Summary
Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.
Abstract
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind für die pharmazeutische Industrie von großer Bedeutung, da sie bei vielen menschlichen Krankheiten beteiligt sind und gut validierte für eine therapeutische Intervention Zielvorgaben. Entdeckung von Bleiverbindungen, einschließlich kleine synthetische Moleküle, die speziell die Rezeptor-Funktion hemmen, ist ein erster wichtiger Schritt in der Medikamentenentwicklung und stützt sich auf sensible, spezifische und robuste zellbasierte Assays. Hier beschreiben wir einen kinetische zellularen Assay mit einer fluoreszierenden Anzeige in erster Linie entwickelt, um spezifischen Rezeptor-Antagonisten zu identifizieren, die die intrazelluläre Ca2 + Freigabe, hervorgerufen durch die Aktivierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen, indem seine endogenen Liganden, der CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12). Ein entscheidender Vorteil dieser Methode ist, dass es ermöglicht auch Screening von Verbindungen mit agonistischen Eigenschaften (d.h., Verbindungen, die einen Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration in der Abwesenheit von CXCL12 zu entlocken) oder Verbindungen ausgestattet Modulation der Rezeptor-Funktion durch Interaktion mit allosterische Bindungsstellen (d.h., positive und negative allosterische Modulatoren (PAMs und NAMs, beziehungsweise)). Auf der anderen Seite können die Probe auslesen, dadurch behindert zuverlässige Dateninterpretation Autofluorescent Verbindungen beeinträchtigen. Am ehesten kann dieser Assay mit minimalen Anpassungen als ein generisches Medikament Entdeckung Assay für viele andere GPCRs umgesetzt werden, von denen die Aktivierung zu einer Freisetzung von intrazellulären Ca2 führt +.
Introduction
GPCRs sind eine wichtige Superfamilie Zelle Oberflächenproteine, die Transduktion Signalkaskaden bei extrazellulären Liganden Bindung zu aktivieren. Sie können durch eine Vielzahl von Reizen wie Peptide, Proteinhormone, biogene Amine und Lipide, aktiviert werden die Ergebnisse in der Einleitung der unterschiedlichen intrazellulären Signalwege und schließlich biologischen Reaktionen1,2 . Darüber hinaus GPCRs engagieren sich in vielen, wenn nicht alle Entwicklungs- und physiologische Prozesse und viele menschliche Erkrankungen werden mit dysfunktionalen GPCR-Signalisierung oder Rezeptor-Überexpression in Verbindung gebracht. GPCRs gehören daher die meisten validierten pharmakologische Ziele in Medizin1,3.
In der Regel beginnt ein GPCR Drug Discovery Workflow zellulären Screening-Tests ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen wie kleine Moleküle, monoklonale Antikörper und Peptide, die die Aktivität von bestimmten GPCR modulieren können. In GPCR Arzneimittelforschung, dass viele verschiedene Arten von Tests vorhanden sind, um solche Verbindungen zu suchen sind die meisten davon mit Mitte - zum Hochdurchsatz-Screening Kampagnen kompatibel. Die am häufigsten verwendeten Assays gehören Rezeptor-Bindung-Experimente, Fluoreszenz und Lumineszenz basierte Assays erkennen die Schwankungen der so genannte sekundäre Botenstoffe (z.B. Ca2 +, zyklische Adenosin Monophosphate (AMP)), phänotypische Screening-Assays und β-arrestin Rekrutierung assays4. Die Wahl für eine bestimmte Art von Assay kann von mehreren Faktoren abhängen, sondern richtet sich auch nach Vorwissen über die Signalisierung Eigenschaften einer gegebenen GPCR. Agonisten binden an ein GPCR induziert eine Konformationsänderung katalysieren den Austausch von Guanidin diphosphat (BIP) für Guanidin Triphosphat (GTP) auf die α-Untereinheit des Heterotrimeric G-Proteine. Anschließend die Gα-GTP-Untereinheit distanziert sich von den G-βγ -Untereinheit und beide Untereinheiten werden weitere Signalwege zu initiieren. Hydrolyse der GTP-Molekül und anschließende erneute Vereinigung von Gα- BIP und Gβγ Untereinheiten werden das G-Protein in seine inaktiven Konformation5,6wiederherzustellen. Basierend auf Sequenzähnlichkeit der G-α -Untereinheit werden verschiedene Arten von G-Proteinen definiert (G-s, Gich, GQ, G12/13)7. Signalisierung über die G-α Untereinheit gibt steigen mehrere typische Reaktionen wie z. B. die Erhöhung (über G-s) oder verringern (über Gich) zyklisches AMP Produktions-und intrazellulären Ca2 + Mobilisierung (über G-Q)5 ,7. Gβγ Untereinheiten sind auch in der Lage, intrazelluläre Effektor Wege zu induzieren. Zum Beispiel bei einer Aktivierung der Gich-gekoppelten GPCRs, Gβγ können direkt stimulieren Phospholipase C (PLC-β), Inositol-Triphosphat (IP3) zu produzieren, die die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären Speichern7 auslöst . Nach der Aktivierung der Rezeptor sind GPCRs phosphoryliert von GPCR Kinasen (GRKs) die Interaktion mit β-Arrestins fördert. Dieser Prozess endet G Protein signaling und führt zu Rezeptor Desensibilisierung und schließlich Verinnerlichung. Β-Arrestins sind auch in der Lage, Multi-molekulare komplexe bilden, die andere Signalwege unabhängig von G Protein signaling8auslösen können.
