Summary
El ovario del Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar el desarrollo del nicho de células madre. Aunque se han publicado métodos para disecar larvarios y adultos de los ovarios, disecciones de ovario pupa requieren técnicas diferentes que no han sido publicadas en detalle. Aquí describiremos un protocolo de disección, tinción y montaje pupas ovarios.
Abstract
A diferencia de ovarios de Drosophila adultos, pupas ovarios son relativamente difíciles de acceder y examinar debido a su pequeño tamaño, transparencia y encerrar dentro de una envoltura pupal. El reto de disección de ovarios pupas también radica en su ubicación física dentro de la pupa: los ovarios están rodeados por las células del cuerpo de la grasa dentro del abdomen pupal, y estas células de grasa debe ser removidas para permitir para la tinción de anticuerpos adecuada. Para superar estos desafíos, este protocolo utiliza pipetas de Pasteur modificado para requisitos particulares para extraer las células de la grasa corporal del abdomen pupal. Por otra parte, un cubreobjetos cámara se utiliza en lugar de un tubo de microcentrífuga durante el proceso de tinción para mejorar la visibilidad de las pupas. Sin embargo, a pesar de estas y otras ventajas de las herramientas utilizadas en el presente Protocolo, ejecución acertada de estas técnicas todavía puede implicar varios días de práctica debido al pequeño tamaño de los ovarios de la pupas. Las técnicas descritas en este protocolo se podrían aplicar a los experimentos de curso de tiempo en el que los ovarios se analizan en diversas etapas de desarrollo pupal.
Introduction
Investigación de células madre usando Drosophila ovarios ha expandido ampliamente desde la primera documentación de la célula de vástago hueco1,2,3,4. Tras el desarrollo de herramientas genéticas del seguimiento del linaje, ovario del Drosophila disecciones se han utilizado comúnmente para el estudio de linajes de células madre y señalización vías que regulan el mantenimiento de células madre, proliferación y suerte en el nicho de células madre. Conocimiento de estas vías de señalización puede dar ideas sobre posibles causas de los cánceres que se originan en la célula de vástago aberrante actividad5,6,7. Recientemente se ha demostrado que células madre somáticas en el ovario del Drosophila , conocidas como células de vástago del folículo (Eve), fuertemente se asemejan a mamífero las células intestinales de la madre en muchos aspectos de su organización8. Por esta razón, los ovarios de la Drosophila son un sistema modelo muy útil para estudiar el comportamiento de la célula de vástago.
Mientras que los ovarios de larvarios y adultos ofrecen pistas al desarrollo temprano de la célula de vástago y organización de la célula de vástago final en el nicho, respectivamente, el ovario pupa es una estructura intermedia en la que las células somáticas y germinales reorganizar y establecer sus identidades 9 , 10. aunque varios estudios han examinado aspectos del desarrollo de tejido en el ovario pupa10,11,12,13, echara la diferenciación y organización espacial tipos de células ovario durante el desarrollo pupal. En particular, durante este período ocurre la especificación de Eve. Este protocolo describe un método para la disección y la coloración ovarios pupas en puntos del tiempo deseado, una técnica que puede utilizarse en experimentos del curso del tiempo que analizan el desarrollo pupal ovario en detalle de las larvas a la etapa adulta.
Para tener en cuenta la inaccesibilidad del ovario dentro del abdomen pupa pupa, tamaño pequeño y transparencia, este protocolo utiliza herramientas tales como una pipeta de Pasteur de punta fina a medida para remover el tejido abdominal grasa corporal obstaculizar el acceso del anticuerpo a la ovarios. Un cubreobjetos claro, cámara utilizado durante el anticuerpo coloración ofrece una mayor visibilidad de las pupas y una plataforma más para mecer los ovarios en una "Nutator." Basado en un protocolo para disecciones de ovario larvas de Maimon y Gilboa14, una concentración relativamente alta de Triton X-100 se ha empleado en los primeros pasos del procedimiento de tinción para maximizar el acceso permeabilización y el anticuerpo de membrana de la célula a la células ováricas.
