Summary
Дрозофилы яичника является система отличная модель для изучения развития ниши стволовых клеток. Хотя методы для рассечения личинок и взрослых яичники были опубликованы, куколки завязи Анатомирование требуют разных методов, которые не были опубликованы в деталях. Здесь мы приводим протокол для рассечения, окрашивание и монтаж куколки яичников.
Abstract
В отличие от взрослых дрозофилы яичников, куколки яичников являются довольно трудно получить доступ и изучения из-за их малого размера, прозрачность и обшивка внутри куколки дело. Задача рассекает куколки яичников также лежит в их физическое местоположение в пределах куколки: яичников окружены жира тела клетки внутри куколки живота, и эти жировые клетки должны быть удалены для надлежащего антитело пятная. Для преодоления этих проблем, этот протокол использует настроенные Пастер пипец извлечь жир тела клетки из куколки живота. Кроме того камерные coverglass используется вместо пробки microcentrifuge во время процесса окрашивания для улучшения видимости куколок. Однако несмотря на эти и другие преимущества инструменты, используемые в настоящем Протоколе, успешное выполнение этих методов по-прежнему может включать несколько дней практики из-за небольшого размера куколки яичников. Методы, изложенные в настоящем Протоколе может применяться к времени курс эксперименты, в которых анализируются яичников на различных стадиях развития куколки.
Introduction
Исследования стволовых клеток с использованием дрозофилы яичников широко расширилась с момента первого документации3,2,1,ниши стволовых клеток4. После разработки происхождение генетических средств трассировки, дрозофилы яичника, Анатомирование широко использовались для изучения линий стволовых клеток и сигнальные пути, которые регулируют содержание стволовых клеток, распространение и судьба в нише стволовых клеток. Знание этих сигнальных путей может дать понимание потенциальных причин рака, которые исходят из ошибочной стволовых клеток активности5,6,7. Кроме того, недавно было показано, что соматических стволовых клеток в яичниках дрозофилы , известный как фолликула стволовые клетки (FSCs), сильно напоминают кишечных стволовых клеток млекопитающих во многих аспектах их организации8. По этой причине яичники дрозофилы являются систему весьма полезной моделью для изучения поведения стволовых клеток.
Хотя личинок и взрослых яичников предлагают ключи для раннего развития стволовых клеток и организации окончательный стволовых клеток в нише, соответственно, куколки яичника является промежуточная структура, в которой микрофлорой и соматические клетки реорганизовать и установить их личность 9 , 10. Хотя ряд исследований рассматривали аспекты развития тканей в куколки завязи10,11,12,13, остаются вопросы относительно дифференциации и пространственной организации типов клеток яичников во время развития куколки. В частности спецификации FSCs происходит в этот период. Этот протокол описывает метод для рассечения и пятнать куколки яичников в нужное время точках — метод, который может использоваться в времени курс экспериментов, которые анализируют развития куколки завязи в деталях от личинки до стадии взрослого.
С учетом небольшого размера, прозрачность и недоступность куколки завязи внутри куколки живота, этот протокол использует инструменты, такие как заказ тонким наконечником Pasteur накапайте для удаления тканей брюшной жир тела, препятствуя антитела доступ к яичники. Ясно, камерные coverglass, используемый в ходе антитело пятная предлагает большую видимость куколок и мягче платформы для качания яичников на «Nutator». Основываясь на протокол для личинок завязи Анатомирование Маймон и Гильбоа14, относительно высокая концентрация X-100 Тритон был нанят на начальных этапах пятная процедуру максимально клеточной мембраны permeabilization и антитела доступ к яичников клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. типографа
- Объединить приблизительно десять мужчин и пятнадцать женщин взрослых мух дрозофилы желаемого генотипа в пузырек нормальной богатую пищу летать с дрожжей. Чтобы избежать переполненности флакона, позволяют растяжением самки откладывают яйца для не более чем на 2 – 4 ч14.
- Перевести взрослых из флакона в новый флакон, нажав флакон, открытие против различных флакон с лету пищей. Разрешить яйца, чтобы развиться в личинки при комнатной температуре 3 – 4 дней.
2. Выбор женских личинки
- Использование влажной тонкой кистью с мягкой щетиной, сделайте подвижного движения кистью вдоль стены флакона для передачи блуждающих третьего возраста личинок из флакона на стакан, хорошо заполнены до краев с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Вымойте остатки пищи у личинки путем передачи их другому хорошо заполнены с ПБС.
