Summary
이 프로토콜의 포 르 말린 고정 조직을 이미징 질량 분석에 대 한 운명 승화 기반 준비에 대 한 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.
Abstract
매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여, 질량 분석 이미징 (MALDI MSI) 급속 하 게 확장 했다, 때문에이 기술은 분석 N-glycans에 약물과 지질에서 생체의 호스트. 다양 한 샘플 준비 기술 존재 감지 포름알데히드 보존 조직에서에서 펩 티 드 대량 spectrometric 분석의이 유형에 대 한 가장 어려운 문제 중 하나 남아 있다. 이러한 이유로, 우리 만든 고 최적화 ionizable 펩 티 드의 가장 큰 수를 도출 하는 동안 샘플에 포함 된 공간 정보를 유지 하는 강력한 방법. 우리는 또한 목적 비용 효과적이 고 간단한 방법으로 이것을 달성 함으로써 계측 자동화를 사용 하 여 때 발생할 수 있는 잠재적인 편견 또는 준비 오류를 제거. 최종 결과 저렴 하 고 재현할 수 프로토콜.
Introduction
매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI MSI) 이미징 대 한 2 년간1,2, 생체 등의 범위를 분석 이미지 기반 기술로 고용 되었다: 지질3, 펩 티 드2 ,4, 단백질2,5, 대사6,7, N-glycans8및 치료 약물9,10같은 합성 분자. 이 기술은의 유틸리티를 시연 하는 간행물의 수는 지난 10 년간6,11,,1213이상 크게 성장 했다. 지질, 같은 특정 분자는 MALDI MSI를 통해 분석 하는 그들은 그들의 화학 특성으로 인해 쉽게 이온화 하 고 따라서 필요한 작은 사전 준비3상대적으로 쉽습니다. 그러나, 펩 티 드와 같은 더 어려운 목표를 위해 효과적으로이 분자를 이온화 하는 데 필요한 단계는 일반적으로 복잡 하 고 광범위 한14. 현재 주소로 목표로 또는 재현성이 독특한 비주얼 기법15조직 준비 하 고용 방법론에서을 설명 하는 거의 게시 있다. 이러한 이유로, 우리는 관찰 컴파일되고 최적화 구현 단일으로 구현 하기 쉬운 방법론은 포름알데히드에서 펩 티 드의 분석에 대 한 더 작은 수정 해야 했더라도 조직 소스14.
이 원고에서 우리 검색 및 포 르 말린 고정 언된 (FFF) 및 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 섹션에서 생성 된 펩 티 드의 공간 매핑 확인, 저렴 한 비용 재현할 방법론을 설명 했습니다. 이 방법론 필요 또는 어떤 특수 계측3에 의존 하지 않습니다. 특히, 우리; 펩 티 드를 분석 하는 데 필요한 전문된 샘플 준비의 많은 측면을 해결 antigen 검색16 등 매트릭스 코팅 단계. 우리의 프로토콜은 또한 저렴 한 장비 및 시 약, 그렇지 않으면 수 없습니다 대체 로봇 기구17살 하는 더 넓은 지역 사회에 액세스할 수 하이 방법론을 활용 합니다.
수동 샘플 준비 방법 개발 뒤에 추론 했다 두 배: 첫째,는 sublimator 사용 하 여 만듭니다 ~ 1 µ m 길이18, 뭔가 더 일반적인 분사 unachievable는 매트릭스 결정의 일관성과 균일 코팅 기술입니다. 둘째, 비용의 상대적으로 작은 설정: 사용자 정의 장치의 총 비용은 <$ 1500 AUD. 우리는 비용 효율성 측면에서 샘플 당 가격이 훨씬 저렴 관련 없는 로봇 기계 때 주의. 그러나 승화를 사용 하 여 보고 되었습니다 이전,, 우리의 지식 최선을 다 해 준비 하 고이 과정을 설명 하는 단계별 방법론도 보고 되어 하지 문학에서 설명.
이 프로토콜은 연구자는 MALDI 질량 분석기에 대 한 액세스를가지고 누군지 관심19의 바이오 분자에 관하여 공간 정보 생성에 도움을 것입니다. 본질적으로, MALDI MSI 조직학을 심사의 항 체에 의존 하지 않는 또는2얼룩입니다.