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Protocol
1. oviposición
- Combinar unos diez hombres y quince mujeres Drosophila moscas del genotipo deseado en un frasco de alimento mosca rico normal con levadura. Para evitar hacinamiento el frasco, deje que acoplado las hembras a desovar durante no más de 2 – 4 h14.
- Transferencia de los adultos del frasco en un frasco nuevo golpeando el frasco apertura contra un frasco diferente con la comida de mosca. Permita que los huevos se convierten en larvas a temperatura ambiente durante 3-4 días.
2. seleccionar las larvas hembra
- Usando un pincel fino húmedo con cerdas suaves, hacer un movimiento del balanceo con el cepillo a lo largo de la pared de la cubeta de transferencia de larvas de tercer estadio errantes del frasco a un vaso bien lleno hasta el borde con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Lavar los restos de alimento de las larvas a transferirlos a otro bien con PBS 1 x.
- Separar las larvas machos y hembras con unas pinzas. Identificar las larvas masculinas por un par de testículos grandes, redondos y transparente incrustado en la grasa corporal en el lado lateral del cuerpo aproximadamente dos tercios hacia abajo desde su extremo anterior15. Larvas hembra son en promedio más grandes, menos transparente que los machos y tienen gónadas mucho más pequeñas que son más difíciles de detectar.
- Seleccione contra larvas macho para recoger las larvas hembra. Recoger las hembras por lo menos diez del pozo. Coloque las larvas hembra en un separado bien llenado de PBS 1 x.
- Uso de fórceps para transferir las larvas hembra suavemente en un frasco nuevo de alimentos frescos que mosca complementan con levadura.
- Coloque el frasco con las larvas hembra en un lugar oscuro para facilitar pupariación16. Durante todo el día, controlar las larvas de pupariación. Cada larva se inmoviliza y se convierte en una prepupa, círculo la prepupa contra el vial y registre el tiempo aproximado cuando forma en una prepupa. Identificar prepupas por la protrusión de espiráculos anteriores y momento de formación del pupario17. Permiten las prepupas a desarrollar hasta el punto deseado de tiempo (medido en horas después de la formación del pupario, APF).
Nota: Cualquier animal que se someten a la formación del pupario dentro de un intervalo h aproximadamente 10 puede ser considerado una prepupa. El estadio pupal comienza aproximadamente 12 horas después de la formación del pupario después de una muda interior.
3. preparación de pupas para tinción de anticuerpos
-
Formar una pipeta de vidrio delgado para ser utilizado en pasos posteriores para limpiar el cuerpo de grasa pupal.
- Derretir la punta del cristal de una pipeta Pasteur sobre un mechero de Bunsen. Como se derrite el vidrio, utilice pinzas para tirar la punta horizontalmente lejos del resto de la pipeta para formar una punta más fina.
- Después de enfriar, romper una pequeña porción de la punta de la pipeta para formar una abertura circular limpia. Coloque un bulbo al otro extremo de la pipeta.
- Cargar la pipeta con PBS 1 x.
- Para cosechar las pupas, que se pegan a la pared del frasco, aplique una pequeña gota de agua a lo largo de la zona de contacto entre pupa y vial. Esperar 1-2 minutos para permitir que la proteína disolver pegamento antes de levantar suavemente la pupa de la pared con un pincel fino húmedo. Traslado de la pupa a un vaso bien llenada de 1 x PBS. Dedicar un solo pozo por pupa para evitar hacinamiento el pozo.
- Mientras agarra el extremo posterior de la pupa con un par de pinzas, romper cuidadosamente la porción anterior de la envoltura pupal con otro par hasta que la cabeza de la pupa.
- Sujete la punta más anterior de la cabeza de pupa con pinzas y tire suavemente de la pupa de su envoltura pupal.