Innerhalb der Unterfamilie der Chemokin-Rezeptoren, die Gich-gekoppelten CXCR4 ist ein GPCR, die viel Interesse als ein viel versprechendes Ziel für die Wirkstoffforschung ausgelöst hat. Angesichts seiner etablierten Rolle als eine große Ko-Rezeptor für Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) 1 wurden virale Eintrag und Infektion, Verbindungen gezielt CXCR4 zunächst als Anti-HIV-Medikament Kandidaten9entwickelt. Vor kurzem hat eine wachsende Zahl von Beweisen auf eine wichtige Rolle für CXCR4 in Tumorgenese und Krebs Metastasen, so dass es eine gut validierte therapeutische Ziel in der Onkologie sowie10hingewiesen. CXCR4 ist hoch in mehr als zwanzig Arten von Krebserkrankungen und Steuerelemente Tumor Zelle überleben, Verbreitung, sowie Migration und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese10ausgedrückt. CXCR4-Antagonisten von verschiedenen chemischen Klassen wurden zuvor beschriebenen11,12, sondern nur das kleine Molekül AMD3100 derzeit für den Einsatz in der Klinik als Stammzell-Mobilisierung Agent verwendet während der Behandlung des Lymphoms zugelassen und Myelom-Patienten13,14. Klinische Studien sind im Gange, die Sicherheit und Wirksamkeit von mehreren anderen CXCR4-Antagonisten in verschiedenen Krankheiten des Menschen, aber mit einem starken Fokus auf Onkologie12bewertet. Angesichts der vielen Anwendungsmöglichkeiten für CXCR4-Antagonisten, ist die Suche nach neuartigen Verbindungen mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften, verbesserte Bioverfügbarkeit oder möglicherweise weniger Nebenwirkungen gerechtfertigt.
Hierin eine kinetische Fluoreszenz basierende zelluläre Assays in erster Linie verwendet, um Bildschirm für Verbindungen in der Lage, Hemmung CXCR4 wird beschrieben. Die fluoreszente Messung dieser Methode basiert auf der vorübergehende Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration auf CXCR4 Aktivierung durch die endogene Agonist, der Chemokin-Liganden CXCL12 (früher bekannt als Stromazellen Zelle Faktor 1α abgeleitet (hervorgerufen SDF1-α)), und die möglichen Hemmung dieser CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion durch bestimmte Verbindungen. In diesem Test werden U87 menschlichen Glioblastom-Zellen stabil mit dem Ausdruck des menschlichen Rezeptors CXCR4 verwendet. Zur gleichen Zeit fehlt diese Zellen endogene Expression von CXCR7, einem Verwandten Chemokin-Rezeptor, der auch CXCL1215,16,17 bindet. CXCR7 zuvor auch nachweislich bilden Heterodimere mit CXCR4, werden dadurch modulieren die Signalisierung Eigenschaften dieser letzteren Rezeptor-18. Die Schwankungen der intrazellulären Ca2 + von CXCR4 vermittelt werden durch das Laden der CXCR4 überwacht+ Zellen mit Fluo-2 Acetoxymethyl (AM) Ester, eine Zelle durchlässig hohe Affinität fluoreszierende Ca2 +-bindende Farbstoff. Fluo-2 Uhr ist eine einzelne Wellenlänge fluoreszierende Molekül, das auf 490 angeregt werden kann nm während der Emission Fluoreszenz bei 520 gemessen wird nm. Diese Fluoreszenz Emission erhöht sich auf Ca2 + Bindung mit einem großen Dynamikbereich zwischen Ca2 +-gebunden und ungebunden Zustand. Die Zunahme der Fluoreszenzsignal ist vergänglich, auftreten innerhalb einer Zeitspanne von ein paar Minuten, und wird danach verfallen. Die Peakhöhe der die Fluoreszenz Emission weiterer korreliert mit dem Niveau der Rezeptor-Aktivierung. Der Test selbst erfolgt mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader