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Developmental Biology

विच्छेदन और Drosophila Pupal अंडाशय के दाग

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56779
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Summary

Drosophila अंडाशय स्टेम सेल आला विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है । हालांकि लार्वा और वयस्क अंडाशय विदारक के लिए विधियां प्रकाशित किया गया है, pupal अंडाशय विच्छेदन विभिंन तकनीकों है कि विस्तार से प्रकाशित नहीं किया गया है की आवश्यकता है । यहां हम विच्छेदन, धुंधला, और बढ़ते pupal अंडाशय के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा ।

Abstract

वयस्क Drosophila अंडाशय के विपरीत, pupal अंडाशय का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल है और उनके छोटे आकार, translucence के कारण की जांच, और एक pupal मामले के भीतर डिब्बे । pupal अंडाशय विदारक की चुनौती भी pupa के भीतर अपने भौतिक स्थान में निहित है: अंडाशय pupal पेट के अंदर वसा शरीर की कोशिकाओं से घिरे हुए हैं, और इन वसा कोशिकाओं को उचित एंटीबॉडी धुंधला के लिए अनुमति हटा दिया जाना चाहिए । इन चुनौतियों से उबरने के लिए, इस प्रोटोकॉल pupal पेट से वसा शरीर की कोशिकाओं को निकालने के लिए अनुकूलित पाश्चर pipets का इस्तेमाल करता है । इसके अलावा, एक चैम्बर्ड coverglass धुंधला प्रक्रिया के दौरान एक microcentrifuge ट्यूब के स्थान पर प्यूपा की दृश्यता में सुधार करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इन और इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरणों के अंय लाभों के बावजूद, इन तकनीकों के सफल निष्पादन अभी भी pupal अंडाशय के छोटे आकार के कारण अभ्यास के कई दिनों में शामिल हो सकता है । इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीक समय पाठ्यक्रम प्रयोगों है जिसमें अंडाशय pupal विकास के विभिंन चरणों में विश्लेषण कर रहे है के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

स्टेम सेल Drosophila अंडाशय का उपयोग अनुसंधान व्यापक रूप से एक स्टेम सेल आला के पहले प्रलेखन के बाद से विस्तार किया गया है1,2,3,4। आनुवंशिक उपकरण पता लगाने वंश के विकास के बाद, Drosophila अंडाशय विच्छेदों सामांयतः स्टेम कोशिका वंश और संकेत रास्ते का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि स्टेम सेल के रखरखाव, प्रसार, और भाग्य स्टेम कोशिका आला में विनियमित । इन संकेतन रास्ते का ज्ञान ंयायपालिका स्टेम सेल गतिविधि5,6,7से उत्पंन कि कैंसर के संभावित कारणों में अंतर्दृष्टि उपज हो सकता है । यह भी हाल ही में दिखाया गया है कि Drosophila अंडाशय में दैहिक स्टेम कोशिकाओं, कूप स्टेम सेल (FSCs) के रूप में जाना, दृढ़ता से उनके संगठन के कई पहलुओं में स्तनधारी आंत्र स्टेम कोशिकाओं के समान8. इस कारण से, Drosophila अंडाशय स्टेम सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी मॉडल प्रणाली हैं ।

जबकि लार्वा और वयस्क अंडाशय आला में जल्दी स्टेम सेल विकास और अंतिम स्टेम सेल संगठन को सुराग प्रदान करते हैं, क्रमशः, pupal अंडाशय एक मध्यवर्ती संरचना है जिसमें germline और दैहिक कोशिकाओं को पुनर्गठित और उनकी पहचान की स्थापना 9 , 10. हालांकि कई अध्ययनों से pupal अंडाशय में ऊतक विकास के पहलुओं की जांच की है10,11,12,13, प्रश्न भेदभाव और स्थानिक संगठन के बारे में रहना pupal विकास के दौरान डिम्बग्रंथि कोशिका प्रकार के. विशेष रूप से, FSCs के विनिर्देशन इस अवधि के दौरान होता है । इस प्रोटोकॉल वांछित समय अंक पर विदारक और धुंधला pupal अंडाशय के लिए एक विधि रूपरेखा-एक तकनीक है कि समय पाठ्यक्रम प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता है कि लार्वा से वयस्क मंच के विस्तार में pupal अंडाशय विकास का विश्लेषण ।

