Summary
Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.
Abstract
Im Gegensatz zu Erwachsenen Drosophila Eierstöcke pupal Eierstöcke sind relativ schwierig zu untersuchen, aufgrund ihrer geringen Größe, Transluzenz und einem pupal Fall umschließt. Die Herausforderung sezieren pupal Eierstöcke liegt auch in ihrem physischen Standort innerhalb der Puppe: die Eierstöcke sind umgeben von Fetten Körperzellen innerhalb der pupal Abdomen, und diese Fettzellen entleert werden, um korrekte Antikörper Färbung zu ermöglichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt dieses Protokolls angepasste Pasteur Mehrkanalpipette um Fett Körperzellen vom pupal Abdomen zu extrahieren. Darüber hinaus einer gekammerten Deckglas anstelle von einem Microcentrifuge Schlauch bei der Färbung dient zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Puppen. Trotz dieser und andere Vorteile der in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge, kann erfolgreiche Durchführung dieser Techniken noch mehrere Tage der Praxis aufgrund der geringen Größe der pupal Eierstöcke beinhalten. In diesem Protokoll beschriebenen Techniken könnte zur Zeit Kurs Experimente gelten in denen Eierstöcke in verschiedenen Entwicklungsstadien pupal analysiert werden.
Introduction
Stammzellenforschung mit Drosophila Eierstöcke hat seit der ersten Dokumentation einer Stammzelle Nische1,2,3,4weit ausgebaut. Nach der Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung genetische Werkzeuge, Drosophila Eierstock, die Sezierungen häufig verwendet wurden, um die Stammzell-Linien zu studieren und Signalwege, die Stammzell-Wartung, Verbreitung und Schicksal in der Stammzellnische regulieren. Kenntnisse über diese Signalwege kann Einblicke in mögliche Ursachen von Krebserkrankungen hervorbringen, die von aberranten Stammzell-Aktivität5,6,7stammen. Es hat auch vor kurzem gezeigt, dass somatische Stammzellen im Eierstock Drosophila , bekannt als follikelstimulierendes Stammzellen (FSCs), stark Säugetier-intestinale Stammzellen in vielerlei Hinsicht von ihrer Organisation8ähneln. Aus diesem Grund sind Drosophila Eierstöcke sehr nützlich Modellsystem für Stammzell-Verhalten zu studieren.
Während Larven und Erwachsenen Eierstöcke bzw. Hinweise auf frühe Stammzell-Entwicklung und endgültige Stammzell-Organisation in der Nische bieten, ist die pupal Eierstock eine Zwischenkonstruktion in die Keimbahn und somatischen Zellen zu reorganisieren und ihre Identitäten zu schaffen 9 , 10. Obwohl mehrere Studien Aspekte der Gewebeentwicklung in den pupal Eierstock10,11,12,13 untersucht, bleiben Fragen hinsichtlich der Differenzierung und der räumlichen Organisation der Eierstock Zelltypen während der pupal Entwicklung. Insbesondere erfolgt die Spezifikation des FSCs in diesem Zeitraum. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sezieren und Färbung pupal Eierstöcke zu gewünschten Zeitpunkten – eine Technik, die in Zeit Kurs Experimente verwendet werden kann, die pupal Eierstock Entwicklung im Detail von den Larven zu Erwachsenen Stadium zu analysieren.
Um die geringe Größe, Transluzenz und Unzugänglichkeit des pupal Eierstocks innerhalb pupal Abdomen berücksichtigen, nutzt dieses Protokoll-Tools wie eine maßgeschneiderte dünne Spitze Pasteur pipettieren, Abdominal-Fett Körpergewebe behindern Antikörper Zugang zu entfernen die Eierstöcke. Eine klare, gekammerten Deckglas verwendet, während die Antikörper Färbung bietet größere Sichtbarkeit der Puppen und ein sanfter Plattform für Schaukeln die Eierstöcke auf eine "Nutator." Basierend auf ein Protokoll für die Larven Eierstock Sezierungen von Maimon und Gilboa14, eine relativ hohe Konzentration von Triton x-100 noch beschäftigt waren bei den ersten Schritten der Färbeverfahren Zellmembran Permeabilisierung und Antikörper Zugang zu maximieren die Eierstockkrebs Zellen.
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Protocol
(1) EggLaying
- Kombinieren Sie etwa zehn männlichen und 15 weiblichen Erwachsenen Drosophila -fliegen des gewünschten Genotyps in ein Fläschchen mit normalen reichen fliegen Lebensmittel mit Hefe ergänzt. Um zu vermeiden, Überbelegung der Durchstechflasche, ermöglichen Sie begatteten Weibchen zur Eiablage nicht länger als 2 – 4 h14.