verfügt über eine intensivierte CCD (ICCD) Kamera, die ein integriertes Pipettierens System besitzt, die Standardisierung der Pipettier Schritte in der Probe ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien) . Darüber hinaus ist die gleichzeitige Messung von das Fluoreszenzsignal in alle Vertiefungen der einer Mikrotestplatte ein weiterer wesentlicher Vorteil der Fluoreszenz-Leser, die verwendet wird. Während der erste Teil des Tests die Verbindungen untersucht (z.B. eine Gruppe von kleinen Molekülen in einer festen Konzentration oder in einer Verdünnungsreihe), um die Fluo-2 Uhr hinzugefügt werden geladen CXCR4+ U87 Zellen gefolgt von einer ~ 10 min Inkubationszeit während dessen wird die potenzielle agonistische Wirkung der Verbindungen kontinuierlich in Echtzeit gemessen. Dann die endogenen Agonisten (d. h.CXCL12) wird hinzugefügt, um die Zellen zu einen CXCR4-vermittelten vorübergehenden Anstieg der Ebene der intrazellulären Ca2 +evozieren. In diesem Teil des Tests kann die potenziellen antagonistische Aktivität der getesteten Verbindungen ausgewertet werden. Ein schematischer Überblick über die Assay allgemeinen Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
Obwohl in erster Linie diese Ca2 + Mobilisierung Assay verwendet worden ist, zu identifizieren und zu bestimmen, die inhibitorische Potenz von wettbewerbsfähigen CXCR4-Antagonisten (d.h., Verbindungen, die verhindern, dass die endogene Agonisten stimulieren den Rezeptor zu binden), es auch -Rezeptor-Agonisten identifizieren können und darüber hinaus Verbindungen, die ihre Funktion durch die Bindung an allosterische Standorten (z.B. Websites, die topographisch unterscheiden sich von den Orthosteric-Bindungsstelle von endogenen Agonisten besetzt) ausüben. Beispiele für die zweite Kategorie von Verbindungen allosterische Agonisten und PAMs und NAMs19,20. Während spezifischen Rezeptor-Antagonisten sowie NAMs CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion hemmen würde, PAMs würde diese Reaktion zu verbessern (siehe auch Diskussion Abschnitt). Obwohl der Test hier speziell CXCR4 Ziele beschrieben, es wird davon ausgegangen, dass diese Methode auf andere GPCRs mit minimalen Optimierung Aufwand mindestens angewendet werden kann wenn sie über die Freigabe des intrazellulären Ca2 +signalisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Alle in den Abschnitten 1 und 2 beschriebenen Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow Kabinett durchgeführt.
1. Wartung von U87. CD4.hCXCR4 Zellen
- Wachsen Sie die Zellen in T75 Kulturflaschen bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator.
Hinweis: Die in-vitro- Zellinie in diesem Protokoll verwendeten ist ein U87 Glioblastom-Zelllinie stabil Cluster der Differenzierung 4 (CD4) und Menschen zum Ausdruck bringen CXCR4 und wurde zuvor beschriebenen17. Zelle Oberflächenexpression von CD4 und CXCR4 wird kontinuierlich überwacht, durch Durchflusszytometrie und Ausdruck Niveaus im Laufe der Zeit konstant bleiben (~ 100 % CD4+ und ~ 100 % CXCR4+ Zellen). Eine detaillierte Beschreibung der Generation der verwendeten Zelllinie und des Verfahrens Flow Cytometry Rezeptor Ausdruck Ebenen zu untersuchen ist nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls.- Subkultur-Zellen bei 80-85 % Konfluenz. Lassen Sie alle Reagenzien, Raumtemperatur (RT) vor der Zelle Kultivierung zu erreichen.