छोटे आकार, translucence, और pupal पेट के भीतर pupal अंडाशय के अप्राप्यता के लिए खाते में, इस प्रोटोकॉल एक कस्टम बनाया पतली-इत्तला दे दी पाश्चर प्लास्टिक के लिए पेट वसा शरीर ऊतक निरोधक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए के रूप में उपकरण का उपयोग करता है अंडाशय. एक स्पष्ट, चैम्बर्ड coverglass एंटीबॉडी दाग के दौरान इस्तेमाल किया प्यूपा और एक "Nutator पर अंडाशय कमाल के लिए एक gentler मंच की अधिक से अधिक दृश्यता प्रदान करता है." Maimon और Gilboa द्वारा लार्वा अंडाशय विच्छेदों के लिए एक प्रोटोकॉल के आधार पर14, ट्राइटन X-१०० की एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता के लिए सेल झिल्ली permeabilization और एंटीबॉडी पहुंच को अधिकतम करने के लिए धुंधला प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों में नियोजित किया गया है डिंबग्रंथि कोशिकाओं ।

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Protocol

1. EggLaying

  1. लगभग दस पुरुष और पंद्रह महिला वयस्क सामांय अमीर मक्खी खमीर के साथ पूरक भोजन की एक शीशी में वांछित जीनोटाइप की Drosophila मक्खियों का मिश्रण । शीशी भीड़ से बचने के लिए, साथी महिलाओं की अनुमति के लिए नहीं अब से 2-4 ज14के लिए अंडे देना ।
  2. मक्खी के भोजन के साथ एक अलग शीशी के खिलाफ खोल शीशी को दोहन करके एक नई शीशी में से वयस्कों को शीशी में स्थानांतरित कर । अंडे को 3-4 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर लार्वा में विकसित करने दें ।

2. महिला लार्वा का चयन

  1. नरम bristles के साथ एक नम ठीक ब्रश का उपयोग करना, शीशी की दीवार के साथ ब्रश के साथ एक रोलिंग आंदोलन करने के लिए शीशी से तीसरे instar लार्वा एक गिलास अच्छी तरह से 1x फॉस्फेट के साथ सीमा को भर में भटक हस्तांतरण (पंजाब) । लार्वा से खाद्य मलबे को धो कर उंहें एक और अच्छी तरह 1x पंजाबियों से भरे हुए में स्थानांतरित कर रहे हैं ।
  2. संदंश का उपयोग कर पुरुष और मादा लार्वा को अलग करें । बड़े, गोल, और पारदर्शी शरीर के पार्श्व पक्ष पर वसा शरीर में एंबेडेड परीक्षण की एक जोड़ी द्वारा पुरुष लार्वा की पहचान लगभग दो तिहाई इसके पूर्वकाल अंत से नीचे15। मादा लार्वा औसत पर बड़े हैं, पुरुषों की तुलना में कम पारदर्शी, और अधिक छोटे gonads है कि और अधिक मुश्किल का पता लगाने के लिए कर रहे हैं ।
  3. मादा लार्वा एकत्रित करने के लिए पुरुष लार्वा के विरुद्ध चयन करें । अच्छी तरह से दस से कम महिलाओं को इकट्ठा । 1x पंजाबियों के साथ एक अलग अच्छी तरह से भर में मादा लार्वा प्लेस ।
  4. संदंश का प्रयोग करें महिला लार्वा धीरे ताजा मक्खी खमीर के साथ पूरक भोजन की एक नई शीशी में स्थानांतरित करने के लिए ।
  5. शीशी को एक अंधेरी स्थान में मादा लार्वा के साथ pupariation16की सुविधा के लिए रखें । दिन भर में pupariation के लिए लार्वा की निगरानी करते हैं । प्रत्येक लार्वा मैटीरियल के रूप में और एक prepupa में विकसित, शीशी के खिलाफ prepupa चक्र और अनुमानित समय रिकॉर्ड जब यह पहली बार एक prepupa में रूपों । पूर्वकाल spiracles और puparium गठन17के समय की दखलंदाजी से prepupae की पहचान करें । prepupae वांछित समय बिंदु को विकसित करने की अनुमति दें (puparium गठन के बाद घंटे में मापा, APF).
    नोट: किसी भी जानवर है कि एक लगभग 10 एच अंतराल के भीतर puparium गठन से गुजरना एक prepupa माना जा सकता है । pupal चरण लगभग 12 ज puparium गठन के बाद एक आंतरिक गलते जगह ले ली है के बाद शुरू होता है ।