- Übertragen Sie die Erwachsenen aus dem Fläschchen in ein neues Fläschchen durch Tippen auf das Fläschchen öffnen gegen ein anderes Fläschchen mit fliegen Essen. Lassen Sie die Eiern, Larven bei Raumtemperatur für 3 – 4 Tage zu entwickeln.
2. Auswahl der weiblichen Larven
- Mit einem feuchten feinen Pinsel mit weichen Borsten, machen Sie eine rollende Bewegung mit dem Pinsel entlang der Wand des Röhrchens, wandernde dritte Instar Larven aus dem Fläschchen auf ein Glas gut gefüllt bis zum Rand mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen. Waschen Sie die Speisereste aus den Larven, indem Sie sie zu einem anderen gut gefüllt mit 1 X PBS übertragen.
- Die männlichen und weiblichen Larven mit Pinzette zu trennen. Identifizieren Sie die männlichen Larven durch ein paar große, Runde und transluzenten Hoden eingebettet in Fett Körper an der lateralen Seite des Körpers etwa zwei Drittel nach unten aus seiner vorderen Ende15. Weiblichen Larven sind durchschnittlich größer, weniger transparent als die Männchen und haben viel kleinere Gonaden, die schwieriger zu erkennen sind.
- Wählen Sie gegen männliche Larven, weiblichen Larven zu sammeln. Sammeln Sie mindestens zehn Frauen aus dem Brunnen. Legen Sie die weiblichen Larven in einem separaten, gut gefüllt mit 1 X PBS.
- Mit Hefe ergänzt Verwendung Zangen, die weiblichen Larven sanft in ein neues Fläschchen Fliege Frischkost zu übertragen.
- Platzieren Sie das Fläschchen mit den weiblichen Larven an einem dunklen Ort, Pupariation16zu erleichtern. Im Laufe des Tages überwachen Sie die Larven für Pupariation. Da jede Larve lähmt und entwickelt sich zu einem Prepupa, Kreis Prepupa gegen das Fläschchen und notieren Sie die ungefähre Zeit wenn es zuerst in ein Prepupa bildet. Prepupae durch die Vorwölbung des vorderen Luftlöcher und Timing der Puppenkammer Bildung17zu identifizieren. Lassen Sie die Prepupae, um den gewünschten Zeitpunkt (gemessen in Stunden nach Puppenkammer Bildung, APF) zu entwickeln.
Hinweis: Jedes Tier, das Puppenkammer Bildung innerhalb eines ca. 10 h Intervalls unterziehen kann ein Prepupa betrachtet werden. Das Puppenstadium beginnt ca. 12 h nach der Puppenkammer Bildung nach einer internen Häutung stattgefunden hat.
3. Vorbereitung Puppen Antikörper Färbung
-
Bilden Sie ein dünnes Glas Pipettieren in späteren Schritten verwendet werden, für die pupal fetten Körper ausräumen.
- Schmelzen Sie die Glas-Tipp von einem Pasteur Pipettieren bei einem Bunsenbrenner. Als das Glas schmilzt, verwenden Sie Zange um die Spitze horizontal Weg vom Rest des Pipettieren eine dünnere Spitze bilden ziehen.
- Nach dem Abkühlen, brechen Sie einen kleinen Teil der Pipettieren Spitze, eine nette Runde Öffnung zu bilden. Legen Sie eine Glühbirne an das andere Ende der pipettieren.
- Laden Sie das Pipettieren mit 1 X PBS.
- Um die Puppen zu ernten, die an der Wand des Röhrchens geklebt sind, wenden Sie einen kleinen Tropfen des Wassers entlang der Kontaktzone zwischen Puppe und Fläschchen. 1 – 2 min. warten, bis das Protein lassen Kleber auflösen bevor Sie die Puppe von der Wand mit einem feuchten, feinen Pinsel sanft anheben. Die Puppe mit einem Glas gut gefüllt mit 1 X PBS zu übertragen. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.
- Während das hintere Ende der Puppe mit einem paar der Zange greifen, reißen Sie den vorderen Teil der pupal Fall mit einem anderen paar vorsichtig bis der Kopf der Puppe sichtbar ist.
- Greifen Sie anterior-die meisten Tipp des pupal Kopfes mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Puppe aus ihrer pupal Fall.
