Summary
Bu iletişim kuralı için görüntüleme kütle spektrometresi mukadder doku sabit formalin süblimasyon tabanlı hazırlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem açıklanır.
Abstract
Biomolecules N-glukanlardir için bir ana bilgisayardan uyuşturucu ve lipidler bu teknik analiz eder bu yana matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kullanımı, kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme hızlı bir şekilde, genişledi. Çeşitli örnek hazırlama teknikleri mevcut olmasına rağmen peptidler doku korunmuş formaldehit üzerinden tespit bu tür kitle spektrometrik analizi için en zor sorunlardan biri kalır. Bu nedenle, biz oluşturulan ve ionizable peptidler en fazla alabilme örnek içinde yer alan uzamsal bilgileri korur sağlam bir metodoloji en iyi duruma getirilmiş. Biz de bu maliyet etkin ve basit bir şekilde elde etmek böylece otomatik araçları kullanarak bağlandığınızda oluşabilir potansiyel önyargı veya hazırlık hata ortadan kaldırarak nişan. Sonuçta bir tekrarlanabilir ve ucuz iletişim kuralıdır.
Introduction
Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme yirmi yılda1,2biomolecules de dahil olmak üzere bir dizi analiz, bir görüntü dayalı teknik olarak istihdam: lipidler3, peptidler2 ,4, proteinler2,5, metabolitleri6,7, N-glukanlardir8ve tedavi uyuşturucu9,10gibi sentetik moleküller. Bu teknik yardımcı programı gösteren yayınlar sayısı önemli ölçüde son on yılda6,11,12,13üzerinde büyüdü. Bazı moleküllerin, lipitler, onlar kolayca onların kimyasal yapısı nedeniyle iyonize ve böylece küçük önceden hazırlık3istemek yolu ile maldı MSI, analiz etmek nispeten kolaydır. Ancak, peptidler gibi daha zor hedefler için kapsamlı ve genellikle karmaşık14etkili bu moleküllerin iyonize için gereken adımlar vardır. Şu anda bu adrese amacı veya doku bu benzersiz görsel tekniği15için hazırlamak için istihdam edilmektedir metodolojileri tekrarlanabilirlik göstermek çok az yayın vardır. Bu nedenle, biz gözlemler derlenmiş ve en iyi duruma getirmeleri uygulanan tek bir, uygulanması kolay, küçük hiçbir değişiklik, peptidler bir formaldehit üzerinden analizi için gerekli metodoloji çapraz bağlı doku kaynak14.
Bu makale, algılama ve peptidler, formalin sabit dondurulmuş (FFF) ve parafin gömülü (FFPE) doku bölümleri formalin sabit üretilen kayma eşleştirme için doğrulanmış, düşük maliyetli tekrarlanabilir metodoloji anlatmıştık. Bu metodoloji gerektirmez veya üzerinde herhangi bir özel araçları3kullanmaz. Özellikle, özel numune hazırlama peptidler analiz etmek gerekli birçok yönlerini ele; adımları antijen alma16 ve matris kaplama gibi. Bizim iletişim kuralı da ucuz ekipmanları ve Kimyasalları, böylece bu metodoloji aksi takdirde diğer robot aparatı17göze mümkün olacaktır bir toplumun erişilebilir hale getirme kullanır.
Bir elle numune hazırlama yöntemi geliştirmek arkasındaki mantık iki kat: Öncelikle, bir Süblimatör kullanımı ~ 1 µm uzunluğu18, bir şey daha yaygın püskürtme ile ulaşılmaz olan matris kristalleri ile tutarlı ve homojen bir kaplama oluşturur teknikleri. İkinci olarak, maliyeti nispeten küçük kurmak: özel aparat toplam maliyeti oldu < 1500 $ AUD. Biz maliyet etkinliği açısından dahil hiçbir robot makine olduğunda örnek başına fiyat çok daha ucuz olduğunu unutmayın. Süblimasyon kullanımı daha önce ancak, en iyi bizim bildiğim için bu süreci tanımlamak ve hazırlık örnek adım adım metodolojileri değil rapor ne de literatürde açıklanan bildirilmiştir.