3. एंटीबॉडी धुंधलाने के लिए प्यूपा की तैयारी

  1. pupal वसा शरीर बाहर समाशोधन के लिए बाद में चरणों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक पतली गिलास प्लास्टिक फार्म ।
    1. एक Bunsen बर्नर पर एक पाश्चर प्लास्टिक के गिलास टिप पिघला । के रूप में गिलास पिघला देता है, संदंश का उपयोग करने के लिए एक पतली टिप फार्म के लिए प्लास्टिक के बाकी हिस्सों से दूर क्षैतिज टिप खींचने के लिए ।
    2. ठंडा करने के बाद, प्लास्टिक टिप का एक छोटा सा हिस्सा तोड़ एक साफ परिपत्र खोलने के लिए फार्म । प्लास्टिक के दूसरे छोर पर एक बल्ब लगायेंगे ।
    3. 1x पंजाबियों के साथ प्लास्टिक लोड ।
  2. प्यूपा, जो शीशी की दीवार से चिपके हुए हैं फसल के लिए, pupa और शीशी के बीच संपर्क क्षेत्र के साथ पानी की एक छोटी सी बूंद लागू होते हैं । एक नम ठीक ब्रश के साथ दीवार से धीरे pupa उठाने से पहले प्रोटीन गोंद भंग जाने के लिए 1-2 मिनट रुको । pupa एक गिलास अच्छी तरह से 1x पंजाबियों से भरा स्थानांतरण । अच्छी तरह से भीड़ से बचने के लिए pupa प्रति एक भी अच्छी तरह से समर्पित करें ।
  3. जबकि संदंश की एक जोड़ी के साथ pupa के पीछे अंत लोभी, ध्यान से एक और जोड़ी के साथ pupal मामले के पूर्वकाल भाग आंसू जब तक pupa के सिर दिखाई है ।
  4. पकड़ पूर्वकाल-संदंश के साथ pupal सिर के सबसे टिप और धीरे pupa अपने pupal मामले से बाहर खींच ।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान वसा शरीर का एक भाग बाहर गिर सकता है ।
  5. अलग और पीछे आधा से pupa के पूर्वकाल आधा त्यागें केवल उदर बोरी रहता है जब तक ।
  6. पेट की बोरी से वसा शरीर की कोशिकाओं को निकालने ।
    1. एक हाथ में संदंश के साथ अच्छी तरह से नीचे के खिलाफ पेट की बोरी पकड़ जबकि एक और हाथ में 1x पंजाबियों से भरा पतली गिलास प्लास्टिक पकड़े ।
    2. बोरी के उद्घाटन की ओर पतली प्लास्टिक टिप उद्देश्य और धीरे पेट में प्लास्टिक 1x पंजाबियों को दूर pupal अंडाशय के आसपास वसा शरीर की कोशिकाओं को धोने ।
      नोट: अंडाशय छोटे, पारदर्शी, धारीदार, और आयताकार संरचनाओं कि उदर की बोरी के अंदर रहना चाहिए की एक जोड़ी हैं ।
    3. दूर वसा शरीर की कोशिकाओं को धो जब तक वसा शरीर के कम से दो तिहाई चला गया है या जब तक अंडाशय उदर की बोरी के उद्घाटन के पास दिखाई दे रहे हैं । इस कदम को धीरे से अंजाम देना बहुत जरूरी है ताकि अंडाशय को दुर्घटना से पेट से बाहर न धोएं ।
  7. जांच अच्छी तरह से जांच करने के लिए अगर अंडाशय वसा शरीर सेल धोने के दौरान बाहर गिरा दिया है । अगर अंडाशय कुआं के अंदर नहीं दिख रहे हैं तो उन्हें पेट में बने रहना चाहिए । यदि अंडाशय बाहर आ गए हों तो एक नए pupa को कुआं में रखें और इस चरण को दोहराएं ।
  8. एक स्पष्ट coverglass निर्धारण बफर (1x पंजाब, 4% paraformaldehyde) से भरा कक्ष में पेट हस्तांतरण और शीर्ष पर ढक्कन जगह है । अंडाशय धुंधला और बढ़ते प्रक्रिया को झेलने के लिए पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करने के लिए, जरूरत से ज्यादा अंडाशय काटना ।
    सावधानी: निर्धारण बफर paraformaldehyde जो विषाक्त है शामिल हैं । कृपया दस्ताने, सुरक्षा चश्मे, आदिके रूप में उचित सुरक्षा पहनते हैं ।