Hinweis: Ein Teil des Körpers Fett kann während dieses Vorgangs ergießen. - Trennen und entsorgen der vorderen Hälfte der Puppe aus der hinteren Hälfte, bis nur der Bauch Plünderung übrig bleibt.
-
Der Bauch Plünderung entziehen Sie die Zellen Fett.
- Erfassen der Abdominal-Plünderung gegen die Unterseite des Brunnens mit Zange in der Hand halten Sie das Dünnglas Pipettieren mit 1 X PBS in einer anderen Hand gefüllt.
- Ziel ist die dünne Pipettieren Spitze in Richtung der Öffnung der Sack und langsam Pipettieren 1 X PBS in den Bauch der fetten Körperzellen umgebenden pupal Eierstöcke abzuwaschen.
Hinweis: Die Eierstöcke sind ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen, die im Inneren der Abdominal-Plünderung bleiben sollten. - Waschen Sie ab, die fetten Körper Zellen bis mindestens zwei Drittel des Körpers Fett ist Weg oder die Eierstöcke nahe der Öffnung der Abdominal-Sack sichtbar sind. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt langsam ausführen um nicht die Eierstöcke aus dem Bauch durch Zufall zu waschen.
- Prüfen Sie den Brunnen zu überprüfen, ob die Eierstöcke während der Zelle Fett Duschgel heraus verschüttet haben. Wenn die Eierstöcke nicht sichtbar innerhalb des Brunnens sind, sollten sie im Bauch geblieben sind. Wenn die Eierstöcke herausgekommen sind, legen Sie eine neue Puppe in den Brunnen und wiederholen Sie diesen Schritt.
- Übertragen Sie den Bauch in eine klare Deckglas Kammer gefüllt mit Fixierung-Puffer (1 X PBS, 4 % Paraformaldehyd) und setzen Sie den Deckel an der Spitze. Um zu gewährleisten eine ausreichende Anzahl von Eierstöcken widerstehen Färbung und Montageprozess, sezieren mehr Eierstöcke als nötig.
Achtung: Die Fixierung Puffer enthält Paraformaldehyd, die giftig ist. Bitte tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille, etc..
4. Immunhistochemie
- Während der gesamten Färbung verwenden Sie Zange, um drücken Sie vorsichtig alle schwimmenden Eierstöcke an der Unterseite des Brunnens Deckglas um sicherzustellen, dass die Eierstöcke komplett in Antikörperlösung eingetaucht sind.
- Ortund Streifen doppelseitiges Klebeband auf die flache Oberfläche des einen Nutator, dann legen die gekammerten Deckglas auf der Klebefläche.
- Inkubieren Sie die Eierstöcke im Fixierung Buffer Schritt 3.7 für 15 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Eierstöcke dreimal in 1 X PBS mit 1 % Triton x-100 für 5, 10 und 45 min (1 h insgesamt), bzw. um gründliche Permeabilisierung zu ermöglichen.
- Blockieren die Eierstöcke bei 10 % normalem Ziegenserum mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 für 30 Minuten.
- Inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht in 600 µL Primärantikörper Wahl verdünnt, um die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei 4 ° C.
- Spülen Sie die Eierstöcke drei Mal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100.
- Inkubieren Sie die Eierstöcke für 2 h in 600 µL Sekundärantikörper Wahl auf die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei Raumtemperatur verdünnt.
- Spülen Sie die Eierstöcke zweimal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 und einmal für 5 min in 1 X PBS.
5. zerlegen und montieren Pupal Eierstöcke
- Geben Sie einen kleinen Tropfen 1 X PBS auf einen Objektträger. Verwendung Zange übertragen der Abdominal-Plünderung von den Kammern Deckglas auf ein Glas gut gefüllt mit 1 X PBS. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.
- Zerreißen der Abdominal-Plünderung und alle restlichen Fett mit der Pinzette.
Hinweis: Die Eierstöcke, die ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen sind, sollten innerhalb des Brunnens sichtbar. Die Eierstöcke sind oft eng von den fetten Körper umgeben, so ist es wichtig, dass alle fetten Körper ist gründlich zerrissen auseinander. - Übertragen Sie die Eierstöcke aus dem Brunnen in den Tropfen 1 x PBS am Mikroskop schieben Sie durch das Zentrum der Eierstöcke zwischen den Spitzen der Zange greifen. Es ist sehr wichtig, einen festen Griff ohne zu quetschen die Eierstöcke zu verwenden, um nicht zu verlieren oder zerstören sie während der Übertragung. Fügen Sie ein paar Tropfen 1 X PBS zur Folie hinzu, wenn die Lösung im Laufe der Zeit austrocknet.