- Отдельные мужские и женские личинки, с помощью щипцов. Идентифицировать мужской личинки пару большие, круглые и полупрозрачные яичек, встроенных в тело жира на боковой стороне тела примерно две трети вниз с его передней конец15. Женщины личинки больше, в среднем, менее полупрозрачный, чем мужчины и имеют гораздо меньше гонад, которые более трудно обнаружить.
- Выберите против мужчин личинками для сбора женщин личинки. Соберите по меньшей мере десять женщин из колодца. Место женщины личинок в отдельном хорошо заполнены с ПБС.
- Использовать щипцы для передачи женского личинки мягко в новый флакон свежих продуктов, летать дополнена дрожжей.
- Место флакона с женской личинок в темном месте для облегчения pupariation16. В течение дня контролировать личинок для pupariation. Как каждая личинка обездвиживает и превращается в prepupa, круг prepupa против флакона и записывать приблизительное время, когда он впервые образует в prepupa. Определите prepupae выпячивание передней дыхальца и сроках формирования puparium17. Разрешить prepupae развивать до желаемого времени точки (измеряется в часах после формирования puparium, АТФ).
Примечание: Любое животное, которое проходят puparium формирование в течение примерно 10 часов интервал может считаться prepupa. Стадия куколки начинается около 12 ч после формирования puparium после того, как внутренние линьки имело место.
3. Подготовка куколок для пятнать антитела
-
Формируют тонкой стеклянной пипетки для использования в последующих шагах для очистки из куколки жира тела.
- Расплавьте кончик стекла Pasteur накапайте над помощью горелки Бунзена. Как стекло плавится, используйте щипцами вытащить кончик горизонтально от остальной части пипетки сформировать кончик тоньше.
- После охлаждения, разорвать небольшую часть кончика пипетки в форме аккуратные круглое отверстие. Прикрепите шарик к другому концу пипетки.
- Загрузите пипетки с ПБС.
- Урожай куколок, которые приклеиваются к стенке флакона, нанесите небольшое падение воды вдоль контактной зоны между куколки и флакона. Подождите 1 – 2 мин, чтобы белок клей растворяют до нежно подъема куколки от стены с влажной тонкой кистью. Передача куколка на стакан хорошо заполнены с ПБС. Посвятите один колодец в куколки чтобы избежать переполненности хорошо.
- Защелки заднего конца куколки с одной парой щипцов, тщательно слезу передней части корпуса куколки с другой парой до тех пор, пока руководитель куколки является видимым.
- Ручка передней большинстве кончик куколки головы с щипцами и осторожно потяните куколки куколки дела.
Примечание: Часть жира тела могут проливаться во время этого процесса. - Отдельные и отбросить в передней половине куколки от задней половины до тех пор, пока остается только брюшной мешок.
-
Извлечь клетки тела жира из живота мешок.
- Возьмите брюшной мешок против нижней части скважины с щипцами в одной руке держа тонкой стеклянной пипетки, заполнены с ПБС в другой руке.
- Цель кончик тонкой накапайте к открытию мешок и медленно накапайте ПБС в брюшную полость, чтобы смыть жир тела клетки, окружающие куколки яичников.
Примечание: Яичников являются пары небольших, полупрозрачный, полосатая и продолговатых структур, которые должны оставаться внутри брюшной мешок. - Смыть что жир тела клетки до тех пор, пока по крайней мере две трети тела жир ушел, или до тех пор, пока яичников видны вблизи открытия брюшной мешок. Очень важно выполнять этот шаг медленно чтобы не мыть в яичниках из живота случайно.
- Изучите и проверить, если яичники вылилось во время мытья клетки жира тела. Если не яичников видны внутри колодец, они должны остались в животе. Если яичники вышли, поместите новые куколки в колодец и повторите этот шаг.
- Передача живота в камеру ясно coverglass, заполнены с фиксации буфера (ПБС, параформальдегида 4%) и поместите крышку на вершине. Чтобы обеспечить достаточное количество яичников выдерживать окрашивание и процесс установки, вскрыть яичников более чем необходимо.
Предупреждение: Фиксация буфер содержит параформальдегида, который является токсичным. Пожалуйста, носите соответствующую защиту как перчатки, защитные очки, и т.д.