- Entfernen Sie das konditionierte Kulturmedium aus den Zellen zu und waschen Sie der Zelle monomolekularen Film einmal mit 5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Geben Sie 3 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und die Zelle Monolage verteilen Sie gleichmäßig. Dann entfernen Sie das überschüssige Trypsin-EDTA und inkubieren Sie bis zu 5 min bei 37 ° C, bis die Zellen beginnen sich zu lösen.
- 10 mL frische komplette Wachstumsmedium (Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) + 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + entsprechende Auswahl Agenten) hinzugeben. Aufschwemmen der Zellen durch sanft auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine steril 50 mL-Tube.
- Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einer Methode der Wahl. Im Falle von U87 Glioblastoma Zellen im allgemeinen Lebensfähigkeit erreicht ~ 100 %.
Hinweis: Zellzahlen können auf verschiedene Arten bestimmt werden. Wir verwenden routinemäßig eine automatisierte Analyse Zellsystem basierend auf Trypan blau Färbung (siehe Tabelle der Materialien) nach seinen Standard Umgang mit Verfahren, aber andere Manieren sollte genauso gut funktionieren. - Fügen Sie 2 x 106 oder 3 x 106 (lebensfähige) Zellen zu einem Endvolumen von 25 mL frisches Nährmedium in einem T75 Kultur Kolben und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
Hinweis: Wenn 3 x 106 Zellen verwendet werden die Zellen erreichen 80-90 % Konfluenz nach 2 Tagen. Wenn 2 x 106 Zellen verwendet werden, werden sie die gleichen Konfluenz nach 3 Tagen erreichen. Die Wachstumsrate der Zellen sollte zunächst empirisch ermittelt werden, wenn andere Zelllinien verwendet werden.
2. Aussaat der Zellen für die Ca2 + Mobilisierung Assay
- Am Tag der Zelle Passagierung (Tag 0), Mantel schwarz-von Mauern umgebene Polystyrol 96-Well Platten mit klaren unten Sie (siehe Tabelle der Materialien) mit 0,1 % Gelatine-Lösung Zellhaftung zu erleichtern.
Hinweis: Beschichtung von 96-Well-Platten mit Gelatine kann weggelassen werden, wenn vorbeschichtete Platten, die im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien) sind, werden verwendet. Es wird empfohlen, die Verwendung von vorbeschichtete Platten anstelle von Handbeschichtung für jede Zelllinie untersucht bevor Sie fortfahren mit dem Protokoll zu bewerten.- Bereiten Sie Gelatine-Lösung durch Zugabe von 1 g Gelatine, 100 mL PBS, eine 1 % ige Lösung zu erhalten. Von 10 X mit PBS vor weiterem Gebrauch verdünnen. Verbesserung die Löslichkeit von Gelatine Erhitzen der Lösung auf 37 ° C.
- Fügen Sie 100 µL 0.1 % Gelatine-Lösung pro Bohrloch der 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. 2 h bei RT inkubieren
- In der Zwischenzeit bereiten Sie die Zellen für die Aussaat in den beschichteten 96-Well-Platte.
- Lösen Sie die Zellen aus der Kultur-Flasche, Aufschwemmen ihnen frisches Wachstum Mittel- und zählen sie verwenden Trypan blau Färbung Methode.
- Spin-down der Zellen in einem 50 mL Tube für 5 min bei 400 X g bei RT
- Zellen im frischen Wachstumsmedium Aufschwemmen (DMEM + 10 % FBS + 1 % HEPES, keine Antibiotika) eine Zelldichte von 0,1 x 106 (praktikable) Zellen/mL zu erhalten.
- Entfernen Sie die Gelatine-Lösung aus den schwarzen Wänden Platten mit klaren unten durch die Platte umdrehen und auf einem Tuch trocknen. Fügen Sie 200 µL/Well PBS zu entfernen überschüssige Gelatine und die Platte wieder umzudrehen.
- 200 µL Zellsuspension (entsprechend 0,2 x 105 Zellen) pro Bohrloch in der Gelatine beschichtet 96-Well-Platte zu verzichten (ab jetzt man diese Platte wird weiter als bezeichnet "Messung Platte").