Bu iletişim kuralı bir maldı Kütle Spektrometre erişiminiz var demektir ve faiz19bir biyo-molekül ile ilgili olarak mekansal bilgi üreten niyet kimsin araştırmacılar yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Özünde, maldı MSI histolojik bu eleme bir çeşit antikor üzerinde dayanmaz veya2lekeleri var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dikkat: Tüm ilgili güvenlik önlemleri uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) (Örneğin, laboratuvar mont, nitril eldiven, koruyucu gözlük, vb) dahil olmak üzere bu yordamı uygularken takip edilmesi gereken
1. hazırlanması reaktifler ve ekipman
-
Çözümler hazırlanması
- Mix Carnoy'nın sıvı 500 mL hazırlamak için % 100 etanol (alkol), kloroform ve buzul Asetik asit 6:3:1 v/v/v oranı temiz cam Schott şişede.
- Sıvı nitroselüloz (NC) yapmak için 40 mg/mL nihai bir konsantrasyon için nazik ajitasyon tarafından düzgün aseton içinde NC membran (western Blot yaygın olarak kullanılan) geçiyoruz.
-
NC kaplı slaytların hazırlanması
- Kan hazırlanması için kullanılan benzer bir teknik NC hazırlamak histolojik inceleme20 için smear kullanım slayt kaplı.
- Bir kenarından bir iletken indiyum kalay oksit (ITO) mikroskop slaydın üzerine sıvı NC 40 µL pipet. Normal cam mikroskop slayt kullanarak, NC yüzey gerilimi altında bile ince film kaplama oluşturmak için slayt üzerinde sürükleyin.
- NC 20 s ve oda sıcaklığında gerekinceye kadar sonra mağaza oda sıcaklığında kurumasını sağlar. Doku korunur ve toz ücretsiz sağlanan örnekler bu koşullar altında bir belirsiz olabilir.
Not: Bu yöntem hazırlık daha çok bilinen adıyla "ince film" ve NC viskozite yanı sıra kendi kendine slaytta seviyeye yüzey gerilimi eksikliğine dayanan bir üniforma kaplama üretecek. Tam kapsama yerine NC çizgiler yaratacak slaytların hazırlanması çok hızlı hareketli olduğunda alınması gereken tek bakım.
Dikkat: sıvı NC çok çabuk kurur, düzgün yayıldı önce çözüm kurutma önlemek için hızlı bir şekilde çalışması için gerekli. Son derece enerjik bir bileşik olarak sıvı durumuna NC gerçekleştirirken ve yangın patlama önlemek için ateşleme kaynağı başvurmalıdır değil de özen gösterilmelidir. NC aynı zamanda kurutma ve soğuk yanıklar deri veya eldivenli elleri ile uzun süreli temas gelmek için izin Eğer neden olabilir zaman endotermik geçişler uğrar. Tüm ilişkili riskleri en aza indirmek için yalnızca küçük tutarları her anda hazırlanmalıdır (< 1 mL tavsiye edilir). Bir kez kuru oda sıcaklığında stabil. Ancak, NC de büyük miktarlarda varolduğunda patlayıcı kalabilir.
-
Özel buhar odaları oluşturulması
- Kalın Bloting kağıt makas alt sığdırmak için büyük bir çift ile standart plastik petri kabına (94 mm çapında ve 3 mm kalınlığında) yarısı kesilmiş.
- Şehir merkezinde kağıt Petri kabına (ek şekil 1) konumunda korumak yeterli fazla bırakarak bir mikroskop slaytla aynı boyutta bir dikdörtgen şerit bırakarak kağıdı kesin.
2. doku bölümleri hazırlanması
-
FFPE doku21.
- İstenen doku blok ve 12 µm kalınlık bir standart Bank bağlı microtome ve float Mount NC üzerine de ITO slaytları ön kaplamalı bölümü seçin.
- 2 min için kalan parafin kaldırmak için taze Ksilen içindeki slaytları daldırın ve ikinci kez işlemi yineleyin.
Not: parafin blok özellikle yaygın veya doku parafin blok karşılaştırıldığında görece küçük olduğunda, örnekleri 60 ° C'de yıkama Ksilen içinde önce çoğunluk uzak erimeye ısıtmalı olabilir. - Kademeli bir çözelti serisi slaytları batış tarafından deparaffinized örnekleri yıkama: % 70 Hacmen Alkol/su, %100 alkol, Carnoy'nın sıvı, %100 alkol, ultra saf su ve % 100 alkol. Her batma süresi 30 olmalıdır s, 2 dk son gerekir Carnoy'nın sıvı hariç.