- Sobald alle Eierstöcke seziert und auf den Objektträger Pipettieren 40 µL Eindeckmedium auf einem Ort das Deckglas vorsichtig auf die Eierstöcke und 22 x 22 mm Deckglas übertragen wurden. Lassen Sie die Folie über Nacht trocknen vor der Bildgebung.
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Representative Results
Erfolgreiche Ausführung dieser Prozedur sollte führen klar Antikörper Färbung, die die Struktur und die zelluläre Organisation eine Drosophila pupal Eierstock offenbart. Immunohistochemistry dieses Protokolls lässt sich Zelltypen häufig gebeizt in Larven und Erwachsenen Eierstöcke zu identifizieren. Zellen des pupal Stiels abgeleitet Schwarm Zellen18 (beschrieben von Fasciclin III in weiß) sind in Abbildung 3dargestellt. Neben der Hervorhebung der zellulären Organisation pupal Eierstöcke, Antikörper Beflecken spezifisch für Zellproliferation (z. B. Phospho-Histon H3 Färbung in Abbildung 3, grün dargestellt) lässt sich Zellteilung Muster von Stammzellen und andere zu studieren mitotically aktiv Zelltypen. Wenn fluoreszierende Antikörper Signale schwach unter dem konfokalen Mikroskop untersucht sind, ist es wahrscheinlich, dass die Eierstöcke nicht ausreichend Antikörper aufgrund unzureichender fetten Körper Extraktion im pupal Abdomen ausgesetzt waren. Eine andere Möglichkeit ist, dass die pupal Sack Öffnung während der Färbung zusammengebrochen.
Abbildung 1: Side-by-Side-Vergleich der männlichen und weiblichen Larven. (A) männlichen Larve im PBS-Lösung identifiziert durch ein paar von durchscheinend, längliche Hoden befindet sich etwa zwei Drittel nach unten von seinem vorderen Ende. (B) weibliche Larve im PBS-Lösung, die durch das Fehlen von großen, durchscheinenden Hoden identifiziert. Skalieren von Balken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Präparation des pupal Eierstöcke nach Immunohistochemistry. (A) Bild von einem Paar gestreift, durchscheinenden pupal Eierstöcke (rote Kreise), die von der abdominalen Plünderung auf immunhistochemische Färbung entfernt wurden. Pupal Eierstöcke seziert wurden ca. 48 h APF. Die restlichen Fett Körperzellen (schwarzer Pfeil), die nicht im Schritt 3.6 extrahiert wurden sind im PBS-Lösung verteilt. (B) Bild von einer einzigen pupal Eierstock in PBS-Lösung seziert ca. 48 h APF. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: gebeizt Wildtyp pupal Eierstock seziert 48 Stunden APF. Bild wurde aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop. Der Wnt Signalweg Reporter, Fz3 RFP8 (rot), drückt sich in vorderen Körperzellen. Antikörper auf Fasciclin III (weiß) Umrisse Zellen des pupal Stiels gerichtet. Kerne wurden mit DAPI (blau) counterstained. Phospho-Histon H3 Färbung (grün) markiert Zellen in der Mitose. Diagonale weiße Linien kennzeichnen die Ränder des Originalbildes. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Der kritische und schwierige Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Vorbereitung der pupal Eierstöcke vor der Fixierung. Um sicherzustellen, dass die Eierstöcke, kleine und begraben durch Fett Körperzellen in den pupal Bauch ausreichend mit Antikörpern gefärbt sind, ist es wichtig, nicht nur eine große Öffnung in der abdominalen Plünderung mit der Pinzette zu reißen, sondern auch extrahieren die fetten Körperzellen, die behindern die Eierstöcke aus der Antikörper. Erfolgreiche Durchführung dieses Schritts erfordert die Anwendung von subtilen Druck auf der Pasteur Pipettieren Glühbirne beim Waschen der fetten Körper-Zellen aus der Abdominal-Plünderung (z. B. 1 – 2 Fett Körperzellen lassen den Bauch während dieser Schritt pro Sekunde). Sanfte Gewalt anzuwenden, wird wahrscheinlich die Eierstöcke aus dem Bauch und in das Glas gut verschütten fehlschlägt. Da die Eierstöcke selbst klein, lichtdurchlässig und schwer zu fassen Sie mit der Pinzette sind, müssen sie innerhalb der Abdominal-Plünderung während des gesamten Verfahrens Färbung bleiben. Also, wenn die Eierstöcke aus dem Bauch während der Vorbereitungsschritt vor Fixierung kommen, es wäre äußerst schwierig abzurufen, Fleck, und montieren sie in ihrer isolierten Form während des Protokolls.