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Protocol
주의: 모든 적용 가능한 안전 주의 사항은 따라야 할 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (예: 실험실 코트, 니트 릴 장갑, 안전 안경, 등)의 사용을 포함 하 여이 절차를 수행할 때
1입니다. 시 약 및 장비 준비
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솔루션의 준비
- Carnoy의 액체의 500 mL, 혼합 준비 100% 에탄올 (EtOH), 클로 프롬, 및 6에 빙 초 산: 깨끗 한 유리병 쇼트에서에서 3:1 v/v/v 비율.
- 액체 니트로 (NC)을 하려면 부드러운 동요 40 mg/mL의 최종 농도에 의해 NC 멤브레인 (일반적으로 서쪽에 게 더 럽 히기에서 사용 되는) 깔끔한 아세톤에 녹.
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NC의 준비 코팅 슬라이드
- 조직학 시험20 NC 준비 얼룩 혈액의 준비를 위해 사용 하는 것과 비슷한 기술을 사용 하 여 슬라이드 코팅.
- 도전성 인듐 주석 산화물 (ITO) 현미경 슬라이드의 한 가장자리에 액체 NC의 40 µ L 플라스틱 일반 유리 현미경 슬라이드를 사용 하 여도 박막 코팅을 만들 슬라이드 표면 장력에서 NC 끌어 합니다.
- NC 20 s와 다음 스토어 실내 온도에 필요할 때까지 실 온에서 건조를 허용 합니다. 이러한 조건 하에서 샘플 저장 수 있습니다 명확한 조직 유지 및 먼지의 무료 제공.
참고:이 방법을 준비로 더 잘 알려진 "박막" 이며 표면 장력 자동 슬라이드에 레벨의 부족 뿐만 아니라 NC의 점성에 의존 하는 균일 한 코팅을 생산할 예정 이다. 유일한 관리 너무 빨리 이동은 슬라이드를 준비 하는 때 수행 해야 하는 완전 한 범위 보다는 NC의 줄무늬를 생성 합니다.
주의: 액체 NC 매우 빠르게 건조, 그것은 제대로 확산 되었습니다 하기 전에 솔루션을 건조 하지 않도록 신속 하 게 작동에 필수적. 한다 또한 주의 그것의 액체 상태에서 NC 처리는 높게 정력적 인 화합물 이며 소이 폭발을 방지 하기 위해 점화의 소스 문의 하지 때. NC는 또한 발열 전환 때 건조 하면 감기 화상 피부 또는 gloved 손을 장기간 접촉을 허용 하는 경우를 겪 습. 모든 관련 된 위험을 최소화 하기 위해 각 시간에만 소량을 준비 (< 1 mL 권장). 일단 건조 실 온에서 안정적입니다. 그러나, NC 폭발 때 대량에 남아 수 있습니다.
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사용자 지정 증기 챔버의 창조
- 한 조각 잘라 두꺼운 압 지의 하단에 맞게 충분히 큰가 위를 표준 플라스틱 페 트리 접시 (94 m m 직경에서 및 두께 3 m m)의 절반.
- 센터, 종이 페 트리 접시 (보충 그림 1)에서 위치를 유지할 것 이다 그래야 충분히 초과 떠나 현미경 슬라이드 같은 크기에에서 사각형 스트립을 떠나 종이 잘라.
2입니다. 조직 단면도의 준비
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FFPE 직물21.
- 원하는 조직 블록 및 그것 12 µ m 두께 표준 벤치 마운트 톰, 플 로트 마운트에는 NC에 미리 이토 슬라이드 코팅 섹션을 선택 합니다.
- 2 분, 잔여 파라핀을 제거 하는 신선한 자일 렌에 슬라이드 잠수함 그리고 두 번 작업을 반복.
참고: 경우 파라핀 블록은 특히 보급 또는 조직을 파라핀 블록에 비해 상대적으로 작습니다, 샘플이 크 실 렌에서 세척 전에 대부분 멀리 녹기 60 ° C에 난방 수 있습니다. - Deparaffinized 샘플 등급된 용 매 시리즈에 슬라이드를 잠수 하 여 세척: 70 %v / v EtOH/물, 100 %EtOH, Carnoy의 액체, 100 %EtOH, 초 순수한 물, 100 %EtOH. 각 침수 기간 30 이어야 한다 s, Carnoy의 액체를 2 분 마지막 해야 합니다 제외.