Nota: Una porción de la grasa corporal puede derramarse durante este proceso. - Separar y desechar la mitad anterior de la pupa de la mitad posterior hasta que quede solamente el saco abdominal.
-
Extracto de las células de grasa corporal del saco abdominal.
- Agarrar el saco abdominal contra el fondo del pozo con pinzas en una mano mientras sostiene la pipeta de vidrio delgado llenada de 1 x PBS en otro lado.
- Apunte la punta de la pipeta fina hacia la apertura de la bolsa y lentamente pipetee 1 x PBS en el abdomen para lavar las células de grasa corporal que rodean los ovarios pupas.
Nota: Los ovarios son un par de estructuras pequeñas, translúcidas, estriados y oblongos que debe permanecer dentro del saco abdominal. - Lavar que las células de la grasa corporal hasta por lo menos dos tercios de la grasa corporal se ha ido o hasta que los ovarios son visibles cerca de la abertura de la bolsa abdominal. Es muy importante realizar este paso poco a poco para que no se lave los ovarios en el abdomen por accidente.
- Examinar el pozo para comprobar si los ovarios han derramado hacia fuera durante el lavado de células de grasa corporal. Si los ovarios no son visibles dentro del pozo, se han mantenido en el abdomen. Si los ovarios han salido, coloque una pupa nuevo en el pozo y repita este paso.
- Transferir el abdomen en una cámara transparente cubreobjetos llenada de tampón de fijación (1 x PBS paraformaldehído al 4%) y coloque la tapa en la parte superior. Para asegurar un número suficiente de ovarios soportar la coloración y el proceso de montaje, diseccionar los ovarios más que lo necesario.
PRECAUCIÓN: El búfer de fijación contiene paraformaldehído, que es tóxico. Por favor, use protección adecuada como guantes, gafas de seguridad, etcetera.
4. inmunohistoquímica
- Durante el proceso de tinción, utilice pinzas para Presione suavemente hacia abajo cualquier ovarios flotantes hasta el fondo del pozo de cristal para asegurarse de que los ovarios están completamente inmersos en solución de anticuerpo.
- Tiras de cinta de doble cara sobre la superficie plana de un Nutator y luego coloque el cubreobjetos "chambré" en la superficie adhesiva.
- Incubar los ovarios en buffer de fijación del paso 3.7 durante 15 min a temperatura ambiente.
- Enjuague los ovarios tres veces en PBS 1 x con 1% Tritón X-100 para 5, 10 y 45 minutos (1 h en total), respectivamente, para permitir la permeabilización completa.
- Bloquear los ovarios en el 10% de suero normal de cabra de 1 x PBS con 0,5% Tritón X-100 durante 30 minutos.
- Incubar durante una noche los ovarios en 600 μl de anticuerpo primario de elección diluido a la concentración apropiada en PBS 1 x con 0.5% Tritón X-100 a 4 ° C.
- Enjuague los ovarios tres veces durante 5 minutos en PBS 1 x con 0.5% Tritón X-100.
- Incubar los ovarios para 2 h en 600 μl del anticuerpo secundario de elección había diluido a la concentración apropiada en PBS 1 x con 0.5% Tritón X-100 a temperatura ambiente.
- Enjuague los ovarios dos veces durante 5 minutos en PBS 1 x con 0,5% Tritón X-100 y una vez durante 5 minutos en PBS 1 x.
5. disección y montaje pupas ovarios
- Coloque una gota pequeña de 1 x PBS sobre un portaobjetos de microscopio. Uso de fórceps para transferir el saco abdominal desde el cubre-objetos de cámaras a un vaso bien llenan de PBS 1 x. Dedicar un solo pozo por pupa para evitar hacinamiento el pozo.
- Desgarrando con fórceps el saco abdominal y cualquier resto grasa corporal.