4. иммуногистохимии
- На протяжении всего процесса окрашивания используйте корнцанг осторожно надавите любой плавающей яичников в нижней части стекла крышка колодца для обеспечения что яичников полностью погружен в раствор антител.
- Место полосы двухсторонней ленты на плоской поверхности Nutator и затем поместить патрон coverglass на клейкую поверхность.
- Инкубируйте яичников в фиксации буфера из шага 3.7 15 мин при комнатной температуре.
- Промойте яичников три раза в однократном ПБС с 1% тритон X-100 для 5, 10 и 45 мин (1 час в общей сложности), соответственно, чтобы позволить тщательно permeabilization.
- Блокировать яичников в 10% нормальной козьего сыворотки в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 на 30 мин.
- Инкубировать яичников на ночь в 600 мкл основное антитело выбора разбавляют до соответствующей концентрации в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 на 4 ° C.
- Промойте яичников три раза за 5 мин в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100.
- Инкубируйте завязи по 2 ч в 600 мкл вторичное антитело выбора разбавляют до соответствующей концентрации в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 при комнатной температуре.
- Промывайте яичников дважды за 5 мин в однократном ПБС с 0,5% Тритон X-100 и один раз в течение 5 мин в однократном ПБС.
5. разбор и монтаж куколки яичников
- Место небольшой капли 1 x PBS на слайд микроскопа. Используйте щипцы передать брюшной мешок от камерных coverglass стакан хорошо заполнены с ПБС. Посвятите один колодец в куколки чтобы избежать переполненности хорошо.
- Разорвать брюшной мешок и любые оставшиеся тела жира с щипцами.
Примечание: Функции яичников, которые являются пары небольших, полупрозрачный, полосатая и продолговатых структур, должны быть видны внутри колодца. Яичников часто плотно окружены жир тела, поэтому очень важно, чтобы убедиться, все тело жира тщательно войной друг от друга. - Перенесите яичников из колодца в каплю 1 x PBS на микроскопе слайд, схватив в центре яичников между советы щипцы. Это очень важно использовать крепко без сжатия яичников так, чтобы не потерять или уничтожить их во время передачи. Добавьте несколько капель 1 x PBS на слайд, когда раствор высыхает с течением времени.
- После того, как все яичники были расчленены и переданы микроскопа, накапайте 40 мкл монтажа среды на coverslip 22 x 22 мм и место coverslip нежно поверх яичников. Пусть сухой ночлег слайд до изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное выполнение этой процедуры должно привести к Пятнать антитела ясно, которая показывает структуру и клеточной организации дрозофилы куколки яичников. Иммуногистохимии, изложенные в настоящем Протоколе может использоваться для идентификации типов клеток, широко окрашенных в яичниках личинок и взрослых. Клетки производным от куколки плодоножки Рой клетки,18 (предложенный Fasciclin III в белом) показанный на рисунке 3. Помимо выделения клеточной организации куколки яичников, антитело пятная для пролиферации клеток (например, фосфо гистонов H3 окрашивание в рисунке 3показано зеленым) может использоваться для изучения структуры клеточного деления стволовых клеток и других mitotically активная ячейка типы. Если сигналы флуоресцентные антитела являются слабыми при рассмотрении конфокального микроскопа, вполне вероятно, что яичники не подвергались достаточно антител из-за недостаточной тела жира добычи в куколки живота. Другая возможность, возможно, что открытие куколки мешок рухнул во время окрашивания.