4. Immunohistochemistry

  1. धुंधला प्रक्रिया के दौरान, संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे से कवर गिलास के नीचे करने के लिए किसी भी अस्थाई अंडाशय धक्का अच्छी तरह से सुनिश्चित करें कि अंडाशय पूरी तरह से एंटीबॉडी समाधान में डूबे हुए हैं ।
  2. एक Nutator की सपाट सतह पर डबल पक्षीय टेप की जगह स्ट्रिप्स और फिर चिपकने वाली सतह पर चैम्बर्ड coverglass जगह है ।
  3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ३.७ कदम से निर्धारण बफर में अंडाशय की मशीन ।
  4. अंडाशय कुल्ला 1% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ 1x पंजाब में तीन बार 5, 10, और ४५ मिनट (कुल में 1 एच) के लिए, क्रमशः, पूरी तरह से permeabilization की अनुमति देने के लिए ।
  5. 30 मिनट के लिए ०.५% ट्राइटन X-१०० के साथ 1x पंजाब में 10% सामांय बकरी सीरम में अंडाशय ब्लॉक ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ 1x पंजाब में उपयुक्त एकाग्रता को पतला पसंद की प्राथमिक एंटीबॉडी के ६०० µ एल में रातोंरात अंडाशय मशीन ।
  7. अंडाशय ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ 1x पंजाब में 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला ।
  8. ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ कमरे के तापमान पर 1x पंजाब में उचित एकाग्रता को पतला पसंद की माध्यमिक एंटीबॉडी के ६०० µ एल में 2 एच के लिए अंडाशय की मशीन ।
  9. ०.५% ट्राइटन एक्स-१०० और एक बार 1x पंजाब में 5 मिनट के लिए के साथ 1x पंजाब में 5 मिनट के लिए दो बार अंडाशय कुल्ला ।

5. विदारक और बढ़ते Pupal अंडाशय

  1. एक खुर्दबीन स्लाइड पर 1x पंजाबियों की एक छोटी सी बूंद प्लेस । संदंश का उपयोग करने के लिए चैंबर्ड coverglass से पेट की बोरी एक अच्छी तरह से 1x पंजाबियों से भरा गिलास हस्तांतरण । अच्छी तरह से भीड़ से बचने के लिए pupa प्रति एक भी अच्छी तरह से समर्पित करें ।
  2. पेट की बोरी और संदंश के साथ किसी भी शेष वसा शरीर के अलावा आंसू ।
    नोट: अंडाशय, जो छोटे, पारदर्शी, धारीदार, और आयताकार संरचनाओं की एक जोड़ी हैं, अच्छी तरह से अंदर दिखाई जानी चाहिए । अंडाशय अक्सर कसकर वसा शरीर से घिरा हुआ है, तो यह सुनिश्चित करें कि सभी वसा शरीर अच्छी तरह से अलग फाड़ा है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. संदंश के सुझावों के बीच अंडाशय के केंद्र लोभी द्वारा माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 1x पंजाबियों के ड्रॉप में अच्छी तरह से अंडाशय स्थानांतरण । यह बहुत महत्वपूर्ण है अंडाशय निचोड़ के बिना एक फर्म पकड़ का उपयोग करें ताकि खोने के लिए या उंहें हस्तांतरण के दौरान नष्ट नहीं । समय के साथ समाधान सूख जाता है जब स्लाइड करने के लिए 1x पंजाबियों की कुछ बूंदें जोड़ें ।
  4. एक बार सभी अंडाशय और विच्छेदित किया गया है माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए स्थानांतरित, प्लास्टिक ४० µ एल बढ़ते मध्यम के एक 22 मिमी x 22 मिमी coverslip पर और coverslip धीरे अंडाशय के शीर्ष पर जगह है । स्लाइड को इमेजिंग से पहले रात भर सूखने दें ।