Nota: Los ovarios, que son un par de estructuras pequeñas, translúcidas, estriados y oblongos, deben verse dentro del pozo. Los ovarios son a menudo fuertemente rodeados por la grasa corporal, por lo que es importante para asegurarse de que todo el cuerpo de grasa es completamente rasgada aparte. - Transferir los ovarios desde el pozo a la gota de 1 x PBS en el microscopio diapositiva sujetando el centro de los ovarios entre las puntas de las pinzas. Es muy importante usar un agarre firme sin exprimir los ovarios para no perder o destruir durante la transferencia. Añadir unas gotas de 1 x PBS a la corredera cuando la solución se seca con el tiempo.
- Una vez los ovarios han sido disecados y transferido a lo portaobjetos, pipeta 40 μl de medio de montaje sobre un cubreobjetos de 22 x 22 mm y el cubreobjetos con cuidado encima de los ovarios. Deje que la corredera seque durante la noche antes de la proyección de imagen.
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Representative Results
Ejecución exitosa de este procedimiento debe resultar anticuerpos clara coloración que revela la estructura y organización celular de un ovario pupal de Drosophila . Inmunohistoquímica que se describe en este protocolo puede utilizarse para identificar tipos celulares comúnmente teñidos en ovarios de larvarios y adultos. Las células del tallo pupa derivado de enjambre de células18 (descritas por Fasciclin III en blanco) se muestran en la figura 3. Además de destacar la organización celular de ovarios pupas, anticuerpo tinción específica para la proliferación celular (como fosfo-histona H3 tinción en la figura 3, se muestra en verde) puede utilizarse para estudiar patrones de división celular de células madre y otros tipos de células mitotically activo. Si las señales de anticuerpos fluorescentes son débiles cuando se examina bajo un microscopio confocal, es probable que los ovarios no fueron suficientemente expuestos a los anticuerpos debido a la extracción de suficiente grasa corporal en el abdomen pupal. Otra posibilidad puede ser que la apertura del saco pupal se derrumbó durante la tinción.
Figura 1: comparación de lado a lado de hombre vs mujer larvas. (A) larva macho en solución de PBS identificado por un par de testículos translúcidos, oblongos situado aproximadamente dos tercios de su extremo anterior. (B) larva hembra en solución de PBS, identificado por la ausencia de testículos grandes, translúcidos. Barras de escala = 2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: disección de ovarios pupas después de immunohistochemistry. (A) imagen de un par de estriados, translúcidos pupas ovarios (círculos rojos) que se han quitado del saco abdominal con tinción inmunohistoquímica. Pupas ovarios fueron disecados aproximadamente 48 h APF. Las células restantes de grasa corporal (flecha negra) que no fueron extraídas en el paso 3.6 se dispersan en la solución de PBS. (B) imagen de un solo ovario pupal en solución de PBS había disecado aproximadamente 48 h APF. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: manchas tipo pupa ovario disecado 48 horas APF. Imagen fue obtenida usando un microscopio confocal. El reportero del camino de Wnt, Fz3 RFP8 (rojo), se expresa en células somáticas anteriores. Anticuerpos dirigidos a las células de contornos (blanco) Fasciclin III del tallo pupa. Los núcleos fueron contratinción con DAPI (azul). Fosfo-histona H3 coloración (verde) pone de relieve las células que experimentan mitosis. Líneas blancas diagonales indican los bordes de la imagen original. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paso más crítico y difícil de este protocolo consiste en la preparación de ovarios pupas antes de la fijación. Para asegurarse de que los ovarios, pequeño y enterrados por las células de grasa corporal dentro de la pupa del abdomen, se tiñen suficientemente con los anticuerpos, es importante no sólo romper una abertura grande en el saco abdominal con pinzas, pero también extraer las células del cuerpo de grasa que obstruyen la ovarios de los anticuerpos. Ejecución exitosa de este paso requiere aplicación de sutil presión sobre el bulbo de la pipeta de Pasteur mientras lava las células de la grasa corporal fuera del saco abdominal (por ejemplo, 1 – 2 células de grasa corporal deben dejar el abdomen por segundo durante este paso). No usar fuerza suave probablemente hará que los ovarios se derrame fuera del abdomen y en el vaso bien. Porque los ovarios por sí mismos son pequeñas, translúcidas y difícil con fórceps, deben permanecer dentro del saco abdominal a lo largo de todo el procedimiento de tinción. Por lo tanto, si los ovarios salen del abdomen durante la etapa de preparación antes de la fijación, sería extremadamente difícil de recuperar, mancha y montarlos en su forma aislada durante el protocolo.