Dikkat: Carnoy'nın sıvı ve Ksilen gerekir depolanabilir ve eğer inhale çok zehirli oldukları gibi bir duman başlık, kullanılan.
-
Formalin sabit dondurulmuş (FFF) doku
Not: Örnekleri zaten, uygun şekilde örnek türüne göre dondurulmuş olması.- Microtome 20 dk22çalışma sıcaklığı, doku bloğunu equilibrate.
Not: Denge sıcaklığı doku türüne bağlıdır. - 12 µm ve tezcan Dağı bir microtome kullanarak doku bölümler üzerine önceden hazırlanmış bir NC ITO kaplı bölümüne kaydırın.
- Slaytları karanlıkta bankta bir vakum desiccator saklayın.
Not: Örnekleri bu koşullar altında birkaç hafta saklanır. - Kademeli bir çözelti serisi örneklerinde FFPE doku (2.1.3) belirtildiği gibi yıkayın.
Not: Gerek yoktur Ksilen deparaffinisation adım için örnek gömülü değil gibi.
- Microtome 20 dk22çalışma sıcaklığı, doku bloğunu equilibrate.
3. Metilen Crosslink hidroliz
- Top 20 mmol tris-HCl ile (pH 8.8) dolu bir plastik slayt kutusu içine örnek slaytlar (FFF veya FFPE) yükleyin. Kutuyu kapatın ve 500 mL su, alt dokunmak kutusunu izin içeren bir su banyosunda yerleştirin. Sonra 70 kPa, işletme basıncında elde edebilirsiniz bir düdüklü tencere içinde 120 ° C'de 15 dakika ısı.
- Slaytları Kaldır, onları soğutmak izin ve koyup 15 dakika ortam sıcaklığında kuruyuncaya kadar bırakın.
4. doku sindirim
- Hidrolize kez örnekleri 10 µL tripsin çözüm (1 mg/mL) ile pipetting 10 µL üzerine doku bölümünün kenarından çözümün tarafından ultra saf su içinde kat sonra aynı pipet ucu kullanarak, damlacık doku yüzeyin altında bütün yüzeyi boyunca sürükleyin gerilim.
Not: pipet ucu ve enzim doku kenarları sınırlarının dışına yaymak üzerinde doku yüzeyi çizilmemesi önlemek. - Ortam sıcaklığında kurumaya örnekleri sağlar.
- Kuru bir kez, daha önce inşa edilmiş buhar odası (aşağı bakacak şekilde doku) üst içinde örnekleri slayt (ek Şekil 2) her iki kenarında otoklav bandı ile bağlayın.
- Parmak eşit olarak ıslak gibi görünüyor kadar % 100 Asetonitril ve 50 mM amonyum bikarbonat dikkatle petri kabına alt kısmında Bloting kağıt parmak üzerine 1:1 v/v karışımı içeren bir çözüm 600 µL pipet.
- Buhar odası üst yarısı yarım kağıt parmak ve örnek slayt sağlanması mükemmel hizalamak alt yerleştirin ve parafin film ile onun Ekvator çevresinde odası mühür.
- Örnek gece tam sindirim izin vermek için 37 ° C kuluçka makinesine bırakın.
5. matris kaplama süblimasyon ile
- Bir kere sindirilmiş, örnek slayt bir 5 haneli microanalytical denge üzerinde tartın.
- Slayt süblimasyon aparatı soğutma parmak üzerine monte ve buhar odası (ek şekil 3) açıklandığı gibi aynı şekilde bakır bant ile sabitleyin.
Not: Slayt eşit olarak soğutma finger ile temas sağlamak için bir katman bakır bant yüzey seviyeye soğutma parmak dibinde yer alıyor. Bu slayt eşit olan matris bile birikimi neden soğutmalı sağlar. - α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) matris 300 mg odası ve yayılmasını eşit matris kristaller ince bir tabaka oluşturmak için alt cam petri kabına yerleştirin.