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Representative Results

इस प्रक्रिया के सफल निष्पादन स्पष्ट एंटीबॉडी धुंधला है कि संरचना और एक Drosophila pupal अंडाशय के सेलुलर संगठन का पता चलता में परिणाम चाहिए । Immunohistochemistry इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित आमतौर पर लार्वा और वयस्क अंडाशय में दाग कोशिका प्रकार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । pupal झुंड कोशिकाओं18 (सफेद में Fasciclin III द्वारा उल्लिखित) से व्युत्पंन डंठल की कोशिकाओं चित्रा 3में दिखाया गया है । pupal अंडाशय के सेलुलर संगठन पर प्रकाश डाला के अलावा, एंटीबॉडी सेल प्रसार के लिए विशिष्ट धुंधला (जैसे phospho-हिस्टोन H3 में धुंधला हो जाना चित्रा 3, हरे रंग में दिखाया गया है) स्टेम कोशिकाओं और अन्य के सेल डिवीजन पैटर्न का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता mitotically सक्रिय कक्ष प्रकार । यदि फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी संकेत कमजोर है जब एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत जांच की, यह संभव है कि अंडाशय पर्याप्त pupal पेट में अपर्याप्त वसा शरीर निष्कर्षण के कारण एंटीबॉडी को उजागर नहीं किया गया है । एक और संभावना है कि pupal बोरी खोलने धुंधला के दौरान ढह हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: पुरुष बनाम महिला लार्वा की तुलना के साथ-साथ साइड । (क) पंजाब के समाधान में पुरुष लार्वा पारदर्शी, आयताकार परीक्षण की एक जोड़ी द्वारा की पहचान लगभग दो तिहाई अपने पूर्वकाल अंत से नीचे स्थित है । (ख) पंजाब में महिला लार्वा समाधान बड़े, पारदर्शी परीक्षण के अभाव की पहचान की । स्केल बार्स = 2mm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: immunohistochemistry के बाद pupal अंडाशय के विच्छेदन. धारीदार, पारदर्शी pupal अंडाशय (लाल हलकों) है कि immunohistochemistry धुंधला पर पेट की बोरी से हटा दिया गया है की एक जोड़ी की छवि (क) । Pupal अंडाशय लगभग ४८ ज APF को विच्छेदित किया गया । शेष वसा शरीर कोशिकाओं (काला तीर) है कि कदम ३.६ में नहीं निकाला गया है पंजाबियों समाधान में फैलाया जाता है । (ख) पंजाब के समाधान में एक एकल pupal अंडाशय की छवि विदारक लगभग ४८ ज APF । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सना हुआ जंगली-प्रकार pupal अंडाशय ४८ घंटे APF । छवि एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । Wnt मार्ग संवाददाता, Fz3 आरएफपी8 (लाल), पूर्वकाल दैहिक कोशिकाओं में व्यक्त की है । एंटीबॉडी Fasciclin III के लिए निर्देशित (सफेद) pupal डंठल के कोशिकाओं की रूपरेखा । नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained थे । Phospho-हिस्टोन H3 धुंधला (हरा) बँटवारा के दौर से गुजरने वाली कोशिकाओं पर प्रकाश डाला गया. विकर्ण सफ़ेद रेखाएं मूल छवि के किनारों को इंगित करती हैं । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल की सबसे महत्वपूर्ण और कठिन कदम निर्धारण करने से पहले pupal अंडाशय की तैयारी शामिल है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडाशय, छोटे और pupal पेट के अंदर वसा शरीर कोशिकाओं द्वारा दफन, एंटीबॉडी के साथ पर्याप्त रूप से दाग रहे हैं, यह न केवल संदंश के साथ पेट की बोरी में एक बड़ी खोलने आंसू करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी बाधा वसा शरीर कोशिकाओं है कि निकालने एंटीबॉडी से अंडाशय । इस चरण के सफल निष्पादन पाश्चर प्लास्टिक बल्ब पर सूक्ष्म दबाव के आवेदन की आवश्यकता है, जबकि पेट की बोरी से बाहर वसा शरीर की कोशिकाओं को धोने (उदा 1 – 2 वसा शरीर कोशिकाओं पेट प्रति सेकंड इस कदम के दौरान छोड़ देना चाहिए). कोमल बल का उपयोग करने के लिए विफलता की संभावना अंडाशय पेट से बाहर फैल करने के लिए और गिलास में अच्छी तरह से होगा । क्योंकि खुद के द्वारा अंडाशय छोटे, पारदर्शी हैं, और संदंश के साथ काबू करने के लिए मुश्किल है, वे पूरे धुंधला प्रक्रिया भर में उदर की बोरी के भीतर रहना चाहिए. इस प्रकार, यदि अंडाशय पेट से बाहर की तैयारी कदम निर्धारण करने से पहले के दौरान आते हैं, यह बहुत मुश्किल होगा पुनः प्राप्त करने के लिए, दाग, और उंहें अपने पृथक रूप में प्रोटोकॉल के दौरान माउंट ।