Las células de la grasa corporal, que consisten principalmente en gotitas del lípido, son orgánulos de almacenamiento de triglicéridos que se encuentran comúnmente en insectos como Drosophila melanogaster19,20. Dado que algunas células de la grasa corporal permanecen en el abdomen pupal en fijación, este protocolo utiliza relativamente altas concentraciones de Triton X-100 en los tres primeros enjuagues de PBS para extraer lípidos tantos como sea posible de ambos los cell membranes en el ovario y cualquier resto de grasa tejido que rodea los ovarios. Según lo demostrado por el anticuerpo de la proteína de membrana de la célula de Fasciclin III brillante tinción en la figura 3, con 1 x PBS con 1% Tritón X-100 durante los tres primeros enjuagues funciona bien para extraer máximo lípidos mientras que mantiene la integridad de la célula membrana.
Una vez que se ha extraído la grasa corporal, el paso más crítico en segundo lugar es para asegurarse de que los ovarios permanezcan dentro del saco abdominal a través de la fijación y tinción de anticuerpo. Es útil colocarlos dentro de un cubreobjetos claro, cámara en lugar de un tubo de microcentrífuga para visibilidad más clara de los abdómenes pupas durante la tinción. Utilice pinzas para empuje suavemente los sacos abdominales para la parte inferior de la cámara para que los tejidos abdominales en el saco son completamente sumidos en la solución de anticuerpo.
Por último, se debe tener gran cuidado para transferir los ovarios del saco abdominal a la diapositiva del microscopio durante el proceso de montaje. Aunque los ovarios son pequeños y difíciles de agarrar con pinzas sin pellizcarlos, la mejor manera de transferir a la diapositiva es sujetando firmemente el centro de los ovarios. Permanecerán estructuralmente intactos una vez colocado en el portaobjetos. Es posible diseccionar los ovarios desde el abdomen directamente sobre el portaobjetos para evitar perder el ovario, pero esto puede llevar a una excesiva cantidad de medio de montaje en el deslizamiento y podría complicar el proceso de montaje.
Las limitaciones de este protocolo incluyen la cantidad de tiempo que puede tomar el proceso de disección completa, el potencialmente bajo rendimiento de los ovarios bien manchados y la destreza necesaria para completar con éxito cada paso. Porque los ovarios pupas requieren extracción de grasa corporal amplia, preparando una pupa solo para fijación puede tardar entre 10 a 20 minutos. Por otra parte, para asegurar un número suficiente de ovarios soportar todo el procedimiento de tinción, es mejor disecar más pupas que lo necesario para el experimento. Esto significa que una gran cantidad de tiempo se puede pasar simplemente en la preparación de las pupas antes de la etapa de fijación.
Disecciones de ovario pupa difieren en gran parte de los protocolos para14 de larvas y adultos21 ovario disecciones. El encasement del ovario dentro de una envoltura pupal presenta desafíos únicos que cumplen las herramientas utilizadas en el presente Protocolo. Estos métodos pueden ser aplicados a experimentos de rastreo de linaje para determinar cuando Eve y escolta células se especifican en el ovario pupa con el tiempo. Una versión modificada de este protocolo con los medios de cultivo de células de insectos también pueden utilizar para disecar pupas ovarios para ex vivo vivo análisis de proyección de imagen.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por los institutos nacionales de salud (to1 GM079351 a D.K.). Damos las gracias por sus consejos sobre disecciones de ovario pupa basados en su Protocolo original Dorothea Godt. También agradecemos a Amy Reilein por su ayuda y comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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