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.
3. Laden der Zellen mit einer fluoreszierenden Ca2 + -empfindlichen Farbstoff
- Am 1. Tag durchführen der eigentlichen Ca2 + Mobilisierung Assay, beginnend mit dem Laden der gesetzten Zellen mit dem fluoreszierenden Ca2 +-Bindung färben Fluo-2 Uhr.
- Bereiten Sie Testpuffer durch Zugabe von 40 mL HEPES (1 M), 200 mL Hank ausgewogen Salzlösung (HBSS, 10 X, kein Phenol rot, kein Natriumbicarbonat). Fügen Sie Reinstwasser einem Endvolumen von 2 L und 4 g Rinderserumalbumin (BSA) hinzufügen. Die BSA über magnetische Rühren auflösen. Anpassen des pH-Werts 7,4 (mit NaOH) und Filtern Sie die Lösung.
Hinweis: Bei allen folgenden Arbeitsschritten wird der gleiche Puffer, genannt "Testpuffer" verwendet. - Bereiten Sie eine Stammlösung (4 mM Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) des fluoreszierenden Ca2 +-Sensitive färben Fluo-2 Uhr. Vermeiden Sie übermäßige Sonnenbestrahlung ans Licht. Auflösen von 1 mg Fluo-2 Uhr (Molekulargewicht: 1.061 g/Mol) in 235.6 µL DMSO.
- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung Fluo-2 Uhr. Mix für eine 96-Well-Assay-Platte 12,5 µL Fluo-2 AM-Stammlösung (4 mM) und 12,5 µL nichtionische Tenside Polyol (z.B. Pluronic f-127) Lösung (20 % Gewicht/Volumen in DMSO, siehe Tabelle of Materials). 11 mL Testpuffer in einem 15 mL Röhrchen 22 µL dieser Mischung hinzufügen. Die Endkonzentration von Fluo-2 Uhr ist 4 µM.
Hinweis: Nichtionische Tenside als Streuung Agent dient zur Verbesserung der wäßrigen Löslichkeit Fluo-2 Uhr und in der Folge, um Zelle laden zu verbessern. Um Tensid in DMSO solubilisieren, Erhitzen der Probe bei 37 ° C und Mix regelmäßig, um eine homogene Lösung zu erhalten. - Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den zuvor gesetzten Zellen in der Messung der 96-Well-Platte, indem die Platte umdrehen und auf einem Papiertuch trocknen.
- Fügen Sie 100 µL des Ladens Farbstofflösung pro Bohrloch mit einer Mehrkanal-Pipette und 45 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
- Bereiten Sie Testpuffer durch Zugabe von 40 mL HEPES (1 M), 200 mL Hank ausgewogen Salzlösung (HBSS, 10 X, kein Phenol rot, kein Natriumbicarbonat). Fügen Sie Reinstwasser einem Endvolumen von 2 L und 4 g Rinderserumalbumin (BSA) hinzufügen. Die BSA über magnetische Rühren auflösen. Anpassen des pH-Werts 7,4 (mit NaOH) und Filtern Sie die Lösung.
4. Vorbereitung der 96-Well Polypropylen-Platten mit der Chemokin Liganden CXCL12 oder die Verbindungen untersucht
- Erhalten Sie Rundboden-Polypropylen (PP)-96-Well-Platten (siehe Tabelle der Materialien).
- CXCL12-Stammlösung zu ermöglichen (1 mg/mL) und der Stammlösung der Verbindungen untersucht, bei RT equilibrate
Hinweis: Der Stammlösung von CXCL12 bereitet Reinstwasser mit 0,01 % Tween20 ergänzt und als Einweg-Aliquote bei-20 ° C gelagert. - Bereiten Sie eine 5 x konzentrierte Lösung von CXCL12 in Testpuffer (250 ng/mL entspricht 31,25 nM) und eine 5 x konzentrierte Verdünnung von jeder Verbindung (in Testpuffer).
- Die Stammlösungen in die entsprechenden 96-Well-Platte nach einem vordefinierten Platte Layout zu verzichten. 75 µL/Well in die Platte mit CXCL12 zu verzichten ("Chemokin-Platte"), 50 µL/Well in die Platte mit den Verbindungen (die "zusammengesetzte Platte") zu verzichten.