वसा शरीर की कोशिकाओं, जो मुख्य रूप से लिपिड बूंदों से मिलकर बनता है ट्राइग्लिसराइड का भंडारण आमतौर पर कीड़े में पाया organelles, Drosophila melanogaster19,20सहित । कुछ वसा शरीर की कोशिकाओं को निर्धारण में pupal पेट में रहने के बाद से, इस प्रोटोकॉल पहले तीन पंजाबियों में अपेक्षाकृत उच्च ट्राइटन X-१०० सांद्रता का उपयोग करता है अंडाशय में दोनों कोशिका झिल्ली से संभव के रूप में कई लिपिड के रूप में निकालने के लिए कुल्ला और किसी भी बचे हुए फैटी अंडाशय आसपास के ऊतकों । के रूप में उज्ज्वल Fasciclin III कोशिका झिल्ली प्रोटीन एंटीबॉडी चित्रा 3में धुंधला के द्वारा प्रदर्शन किया, 1% ट्राइटन एक्स के साथ 1x पंजाबियों का उपयोग करते हुए पहले तीन कुल्ला के दौरान १०० अच्छी तरह से काम करता है के लिए अधिक से अधिक लिपिड निकालने जबकि अभी भी सेल की अखंडता को बनाए रखने झिल्ली.

एक बार वसा शरीर को निकाल दिया गया है, दूसरा सबसे महत्वपूर्ण कदम के लिए सुनिश्चित करें कि अंडाशय पेट की बोरी के भीतर निर्धारण और एंटीबॉडी धुंधला भर में रहने के लिए है । यह उंहें एक स्पष्ट, चैम्बर्ड coverglass के बजाय pupal पेट की स्पष्ट दृश्यता के लिए दाग के दौरान एक microcentrifuge ट्यूब के अंदर जगह मददगार है । संदंश का प्रयोग धीरे पेट के बोरे को चैंबर के नीचे धकेलने के लिए करें ताकि बोरी में उदर के ऊतकों एंटीबॉडी समाधान में पूरी तरह से छा जाएं ।