주의: Carnoy의 유체 및 크 실 렌 저장 고 사용 증기 두건에서 흡입 하는 경우 그들은 매우 독성이 있습니다.
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포 르 말린 고정 언된 (FFF) 조직
참고: 샘플 한다 이미 동결, 적절 하 게 샘플 유형.- 20 분22에 대 한 톰의 동작 온도에서 조직 블록 equilibrate
참고: 평형 온도 조직의 종류에 따라 달라 집니다. - 섹션 조직 12 µ m 및 해 동 마운트에는 톰을 사용 하 여 미리 준비 된 NC에 섹션 코팅 이토 슬라이드.
- 어둠 속에서 벤치에 진공 desiccator에 슬라이드를 저장 합니다.
참고: 샘플은 이러한 조건에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. - FFPE 직물 (2.1.3)에 대 한 명시 된 등급된 용 매 시리즈에서 샘플을 씻으십시오.
참고: 거기 아무 필요도 자일 렌 deparaffinisation 단계에 대 한 샘플 포함 되지.
- 20 분22에 대 한 톰의 동작 온도에서 조직 블록 equilibrate
3. 메 틸 렌 Crosslink 가수분해
- 20 mmol tris HCl (pH 8.8)와 함께 상단에 가득 플라스틱 슬라이드 상자 (FFF 또는 FFPE) 샘플 슬라이드를 로드 합니다. 상자를 봉인 하 고 하단 터치 상자를 수 있도록 물 500 mL를 포함 하는 물 목욕에. 다음 70 kPa의 운영 압력을 달성할 수 있는 압력 밥 솥에서 120 ° C에서 15 분 동안 그것을 열.
- 슬라이드를 제거 하 고 냉각, 하도록 허용 15 분 동안 주위 온도에 말리.
4. 조직 소화
- 일단 분해, 조직 단면도의 가장자리에 솔루션의 pipetting 10 µ L에 의해 매우 순수한 물에 10 µ L의 트립 신 솔루션 (1 mg/mL)와 샘플을 코트 다음, 표면 아래 조직의 전체 표면에 걸쳐 있는 물방울을 끌어 동일한 피 펫 팁을 사용 하 여, 긴장입니다.
참고: 피 펫 팁와 확산 조직의 가장자리의 국경 넘어 효소 이상 조직 표면을 긁는 피하십시오. - 샘플 온도에서 건조를 허용 합니다.
- 일단 건조, 슬라이드 (보조 그림 2)의 어느 가장자리에 고압 테이프와 이전 생성 된 증기 챔버 (아래로 조직)의 상단 내부 샘플을 탑재 합니다.
- 손가락 균등 하 게 젖은 것 같습니다 때까지 100% 이기와 50 m m 염화 중 탄산염의 페 트리 접시의 하단 부분에 압 지 손가락에 신중 하 게 1:1 v/v 혼합을 포함 하는 솔루션의 600 µ L 플라스틱
- 증기 챔버의 상반신 절반, 종이 손가락 및 예제 슬라이드를 보장, 완벽 하 게 정렬 하는 하단에 배치와 파라핀 영화와 그것의 적도 주위 챔버 인감.
- 완전 한 소화 수 있도록 37 ° C 배양 기에서 샘플을 하룻밤 둡니다.
5. 매트릭스 코팅 승화를 통해
- 일단 소화, 무게 5 자리 microanalytical 균형에 샘플 슬라이드.
- 승화 기구 냉각 손가락에 슬라이드를 탑재 하 고 증기 챔버 (보충 그림 3)에 설명 된 대로 동일한 방식으로 구리 테이프를 확보.
참고: 슬라이드 냉각 손가락으로 균등 하 게 연결 되도록 구리 테이프의 레이어 레벨 표면 냉각 손가락의 하단에 배치 됩니다. 이렇게 하면 슬라이드 매트릭스의도 증 착에 이르게 냉각 균등 하 게 된다. - 300 밀리 그램 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 매트릭스의 아래쪽 챔버와 매트릭스 결정의 얇은 층을 만들 수 균등 하 게 확산의 유리 페 트리 접시에 놓습니다.