Hinweis: Beide Verbindungen und CXCL12 wird schließlich verdünnt 5 X bei der Abgabe in der Messung-Platte. Es ist auch wichtig, negative Kontroll-Vertiefungen, enthält nur Testpuffer in die zusammengesetzte Platte sowie das Chemokin-Platte aufzunehmen. Auch positive Kontroll-Vertiefungen müssen einbezogen werden (d. h.wells mit CXCL12 in der Chemokin-Platte, aber mit Testpuffer in den entsprechenden Vertiefungen der zusammengesetzte Platte).
- CXCL12-Stammlösung zu ermöglichen (1 mg/mL) und der Stammlösung der Verbindungen untersucht, bei RT equilibrate
5. Protokoll-Einstellungen auf der Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser
Hinweis: Der Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser in diesem Protokoll verwendeten bezeichnet man in der Tabelle der Materialien.
- Die Kühlereinheit der Fluoreszenz-Platte-Leser zuerst schalten Sie ein, und schalten Sie dann die Fluoreszenz-Leser selbst. Lassen Sie für ein paar Minuten zu initiieren und die System-Software zu öffnen.
- Erstellen der Test-Protokoll unter Verwendung der Drag-and-Drop-Menü, das die folgenden Schritte umfasst:
- Wählen Sie im Feld "Einstellungen", "Read_Mode" mit Erregung Wellenlänge: 470-495 nM; Emissionswellenlänge: 515-575 nM.
Hinweis: Die ausgewählte Wellenlängen eignen sich für die Verwendung mit dem Ca2 +-empfindlichen Farbstoff fluo2. - Sind die "Mix mit TF" (Transfer Flüssigkeit)-Box für automatisches Mischen der Verbindungen in der zusammengesetzte Platte, die an der 2-Quellposition des Gerätes gestellt wird (siehe Punkt 6.4). Wählen Sie 15 µL Lösung in jedem Bohrloch automatisch abgesaugt und dreimal gemischt werden. Die Höheneinstellung der Pipettenspitzen an 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration und Verzicht auf 50 µL/s ein.
Hinweis: Die Höhe der Pipettenspitzen bezieht sich auf das Volume, das unter die Pipettenspitzen übrig bleibt. Zum Beispiel wenn der Brunnen eine zusammengesetzte Platte 50 µL enthalten, entspricht eine Höhe von 30 µL 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Das Volumen der zusammengesetzte Lösung getroffen, um zu mischen, die Geschwindigkeit der Vermischung, die Position der Pipette Tipps beim Mischen, und die Anzahl der Zyklen mischen alle eingestellt werden mit der Software. - Im Feld "Fluid übertragen" zu definieren, dass 20 µL der einzelnen Brunnen aus der zusammengesetzten Platte in die Messung Platte übertragen werden. Setzen Sie die Pipettenspitze an 20 µL unter die Flüssigkeit die Oberfläche d.h.Höhe 30 µL während der Aspiration der Verbindungen und Höhe 60 µL bei Abgabe in der Messung-Platte. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration mit 50 µL/s und die Geschwindigkeit der Abgabe bei 25 µL/s ein.
Hinweis: Die zusammengesetzte Platte enthält 50 µL der Lösung pro Bohrloch (siehe Schritt 4.1.3), eine Höhe von 30 µL entspricht somit einer Position 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Die Messung Platte enthält 80 µL Testpuffer pro Bohrloch (siehe Punkt 6.3), so entspricht eine Höhe von 60 µL eine ähnliche Position der Tipps. - Klicken Sie auf "Lesen mit TF". Wählen Sie in der ersten Pause 60 liest (fluoreszierende Messungen) mit einer lesen Sie Intervallzeit 1 S. definieren, das 10 mal gelesen werden vor der Abgabe der Verbindungen in die Messung Platte aufgezeichnet, und 50 liest danach. Definieren Sie das zweite Intervall mit einer lesen Sie Intervallzeit von 30 s und 18 mal gelesen.
Hinweis: Während dieses Schrittes Fluoreszenz wird gemessen kinetisch (in definierten Zeitabständen) für ~ 10 min insgesamt. - Gehören Sie die Schaltfläche "Wash-Tipps" im Protokoll dreimal. Innerhalb jeder Waschschritt, wählen Sie die flüssige Art: Flüssigkeit (Reinstwasser) oder Flüssigkeit B (70 % Ethanol), die Anzahl der Waschgänge (1), die Pumpe Geschwindigkeit (schnell), und die Anzahl der Hübe (5) bei jedem Schritt zu waschen.