अंत में, महान देखभाल बढ़ते प्रक्रिया के दौरान पेट की बोरी से माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए अंडाशय हस्तांतरण करने के लिए लिया जाना चाहिए । हालांकि अंडाशय छोटे और मुश्किल उंहें चुटकी के बिना संदंश के साथ समझ रहे हैं, उंहें स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण का सबसे अच्छा तरीका दृढ़ता से अंडाशय के केंद्र लोभी द्वारा है । वे एक बार स्लाइड पर रखा संरचनात्मक रूप से बरकरार रहेगा । अंडाशय खोने से बचने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड के शीर्ष पर सीधे पेट से अंडाशय काटना करने के लिए संभव है, लेकिन इस स्लाइड पर मध्यम बढ़ते की एक अत्यधिक राशि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और बढ़ते प्रक्रिया जटिल हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं समय पूरे विच्छेदन प्रक्रिया ले सकता है की मात्रा शामिल, अच्छी तरह से दाग अंडाशय के संभावित कम उपज, और निपुणता को सफलतापूर्वक हर कदम पूरा करने की जरूरत है । क्योंकि pupal अंडाशय व्यापक वसा शरीर निष्कर्षण की आवश्यकता होती है, निर्धारण के लिए एक एकल pupa की तैयारी कहीं भी 10 से 20 मिनट लग सकते हैं । इसके अलावा, अंडाशय की एक पर्याप्त संख्या को सुनिश्चित करने के लिए पूरे धुंधला प्रक्रिया का सामना, यह सबसे अच्छा है प्रयोग के लिए जरूरत से ज्यादा प्यूपा काटना । इसका मतलब यह है कि समय की एक बड़ी राशि बस प्यूपा भी निर्धारण कदम से पहले की तैयारी पर खर्च किया जा सकता है ।

Pupal अंडाशय विच्छेदन लार्वा14 और वयस्क21 अंडाशय विच्छेदों के लिए प्रोटोकॉल से काफी अलग है । एक pupal मामले के भीतर अंडाशय के encasement अद्वितीय चुनौतियों है कि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया उपकरणों से मुलाकात कर रहे है प्रस्तुत करता है । इन विधियों FSCs और अनुरक्षण कोशिकाओं समय के साथ pupal अंडाशय में निर्दिष्ट कर रहे हैं, जब यह निर्धारित करने के लिए वंश अनुरेखण प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है । इस कीट सेल संस्कृति मीडिया को शामिल प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण भी संभावित पूर्व vivo लाइव इमेजिंग विश्लेषण के लिए pupal अंडाशय काटना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हित की घोषणा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (RO1 GM079351 to डी.) ने समर्थन दिया था. हम उसके मूल प्रोटोकॉल के आधार पर pupal अंडाशय विच्छेदन पर उसे उपयोगी सलाह के लिए Dorothea Godt धन्यवाद । हम भी उसकी सहायता और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए एमी Reilein धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Forceps, biology Fine Scientific Tools 11252-20
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155383
Dissection microscope Nikon SMZ-10A
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Analysis software Carl Zeiss Zen
9 Depression Glass Spot Plates Pyrex 7220-85
Pasteur pipet Fisher Scientific 13-678-6B
Pasteur pipet bulb Various vendors
Bunsen burner Various vendors
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 12-544-2
22 x 22 mm glass coverslips No 1 VWR 48366-067
Dapi Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Double-sided tape Scotch
Nutator Clay Adams
Fine brush #0, #3-#5 Various vendors
Gilson Pipetman Starter Kit Thomas Scientific F167300 Contains p20, p200, p1000 pipettors
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS
Triton Sigma-Aldrich 9002-93-1
10x PBS Ambion AM9624 Dilute to 1x PBS
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 5000121 Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Fly vials Denville Scientific V9406
Cotton Balls, For Wide Vials Genesee Scientific 51-102W
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 101400
Fly food Produced in laboratory Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) Bloomington Drosophila Stock Center

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
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विच्छेदन और <em>Drosophila </em>Pupal अंडाशय के दाग
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Park, K. S., Godt, D., Kalderon, D.… More

Park, K. S., Godt, D., Kalderon, D. Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries. J. Vis. Exp. (133), e56779, doi:10.3791/56779 (2018).

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