- Süblimatör montaj ve tamamlayan bir at nalı kelepçe ile güvenli. Birleştirilmiş birim 15-20 cm bir imbik stand bağlı metal halka yerleştirerek 220 ° C'de ısıtılmış bir kum Hamamı yukarıda askıya alma.
- Odası vakum kaynağına bağlanmak, vakum meşgul ve 5 min için ~ 25 mTorr aşağı stabilize etmek sağlar.
- Soğutma parmak buz ile üst paketi ve 50 mL su ekleyin. Aparatı devam etmeden önce başka bir 5 min için yerleşmek izin verir.
- Odası kum, kum tamamen odası, alt bağlantı kurduğunda sağlanması yüzeyine daha düşük ve 0,22 mg/cm2 ideal bir kaplama oluşturmak 45 dk için bırakın
Dikkat: cam, yüksek vakum aparatı, herhangi bir hasar olarak işleme tahliye ederken, felaket hatası cam odasının içinde yol açabilir zaman özen gösterilmelidir. - 45 dk sonra metal halka yükselterek kum banyodan odası kaldırmak ve odası delik.
Not: bir kez Bacalı odası, slayt kaldırılmalıdır çok hızlı su hava dondurucu parmak ve örnek slayt üzerinde yoğunlaşmaya başlar. - Slayt kaldırın ve tartmak istediğiniz kaplama elde emin olmak için.
Not: Eğer yetersiz kaplama elde elde istenen Kaplama kalınlığı kadar sadece süblimasyon slayt için işlemi yineleyin.
6. Rekristalizasyon
- Bir kez yüceltilmiş, daha önce inşa edilmiş buhar odası üst içinde örnek slayt (aşağı bakacak şekilde açıklanan önceki doku) olarak bağlayın.
- Hatta bir kaplama emin olmak için petri kabına alt kısmında Bloting kağıda dikkatle suda % 100 Asetonitril ve % 0.1 v/v trifluoroacetic asit karışımı bir 1:1 (v/v) içeren bir çözüm 600 µL pipet.
- Odası montajı, Kağıt sekmesini ve mikroskop slayt sağlanması mükemmel hizalamak ve 37 ° C kuluçka 1 h için bırakın.
Dikkat: odası mühür değil.
Not: recrystallized sonra normalde sarı ton matrisin beyaz için değiştirmek, daha az parlak bak ve çok düz gözükmek. Bu o Rekristalizasyon doğru sahne aldı gösterir. - Örnek şimdi analiz için hazırdır.
7. araçları
- Dijital bir görüntü oluşturmak için bir düz Yataklı tarayıcı içinde slayt tarama.
- Örnek Kütle Spektrometre yük ve ardından uygun yazılım platformu kullanarak çözümleyebilirsiniz.
- Pozitif iyon reflektron modunda 750-3.500 Da, istenen sonuca uygulanabilir bir nokta çözünürlük ile kitlesel bir dizi örnekleri analiz. Çoğu durumda, 20-50 µm raster genişliği yeterli, kullanılan15ancak 10 µm küçük olabilir.
Dikkat: Maldı UV lazerler iyonizan radyasyon kaynağıdır ve doğrudan görülmemelidir. Lazer aleti işlem öncesinde koruyucu içinde yer alıyor olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğru izlediyseniz, bu protokol açıkça olmadan herhangi bir çizik veya diğer deformasyonlar (şekil 1) dokusunun brüt Morfoloji temsil görüntüleri üretir. Doğru gerçekleştirilen numune hazırlama için ideal doğrulama olduğunu molekül olarak değiştirerek farklı fiziksel yapıları birbirinden ayırt yeteneği (Şekil 2) izlendi.
Örnekleri yanlış hazırlanan varsa belirlemek için iyi bir rehber delocalization veya matris toplama varlığı için kontrol etmektir; fiziksel doku sınırların ötesinde genişletmek peptid imzalar molekülleri numune hazırlama sırasında taşındık mükemmel göstergeleridir. Bu ayrıntılı O'Rourke'ye gitti ve Padula olarak açıklanmıştır (2017)15.