Рисунок 1: бок о бок сравнение мужчины против женщин личинок. (A) мужской личинка в PBS решения выявленных парой полупрозрачные, продолговатых яичек расположен примерно две трети вниз от переднего конца. (B) женский личинка в растворе PBS, идентифицируются отсутствием крупных, полупрозрачный яичек. Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: рассечение куколки яичников после иммуногистохимия. (A) изображение пары полосатый, полупрозрачный куколки яичников (красные круги) которые были удалены из брюшной мешок после окрашивания иммуногистохимия. Куколки яичники были расчленены примерно 48 h НФА. Оставшиеся клетки тела жира (черная стрелка), которые не были извлечены в шаге 3.6 рассредоточены в растворе PBS. (B) изображение одного яичника куколки в растворе PBS расчлененный примерно 48 h НФА. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: окрашенных одичал тип куколки завязи расчлененный 48 часов НФА. Снимок сделан с помощью конфокального микроскопа. Репортер путь Wnt, ППП Fz38 (красный), выражается в передней соматических клеток. Антитела направлены на Fasciclin III (белый) контуры клеток куколки плодоножки. Ядра были counterstained с DAPI (синий). Фосфо гистонов H3 окрашивание (зеленый) выделяет клетки проходят митоз. Диагональ белые линии указывают края исходного изображения. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее критический и сложный шаг этот протокол включает подготовку куколки яичников до фиксации. Чтобы гарантировать, что яичники, малые и похороненный жира тела клетки внутри куколки живота, являются достаточно витражи с антителами, важно не только сорвать большое отверстие в брюшной мешок с щипцами, но также извлечь жир тела клетки, которые препятствуют Яичники от антител. Успешное выполнение этого шага требует применения тонких давления на лампу пипетки Пастера во время мытья клетки тела жира из живота мешок (например 1 – 2 клетки тела жира должен оставить живота в секунду во время этого шага). Неспособность использовать нежный силы, скорее всего, вызовет яичников для разлива из живота и в стакан хорошо. Потому что яичников сами по себе являются небольшими, полупрозрачные и трудно понять с щипцами, они должны оставаться в пределах брюшной мешок на протяжении всей процедуры окрашивания. Таким образом если яичники вышли из живота до фиксации на этапе подготовки, было бы чрезвычайно трудно получить, пятна и смонтировать их в их изолированной форме во время протокола.
Жир тела клетки, которые главным образом состоят из капелек липидов, являются органеллы триглицеридов хранения, обычно встречаются в насекомых, в том числе Drosophila melanogaster19,20. Поскольку некоторые жир тела клетки остаются в куколки живот на фиксации, этот протокол использует относительно высокие концентрации Тритон X-100 в первых трех PBS полоскания добывать столько липиды как можно дальше от обоих cell membranes в яичнике и любые остатки жирных ткани, окружающие яичников. Как свидетельствуют яркие Fasciclin III клеточной мембраны протеина антитела пятнать в рисунке 3, используя ПБС с 1% тритон X-100 во время первых трех полоскания хорошо работает, чтобы максимально извлекать липидов при сохранении целостности ячейки мембрана.
После извлечения жира тела второй наиболее важный шаг, чтобы убедиться, что яичники остаются в пределах брюшной мешок на протяжении фиксации и Пятнать антитела. Полезно разместить их внутри ясно, камерные coverglass вместо пробки microcentrifuge четкую видимость куколки животы во время окрашивания. Используйте щипцы для аккуратно вставьте брюшной мешки в нижней части камеры, так что брюшной ткани в мешок полностью engulfed в раствор антител.
Наконец большой осторожностью следует передать в яичниках из брюшной мешок микроскопа во время процесса установки. Хотя яичников являются небольшими и трудно понять с щипцами без щипать их, для передачи их на слайд лучше, твердо держа в центре яичников. Они останутся структурно раз размещены на слайде. Это позволяет вскрыть в яичниках из живота прямо поверх микроскопа, чтобы избежать потери яичника, но это может привести к чрезмерное количество средних монтажа на слайде и может осложнить процесс монтажа.
Ограничения этого протокола включают количество времени, рассечение весь процесс может занять, потенциально низкая доходность хорошо окрашенные яичников, и ловкость, необходимые для успешного завершения каждого шага. Потому что куколки яичников требует извлечения обширные жир тела, подготовка единого куколки для фиксации может занять от 10 до 20 мин. Кроме того, чтобы обеспечить достаточное количество яичников выдержать весь пятная процедуру, то лучше вскрыть больше куколок, чем необходимо для эксперимента. Это означает, что большое количество времени могут быть потрачены лишь на подготовке куколок даже до фиксации шаг.
Куколки завязи Анатомирование отличаются главным образом от протоколы для личинок14 и взрослых21 завязи вскрытия. Оболочки яичника в случае куколки представляет уникальные задачи, которые покрываются инструменты, используемые в настоящем Протоколе. Эти методы могут быть применены к линии трассировки экспериментов, чтобы определить, когда FSCs и эскорт ячейки задаются в куколки яичника с течением времени. Модифицированная версия этого протокола, носители культуры клеток насекомых могут также потенциально использоваться для рассекать куколки яичников для ex vivo живых визуализации анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (RO1 GM079351 по д.к.). Мы благодарим Dorothea Godt за ее полезные советы по куколки завязи Анатомирование, на основе ее первоначального протокола. Мы также благодарим Эми Reilein за ее помощь и комментарии на рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