- sublimator를 조립 하 고 호스 클램프와 함께 두 개의 반쪽을 확보. 쌈을 스탠드에 연결 된 금속 반지에 그것을 배치 하 여 220 ° C에 미리 데워 모래 목욕 위에 조립 단위 15-20 cm를 일시 중단 합니다.
- 챔버 진공 소스에 연결, 진공, 참여 하 고 5 분 동안 25 mTorr로 안정 있습니다.
- 얼음 위로 냉각 손가락 팩 고 물 50 mL를 추가 합니다. 진행 하기 전에 추가로 5 분 동안 정착 장치를 허용 합니다.
- 낮은 보장 완전히 챔버의 하단을 연결 하는 모래는 모래의 표면에 챔버와 0.22 mg/cm2 의 이상적인 코팅을 만드는 데 45 분 동안 그것을 두고합니다
주의: 한다 주의 때 기구에 어떤 손상으로 높은 진공에서 유리를 처리, 철수 하는 동안 유리 챔버의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다. - 45 분 후 금속 링에 올려서 모래 목욕에서 챔버를 제거 하 고 환기 약 실.
참고: 챔버 통풍 되었습니다 일단 슬라이드 제거 해야 합니다 매우 빠르게 공기에 물 동결 손가락 및 샘플 슬라이드에 응축 하기 시작 합니다. - 슬라이드를 제거 하 고 원하는 코팅 달성 되도록 그것을 무게.
참고: 부족 한 코팅, 달성 하는 경우 단순히 반복 승화 과정 슬라이드에 대 한 원하는 코팅 두께 달성.
6입니다. recrystallization
- 승화, 일단 기술된 이전 (조직으로 아래로) 이전 생성 된 증기 챔버의 상단 내부 샘플 슬라이드를 탑재 합니다.
- 100% 이기와 0.1 %v / v trifluoroacetic 산도 코팅을 보장 하기 위해 페 트리 접시의 하단 부분에 압 지에 신중 하 게 물에서의 1:1 (v/v) 혼합을 포함 하는 솔루션의 600 µ L 플라스틱
- 챔버를 조립, 종이 탭 및 현미경 슬라이드 보장, 완벽 하 게 정렬 하 고 1 시간에 대 한 37 ° C 배양 기에서 두고.
주의: 챔버를 밀봉 하지 마십시오.
참고: 일단 박막, 매트릭스의 일반적으로 노란 색조 해야 흰색으로 변경, 덜 환 나타나고 매우도 있습니다. 이 recrystallization 제대로 수행 되었습니다 나타냅니다. - 이 예제는 이제 분석을 위한 준비.
7입니다. 계측
- 디지털 이미지를 만드는 평판 스캐너에서 슬라이드를 검사 합니다.
- 질량 분석기에는 샘플을 로드 하 고 적절 한 소프트웨어 플랫폼을 사용 하 여 분석.
- 750-3500 다 원하는 결과에 적용 되는 자리 해상도 대량 범위와 긍정적인 이온 reflectron 모드에서 샘플을 분석 합니다. 그러나 대부분의 경우, 20-50 µ m 래스터 폭은 충분 하, 10 µ m로 작은 수 사용된15.
주의: MALDI UV 레이저 이온화 방사선의 원천이 되며, 직접 볼 수 없습니다. 레이저 악기 차폐 작업 이전에 포함 되어 있는지 확인 합니다.
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Representative Results
정확 하 게 따라 하는 경우이 프로토콜 명확 하 게 어떤 찰 상 또는 다른 변형 (그림 1) 없이 조직의 심한 형태를 나타내는 이미지를 생성 합니다. 올바르게 수행된 샘플 준비를 위한 이상적인 유효성 검사 되는 분자를 변경 하 여 다른 물리적 구조 사이 구별 하는 기능 (그림 2) 볼 이다.
샘플 제대로 준비 된 하지 하는 경우를 결정 하기 위한 좋은 가이드 delocalization 또는 매트릭스 집계;의 존재를 확인 하는 것입니다. 실제 조직의 경계를 넘어 확장 하는 펩 티 드 시그니처는 분자 견본 준비 동안 이동한 완벽 한 지표. 이것은 오 러키와 Padula에 자세히 설명 (2017)15.