Üretilen peptid spektrum de seçilmiş kütle aralığı1,23 dağıtılır ayrık molekülleri yüksek bir bolluk içermelidir (Bu şey büyük ölçüde bağımlı, örnek ancak, 50 aşan görmek anormal değildir ayrık peptid imzalar FFPE dokusundan) (şekil 3)18.
Resim 1 : FFF insan beyin dokusu düzgün hazırlanmış örneği. Bu işlenmiş doku numune görüntüsü 50 µm ve iyi makro yapısı ve beyaz madde (WM) ve gri madde (GM) arasında açık bir fark gösterir. Başarılı bir şekilde hazırlanan örnekleri farklı doku Mekanlar açık farklılaşma gösterir. Burada, yukarı-düzenleme (kitle ücret oranı, M/Z tarafından temsil edilen) peptid, açık bir bölge olduğunu 1085 A. farklılaşma daha fazla tarafından tanımlanmış şekillendiren panelinde B yokluğu gösterdi panelinin WM bölgesinde takip paneli C. onun karşılığında tarafından Aynı doku bölümünde üç farklı molekül dağılımı raporlaması ve bazı düzgün olduğunu gösteren tarafından dağıtılabilir, diğerleri ayrı fiziksel konumlara sınırlı iken, biz-ebilmek görmek numune hazırlama doğru şekilde sahne aldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Yanlış hazırlanmış bir bölümü FFF insan beyin dokusunun. Bu örnek 50 µm görüntüsü ama delocalization büyük ölçekli bir düzeyini gösterir. 1, 2 ve 3 paneller arasında mevcut molekülleri şekillerinin açıkça şekil 1, orada olduğunu, biyolojik bölgeler veya görüntülenen molekülleri bolluk farklılıklar arasında açık bir tanımı yok ispat. Görüntüleri, görüntülenmek üzere seçilmiş molekülleri bakılmaksızın aynıdır bu yana biz bu yanlış hazırlanan nedeniyle delocalized ki sonucuna varabiliriz. Bu beyin dokusu olduğundan, bu sonuç mantıksal, biyolojik mantıklı değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Küresel kitle spektrum içinde görüntülenen resmin Şekil 1. Spektrum peptid imzalar bir bolluk birkaç yüksek kitle peptid zirveleri mevcut ile kitle aralığın alt sınırı üzerinden de içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 1 : Kesme Bloting buhar odasında kullanılan kağıt için şematik. Kalın Bloting kağıt 94 mm çapında dairesel bir şekle kesilir. Dikdörtgen bir sekme Ayrıca standart cam mikroskop Slayt boyutu ile haberleşmek için biçilmiş kaftan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 2 : Derleme şematik buhar odası. Bu şematik nasıl buhar odası örnek slaytlar, Bloting kağıt ve yapıştırıcı bant birbirleriyle nasıl karşılık gelen belirli Not ile monte gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 3 : Şematik süblimasyon odası Meclisi: Bu rakam örnek slayt, Süblimatör ve Isıtma cihazları tekrarlanabilir süblimasyon izin vermek için nasıl yerleştirildiğini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol analitler delocalization ortadan kaldırılması sırasında üretimi ionizable moleküler türlerin en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. En önemli faktörler örnek sindirerek ya da süblimasyon24sonra recrystallizing matris, uygularken aynı geçersiz kılma kuralı kullanarak içerir; Yani, bu buharı, hatta bir birikimi matris veya aksi durumda, oluşturulan saklanır ve gereken. Rekristalizasyon ve sindirim, eşit altında örnek için solvent yıkama pipetting başka bir yerde daha fazla solvent buhar alma herhangi bir bireysel alan engeller. Bu görünür yoğunlaşma oluşumunu önlemek için önemlidir ve genel olarak yüzey molekülleri hem de örnek eşit sindirmek ve recrystallized sağlanması delocalization engeller. Bu çok az bir nispeten düşük yoğunluklu ve türlerin çeşitliliği gösterecektir olarak matris, hatta bir birikimi elde etmek için zorunludur ve çok fazla da yoğunluk ve çeşitlilik türlerin25düşürücü örnekten iyonları bastırır. Matris bile bir birikimi elde etmek için matris kristalleri homojen bir büyüklükte bir hatta, ince tabaka doğrudan askıya alınmış mikroskop slayt footprint yerleştirilir emin olun. Katmanın dengesiz ve çok ince olduğundan, süblimasyon Matrix'in çok yavaş devam edecek veya düzensiz26olacak. Çözücü el ile uygulanması ile potansiyel sorunları ve enzim kullanıcı bireysel deneyim için aşağı gelir. "Uygulama" belli bir düzeyde tekrarlanabilir bir sonuç sağlamak için gereklidir ve bazı ilk yanlışlıkla yanlış hazırlık olabilir. Ancak, son görüntü "iyi" örnek özellikleri uygun olduğundan emin olmak için bakım alınan Eğer biz sağladı, sonra herhangi bir uygun olmayan şekilde hazırlanan örnekleri yanlış biyolojik sonuca götürmez.
