esempio, carta assorbente e nastro adesivo tutti corrispondono con a vicenda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 3 : Schematica dell'Assemblea camera di sublimazione: Questa figura mostra come il campione scivolo, sublimator e apparecchi di riscaldamento sono organizzati per consentire sublimazione riproducibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è stato progettato per massimizzare la generazione di specie molecolari ionizzabili, eliminando la delocalizzazione degli analiti. I fattori chiave comportano utilizzando lo stesso principio prevalente quando l'applicazione di matrix, digerendo il campione, o ricristallizzazione dopo sublimazione24; vale a dire, che un'anche deposizione di vapore, di matrice o in caso contrario, deve essere creato e mantenuto. Pipettaggio solvente lavaggi per ricristallizzazione e la digestione, in modo uniforme sotto il campione, impedisce qualsiasi singola area ricezione vapore più solvibile che altrove. Questo è importante per prevenire la formazione di condensa e nel complesso inibisce la delocalizzazione di molecole di superficie, nonché a garantire che il campione è uniformemente digerito e ricristallizzato. È indispensabile per ottenere una deposizione anche della matrice, come troppo poco mostrerà un'intensità relativamente bassa e la diversità della specie e troppo elimineranno gli ioni del campione, abbassando anche intensità e diversità di specie25. Per ottenere una deposizione anche della matrice, assicurarsi che uno strato uniforme e sottile di cristalli di matrice di dimensioni omogeneo, sono posti direttamente sotto l'impronta della diapositiva sospeso microscopio. Se lo strato è troppo sottile o irregolari, sublimazione della matrice procede troppo lentamente o sarà irregolare26. I potenziali problemi con applicazione manuale di solvente ed enzima scende all'esperienza individuale dell'utente. Certo livello di "pratica" è necessario per assicurare un risultato ripetibile, e ci possono essere alcuni preparazione iniziale di errato accidentale. Tuttavia, se la cura è presa per assicurare che l'immagine finale è in conformità con le proprietà del campione "buona" abbiamo fornito, quindi qualsiasi campioni impropriamente preparati non porterà a conclusioni false biologici.
Per digerire efficacemente un campione di tessuto conservato in formaldeide (FFPE o FFF), è essenziale rimuovere come molte delle reticolazioni metilene come possibile prima della tripsina deposizione16. Questo è facilmente ottenibile da riscaldamento del campione in una pentola a pressione a > 100 ° C, per una breve durata, senza effettivamente causare bolle che meccanicamente possono dissociare il campione. Tessuto può essere facilmente perso quando trattati in tale maniera, così, al fine di combattere questo, NC diapositive sono impiegati. Mentre non critico, assicurano l'integrità fisica del campione sottoposto a calore e pressione, solvente organico. Digestione del campione è quindi raggiunto applicando l'enzima in uno stato che impedisce l'attivazione e quindi permettendo che si asciughi, cioè sospeso in acqua ultra-pura. La camera di vapore poi segue lo stesso principio come ricristallizzazione, fornendo abbastanza di un ambiente umido per permettere il movimento localizzata dell'enzima incontrare ed unire la spina dorsale della proteina, ma non abbastanza "umidità" per consentire i peptidi risultanti alla deriva significativamente dalla loro posizione iniziale26. Pipettaggio direttamente nella diapositiva sarà non delocalizzare qualsiasi superficie analiti, dovuto gli effetti di reticolazione residua e l'insolubilità generale di grandi proteine in acqua.
Anche se ci siamo concentrati sull'applicazione di questa metodologia ai peptidi, può essere facilmente applicato ai flussi di lavoro per l'analisi dei metaboliti, lipidi e proteine intatte. Alcuni passaggi avrebbero bisogno di essere rimosso o aumentata; imaging della proteina intatta non richiede operazioni di taglio proteolitico, ma il flusso di lavoro fondamentale di sezionamento del campione e montaggio seguita da analisi, ricristallizzazione e sublimazione di matrice può essere applicato a quasi ogni tipo di campione. La nostra intenzione per lo sviluppo di questo protocollo e garantendo la sua affidabilità e robustezza attraverso le vaste indagini empiriche, era quello di creare un metodo che richiede poche o nessuna modifica, che utilizza apparecchiature poco costoso ed è favorevole ad un ampio Comunità con vari gradi di strumentazione e biochimici abilità. Ci auguriamo che questo apre nuove prospettive di indagine ai laboratori che altrimenti avrebbe allontanato questa tecnica come troppo complicato o costoso. Siamo anche sicuri che abbiamo fornito il primo metodo di preparazione del campione definitivo per peptide MSI. Al momento della scrittura, la maggior parte delle metodologie sono state in gran parte basato sulla strumentazione, con una particolare attenzione per la facilità d'uso di spruzzare il robot basato su metodologie27,28,29. C'è stato anche poco in termini di metodologie di idrolisi di metilene affidabile con congettura per quanto riguarda la procedura corretta e l'apparecchio deve essere utilizzato.
In conclusione, riteniamo che l'applicazione del suddetto metodo ai tessuti FFPE e FFF, si tradurrà in una maggiore fiducia nell'efficacia di MSI per l'analisi dei peptidi.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi o interesse commerciale di divulgare
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare il Sydney Medical School Foundation e il Blues e la Fondazione per il finanziamento di parte di questo lavoro attraverso il loro programma di borsa di studio di dottorato per la ricerca sulla malattia di Alzheimer e una sovvenzione di ARC Discovery (DP160102063) assegnato a PKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
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