그러나 생산된 펩 티 드 스펙트럼 잘 선택한 대량 범위1,23 분산 된 개별 분자의 높은 풍부를 포함 해야 합니다 (이 크게 의존 샘플은,, 그것은 50 초과 보고 특이 한 FFPE 직물에서 분리 된 펩 티 드 서명) (그림 3)18.
그림 1 : FFF 인간 뇌 조직의 올바르게 준비 샘플. 이 처리 조직 표본 50 µ m에 몇 군데 하 고 좋은 매크로 구조 및 백색 질 (WM) 및 회색 (GM)의 명확한 차이 보여 줍니다. 성공적으로 준비 된 샘플은 다른 조직 위치의 명확한 차별화를 보여줄 것 이다. 여기, 펩 티 드 (질량-전 비, M/Z로 표현)의 위로 규칙의 명확한 지역 있다 A. 차별화 패널 B에에서 정의 된 모양 그의 부재에 의해 입증 되는 패널의 WM 지역에서 1085 패널 C.에에서 그것의 반환 다음 시 금 같은 조직 섹션에 3 개의 다른 분자의 분포와 보여주는 일부는 균일 하 게 분산, 다른 개별 물리적 위치를 제한 하는 동안, 우리는 샘플 준비 제대로 수행 되었습니다 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : FFF 인간 뇌 조직의 잘못 준비 섹션. 이 표본 50 µ m에 몇 군데 하지만 delocalization의 대규모 수준을 보여 줍니다. 패널 1, 2와 3에서 현재 분자의 패턴 명확 하 게, 그림 1, 달리는 생물 지역 또는 표시 하는 분자의 풍부에 차이 사이의 명확한 정의 보여 줍니다. 이미지는 디스플레이 위해 선택 하는 분자에 관계 없이 동일 이후 우리가 되 고 올바르게 준비 때문 delocalized 되었습니다 가정할 수 있습니다. 이 뇌 조직 이므로,이 결과 논리, 생물 학적 의미를 만들지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 글로벌 질량 스펙트럼에 표시 되는 이미지의 그림 1. 스펙트럼 뿐만 대량 범위, 현재 여러 높은 대량 펩타이드 봉우리의 하단에 걸쳐 서명 펩 티 드의 풍부한을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1 : 증기 챔버에 사용 되는 절단 압 지에 대 한 도식. 두꺼운 압 지 94 m m의 직경을 가진 원형 모양으로 잘라입니다. 사각형 탭 표준 유리 현미경 슬라이드의 크기와 일치 하도록 또한 그만입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2 : 증기 챔버의 어셈블리 회로도. 이 회로도 샘플 슬라이드, 압 지와 접착 테이프 서로와 일치 하는 어떻게의 특정 메모와 함께 증기 챔버 한다 조립 하는 방법을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 3 : 승화 챔버 어셈블리의 구조: 이 그림에서는 재현할 수 승화 수 있도록 샘플 슬라이드, sublimator, 및 난방 장치는 정렬 되는 방식을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 analytes의 delocalization를 제거 하는 동안 ionizable 분자 종의 생성을 극대화 하도록 설계 되었습니다. 매트릭스, 샘플, 소화 또는 승화24; 후 recrystallizing를 적용할 때 동일한 재정의 원리를 사용 하 여 포함 하는 주요 요인 즉, 그의 증기도 증 착 매트릭스 또는 그렇지 않으면, 창조 되 고 유지 필요. Recrystallization와 소화, 균등 하 게 샘플을 아래에 대 한 용 매 세척 pipetting 곳 보다 더 많은 용 매 증기를 받고 개별 영역을 방지 합니다. 이 보이는 응축의 대형을 방지 하기 위한 중요 한 이며 전반적인 delocalization 샘플은 균등 하 게 소화 하 고 박막 뿐만 아니라 표면 분자를 억제. 그것은 절대적으로 너무 작고 상대적으로 낮은 강도 및 종의 다양성을 보여줄 것이 서 행렬의도 증 착을 달성 하 고 또한 강도와 종25의 다양성을 낮추는 샘플에서 이온 억제 것 이다 너무 많이. 매트릭스의도 증 착을 달성 하기 위해 동종 크기의 매트릭스 결정의도, 얇은 레이어 바로 아래 정지 현미경 슬라이드의 발자국 배치 됩니다 확인 하십시오. 레이어가 고르지 또는 너무 얇은 경우는 행렬의 승화는 너무 느리게 진행 됩니다 또는 고르지26됩니다. 잠재적인 수동 응용 프로그램의 용 매와 고 효소는 사용자의 개인 경험에 내린다. "연습"의 일부 레벨 반복 가능한 결과 보장 하기 위해 필요 하 고 몇 가지 초기 실수로 잘못 된 준비 될 수 있습니다. 그러나, 경우는 주의 마지막 이미지는 "좋은" 샘플의 속성에 따라 되도록 우리 제공, 다음 모든 잘못 준비 샘플 틀린 생물 학적 결론 않을 것 이다.