Hinweis: Während der ersten und letzten ist waschen Schritt Flüssigkeit A, während das zweite waschen Schritt Fluid verwendet B verwendet wird. - Gehören Sie die "Pause-Pipette"-Funktion. Legen Sie die Pipette Pause für 300 s.
Hinweis: Durch die Einbeziehung dieser Schritt im Protokoll, die Pipette-Kopf, der in der Fluoreszenz-Platte-Lesegerät integriert ist, für 5 min pausiert bevor Sie fortfahren des Protokolls. - Gehören die "Mix mit TF" Kontrollkästchen erlauben automatische Vermischung der CXCL12-Lösung in der Chemokin-Platte, die an der Quelle 3 Position des Geräts positioniert werden (siehe Punkt 6.4). Wählen Sie 15 µL Lösung in jedem Bohrloch automatisch abgesaugt und dreimal gemischt werden. Während der Aspiration und mischen positionieren Sie die Pipette Tipps 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Die Geschwindigkeit der Aspiration und Dosierung liegt bei 50 µL/s.
Hinweis: Ähnlich wie bei Schritt 5.2.2, diese Parameter eingestellt werden. - Im anschließenden "Fluid übertragen" Feld definieren, dass 25 µL voneinander gut von der Chemokin Platte in die Messung Platte übertragen werden. Position 20 µL Tipps unten die Flüssigkeit die Oberfläche d.h.auf Höhe 55 µL bei Aspiration aus der Chemokin-Platte, die 75 µL/Well enthält (siehe Schritt 4.1.3), und an Höhe 80 µL bei Abgabe in der Messung-Platte. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration mit 50 µL/s und die Geschwindigkeit der Abgabe bei 25 µL/s ein.
- Gehören Sie die "Read mit TF"-Taste. Wählen Sie in der ersten Pause 145 liest mit einer lesen Sie Intervallzeit 1 S. definieren, das 5 mal gelesen werden vor der Abgabe von CXCL12 in die Messung Platte aufgezeichnet, und 140 liest danach. Definieren Sie das zweite Intervall mit einer lesen Sie Intervallzeit von 6 s und wählen Sie 20 mal gelesen.
Hinweis: Zusammengenommen, während das gesamte Protokoll 243 mal gelesen (fluoreszierende Messungen) erfasst: 78 bei Schritt 5.2.4 und 165 während Schritt 5.2.9. - Ähnlich wie bei Schritt 5.2.5, gehören die "Wash Tipps"-Taste dreimal im Protokoll.
Hinweis: Dieser Schritt am Ende des Protokolls einschließlich ermöglicht, dass die Spitzen wieder verwendet werden können, ein weiterer Test durchführen, ohne die Spitzenwechsel.
- Wählen Sie im Feld "Einstellungen", "Read_Mode" mit Erregung Wellenlänge: 470-495 nM; Emissionswellenlänge: 515-575 nM.
- Stellen Sie die Temperatur des Gerätes bei 37 ° C, indem Sie auf die Taste "Set Bühne Temperatur" und Auswahl von 37 ° C.
6. Ausführung des Fluoreszenz-Tests
- Nach der Messung hat Platte mit Ladepuffer 45 min inkubiert (siehe Schritt 3.1.5), entfernen Sie den Puffer durch die Platte umdrehen und auf einem Tuch trocknen.
- Waschen Sie die gesetzten Zellen durch Zugabe von 150 µL/Well Testpuffer und 2 min inkubieren.
- Entfernen Sie den Puffer wieder durch Umklappen der Plattenrandes. Fügen Sie 80 µL/Well Testpuffer mit einer Mehrkanal-Pipette.
- Setzen die Platten in das Gerät an der entsprechenden Position: die zusammengesetzte Platte an der 2-Quellposition, der Chemokin-Platte an der Quelle 3-Position, und die Messung Platte an die Leseposition. Setzen Sie eine Schachtel mit schwarzen Spitzen an der Quelle 1-Tipps-Position. Schließen Sie das Gerät Tür und 5 min inkubieren Sie, bevor Sie fortfahren des Protokolls.