Fetten Körperzellen, die in erster Linie aus Lipid Tröpfchen bestehen, sind Triglyceride Lagerung Organellen in Insekten, darunter Drosophila Melanogaster19,20häufig zu finden. Da einige Fett Körperzellen im pupal Abdomen bei Fixierung bleiben, nutzt dieses Protokoll relativ hohe Triton x-100-Konzentrationen in den ersten drei PBS Spülungen, möglichst viele Lipide aus sowohl die Cell membranes in den Eierstöcken und gebliebene Fett wie möglich zu extrahieren die Eierstöcke umgebende Gewebe. Wie der helle Fasciclin III Zelle Membrane Protein Antikörper Färbung in Abbildung 3, 1 X PBS mit 1 % Triton x-100 während der ersten drei Spülungen funktioniert gut, um maximal Lipide unter Beibehaltung der Integrität der Zelle extrahieren Membran.
Sobald der Körper Fett extrahiert wurde, ist die zweite wichtigste Schritt um sicherzustellen, dass die Eierstöcke innerhalb der Abdominal-Plünderung während der Fixierung und Färbung Antikörper bleiben. Es ist hilfreich, sie in eine klare, gekammerten Deckglas anstatt einem Microcentrifuge Schlauch für deutlichere Sichtbarkeit der pupal Abdomen während der Färbung zu platzieren. Verwenden Sie Zange, um die Abdominal-Säcke auf den Boden der Kammer schieben, so dass die Abdominal-Gewebe in der Plünderung in Antikörperlösung vollständig versenkt sind.
Zu guter Letzt sollte sehr darauf geachtet werden, die Eierstöcke während der Montage aus der Abdominal-Plünderung auf Objektträger übertragen. Obwohl die Eierstöcke sind klein und schwer zu fassen, ohne zu drücken sie mit der Pinzette, ist der beste Weg, um sie auf die Folie übertragen durch das Zentrum der Eierstöcke fest greifen. Sie werden strukturell intakt bleiben, einmal auf der Folie platziert. Es ist möglich, die Eierstöcke aus dem Bauch direkt auf den Objektträger zu verlieren die Eierstöcke zu sezieren, aber dies kann zu einem überhöhten Anfall Eindeckmedium auf der Folie und die Montage erschweren könnte.
Die Grenzen dieses Protokolls beinhalten die Menge an Zeit die gesamte Dissektion kann dauern, die potenziell geringe Ausbeute gut gefärbten Eierstöcke und die Geschicklichkeit erforderlich, um jeden Schritt erfolgreich abgeschlossen. Da die pupal Eierstöcke umfangreiche fetten Körper Extraktion erforderlich, kann Vorbereitung einer einzigen Puppe zur Fixierung von 10 bis 20 min dauern. Darüber hinaus um zu gewährleisten eine ausreichende Anzahl von Eierstöcken widerstehen die gesamte Färbeverfahren, es empfiehlt sich, weitere Puppen als nötig für das Experiment zu sezieren. Dies bedeutet, dass eine große Menge an Zeit aufgewendet werden kann einfach die Puppen noch vor der Fixierung Schritt vorbereiten.
Pupal Eierstock Sezierungen unterscheiden sich weitgehend von Protokollen für Larven14 und Erwachsene21 Eierstock Sezierungen. Die Ummantelung des Eierstocks innerhalb einer pupal Fall präsentiert einzigartige Herausforderungen, die von den Tools, die in diesem Protokoll verwendeten erfüllt sind. Diese Methoden können sein gilt für Linie Ablaufverfolgung Experimente zu bestimmen, wann FSCs Escort Zellen sind im Laufe der Zeit im pupal Eierstock angegeben. Eine modifizierte Version dieses Protokolls mit Insekt Zellkulturmedien könnte möglicherweise auch verwendet werden, um pupal Eierstöcke für ex-Vivo live-bildgebende Analyse zu sezieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (RO1 GM079351, DK). Wir danken für ihre hilfreichen Ratschläge auf pupal Eierstock Sezierungen basierend auf ihrem ursprünglichen Protokoll Dorothea Godt. Wir danken auch Amy Reilein für ihre Hilfe und Kommentare auf das Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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