효과적으로 소화 FFPE (FFF) 포름알데히드에 보존 조직 샘플, 위해 methylene crosslinks 트립 신 증 착16전에 가능한 많이 제거 필수적 이다. 이 샘플에서 압력 밥 솥에가 열에 의해 쉽게 이루어집니다 > 실제로 기계적으로 샘플을 떼어 놓다 수 거품 발생 하지 않고 짧은 기간 동안 100 ° C. 조직 수 쉽게 손실 될 그런 방법으로, 그래서이 방지 하기 위해 치료 NC 슬라이드 고용 됩니다. 중요 하지, 하는 동안 그것은 열, 압력, 및 유기 용 매를 때 샘플의 물리적인 무결성을 보장지 않습니다. 샘플의 소화 효소의 활성화를 방지 하는 상태에서 적용 하 고 다음, 즉, 초 순수한 물에 건조 수 있도록 다음 이루어집니다. 증기 챔버 다음 충분히 발생 하 여 단백질 등뼈, 하지만 충분 하지 않은 "촉촉한" 드리프트 결과 펩 티 드 수 있도록 쪼개 효소의 지역화 된 움직임을 허용 하는 습 한 환경을 제공 하는 recrystallization로 동일한 원리를 따른다 그들의 초기 위치26에서 크게. 슬라이드에 직접 pipetting 잔여 가교의 효과와 물에 큰 단백질의 일반적인 용해성 어떤 표면 analytes를 delocalize 하지 것입니다.
비록 우리는 펩 티 드가이 방법론의 적용에 초점을 맞춘, 대사, 지질, 그리고 그대로 단백질의 분석에 대 한 워크플로를 쉽게 적용할 수 있습니다. 몇 가지 단계를 제거 하거나 증강; 필요 그대로 단백질 이미징 분해 분열 단계, 하지만 샘플 단면 기본 워크플로 필요 하지 않습니다 하 고 장착 매트릭스 승화, recrystallization, 및 분석 샘플의 거의 모든 종류에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 개발 하 고 그것의 신뢰성과 견고성 광범위 한 경험적 조사를 통해 우리의 의도 저렴 한 장비를 사용 하며 넓은 의무가 거의 또는 전혀 수정 해야 하는 메서드를 만드는 것 이었다 다양 한 각도 계측 및 생 화 확 적인 기술 커뮤니티. 우리는이 새로운 경로 열 것이 너무 복잡 하거나 비싼이 기술을 기 각 달리는 실험실 조사 바랍니다. 우리는 또한 우리는 펩 티 드 MSI에 대 한 첫 번째 확실 한 샘플 준비 방법 제공 확신입니다. 작성 당시, 대부분 방법론 크게 계측 기반 되었습니다, 그리고 로봇 살포의 사용의 용이성에 특히 중점을 방법론27,,2829를 기반으로. 또한 계속 있다 추측 올바른 절차와 사용 되는 기구와 안정적인 methylene 가수분해 방법론의 방법으로 약간.
결론적으로, 우리는 FFPE 및 FFF 조직 위의 방법론의 응용 펩 티 드의 분석에 대 한 MSI의 효능에 더 중대 한 신뢰 될 고려 하십시오.
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Disclosures
저자 상충 또는 공개 상업적인 관심 있다
Acknowledgments
저자는 Alzheimer의 질병 연구와 PKW에 게 수 여 한 호 발견 그랜트 (DP160102063)에 대 한 그들의 박사 학위 장학금 프로그램을 통해이 작품의 일부 자금에 대 한 시드니 의료 학교 재단 및 파랑 및 재단을 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
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