Etkili bir şekilde formaldehit (FFPE veya FFF) korunmuş bir doku örneği sindirmek için Metilen Glossar tripsin ifade16önce mümkün olduğunca çoğunu kaldırmak gereklidir. Bu örnek bir düdüklü tencere içinde Isıtma tarafından kolayca gerçekleştirilir > 100 ° C, aslında mekanik olarak örnek ayırmak kabarcıklar neden olmadan kısa bir süre için. Doku kolayca bu, mücadele için böyle bir şekilde, tedavi ederken NC slaytlar istihdam edilmektedir kaybolabilir. Kritik değil iken, ısı, basınç ve organik çözücü tabi zaman örnek fiziksel bütünlüğünü güvence altına almaz. Sindirim örnek sonra onun aktivasyon engeller bir devlet enzim uygulamak ve kurumaya, ultra-saf suda askıya Yani izin vererek elde edilir. Buhar odası aynı ilke olarak Rekristalizasyon yeterince yerelleştirilmiş karşılaşma ve protein omurga, ama drift elde edilen peptidler izin vermek için yeterli değil "ıslaklık" ayırmak için enzim hareketinin izin vermek için nemli bir ortam sağlayarak, aşağıda önemli ölçüde onların ilk konumu26. Doğrudan slayt üzerinde pipetting suda büyük proteinlerin genel insolubility ve kalan crosslinking etkileri nedeniyle herhangi bir yüzey analitler delocalize değil.
Her ne kadar bu metodoloji uygulamaya peptidler odaklı olması, kolayca iş akışlarına metabolitleri, lipidler ve sağlam proteinler analizi için uygulanabilir. Bazı adımlar augmented veya kaldırılacak gerekir; sağlam protein görüntüleme does değil istemek birisi proteolitik bölünme merdiven ama örnek kesit temel iş akışı ve matris süblimasyon, Rekristalizasyon ve analiz takip montaj neredeyse herhangi bir örnek türüne uygulanabilir. Bu iletişim kuralı geliştirmek ve onun güvenilirlik ve sağlamlık geniş ampirik araştırmalar yoluyla sağlanması için niyetimiz oldu ucuz ekipman kullanan ve geniş bir mükellef az veya hiç değişiklik gerektiren bir yöntemi oluşturmak için araçları ve biyokimyasal beceri değişen derecelerde topluluk. Umarız bu soruşturma bu teknik olarak çok karmaşık ya da pahalı kovdum laboratuvarlar için yeni yollar açar. Biz de ilk kesin örnek hazırlama yöntemi peptid MSI için verdiğimiz eminiz. Yazma zamanda, çoğu metodolojiler büyük ölçüde araçları tabanlı, Robotik püskürtme kullanım kolaylığı özel bir vurgu ile metodolojileri27,28,29dayalı. Ayrıca olmuştur küçük şekilde güvenilir Metilen hidroliz metodolojileri varsayım doğru prosedür ve kullanılacak cihazlar ile.
Sonuç olarak, biz yukarıdaki metodoloji uygulama FFPE ve FFF dokulara, MSI etkinliğini peptidler analizi için daha fazla güven içinde sonuçlanacak düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması veya ifşa etmek ticari faiz yazarlar var
Acknowledgments
Yazarlar bu iş onların doktora burs programı sayesinde Alzheimer hastalığı araştırma ve PKW için layık bir ark keşif hibe (DP160102063) parçası finansman için Sydney Tıp Okulu Vakfı ve Blues ve Vakfı kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O'Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