- Klicken Sie auf "Protokoll-Signal-Test", um den Hintergrund relativ leichte Einheiten (RLUs) und Fluoreszenz Varianz über die Platte zu bestimmen. Ein neues Fenster öffnet sich. Wählen Sie "Test Signal".
Hinweis: Während dieses Schrittes Hintergrund RLUs ICCD Kamera, richten sich nach der im Fach Optik der Fluoreszenz-Lesegerät integriert ist. Diese RLUs ergeben sich aus der Anregung von Ca2 +-empfindlichen Farbstoff (Fluo-2) durch Leuchtdioden (LEDs) (LED output-470-495 nm Wellenlänge). Werte von 8.000-10.000 RLUs eignen sich gut für diese Anwendung. RLUs können, falls erforderlich, durch eine Änderung der Erregung Intensität (Wählen Sie EXC Intensität) oder das Kamera-Tor (Wählen Sie Tor geöffnet) angepasst werden. Die Varianz über die Platte sollte idealerweise weniger als 7,5 % sein. - Wählen Sie "Update", wenn Hintergrundwerte von 8.000-10.000 RLUs erhalten werden. Speichern Sie die wichtigsten Protokoll durch Klicken auf die Schaltfläche "Speichern".
Hinweis: Auf diese Weise werden die Einstellungen aus der Protokoll-HUP-Test zum wichtigsten Protokoll übertragen. - Führen Sie Tests durch Drücken der Schaltfläche "Ausführen".
(7) Datenanalyse und Qualität
- Nachdem der Test abgeschlossen ist, öffnen Sie die "Analyse"-Box, in der System-Software.
- Gehen Sie zu "Korrekturen konfigurieren" und wählen "Antwort über Base Line". Grundlinie 1 zur Messung 1 und Ende der Messung 5 beginnen zu definieren; die mittlere Fluoreszenz wird in jede Vertiefung zwischen 1 und 5 Messungen berechnet.
Hinweis: Alle weitere Messungen von einem bestimmten gliedern sich gut durch diese Brunnen-spezifische Basis Linie 1.- Grundlinie 2 Messung 78 bis 83 Messung starten zu definieren (CXCL12 entfällt nach der Messung 83; wieder die mittlere Fluoreszenz wird berechnet in jedem gut zwischen Messung 78 und 83 und dieser Korrekturfaktor gilt für alle Messungen nach Messung 83).
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "anzeigen als Prozentsatz" und "Subtrahieren Hintergrund".
- Gehen Sie zu "Kinetische Reduktion konfigurieren". Um die hemmende Wirkung von Verbindungen auf die CXCL12-induzierte Ca2 + Antwort auszuwerten, wählen Sie Max-Min-Messung 84 (d. h., die erste Messung nach dem CXCL12 abgegeben wird) auf 243 (d.h. die letzte Messung) ab.
Hinweis: Durch die Wahl Max-Min des Unterschied zwischen der minimalen und maximalen Reaktion über Basislinie zwischen 84 Messung und Messung ist 243 berichtet. Wenn die Max-Min beginnend zwischen Messung 11 und Messung 78 gewählt wird, wird der Unterschied zwischen der minimalen und maximalen Reaktion über Baseline relativ zur Grundlinie 1 gemeldet. Dieser Wert kann verwendet werden, zur Analyse der potenziellen agonistischen Aktivität der Verbindungen, siehe Diskussion). - Die Daten werden in der System-Software visualisiert werden. Bei Bedarf exportieren Sie die unformatierten Daten für weitere Analysen und Visualisierung in anderen gemeinsamen Analyse-Software-Paketen.
- Gehen Sie zu "Korrekturen konfigurieren" und wählen "Antwort über Base Line". Grundlinie 1 zur Messung 1 und Ende der Messung 5 beginnen zu definieren; die mittlere Fluoreszenz wird in jede Vertiefung zwischen 1 und 5 Messungen berechnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Wirkung von CXCL12-Stimulation auf die intrazelluläre Ca2 + Mobilisierung in U87. CD4.CXCR4+ und U87. CD4-Zellen wurde mit Ca2 + Mobilisierung Assay bewertet. Statt 20 µL Testverbindung, die normalerweise während der ersten Pipettieren Schritt des Protokolls (Abbildung 1) hinzugefügt werden würden, Testpuffer wurde hinzugefügt, um die Fluo-2 AM U87 geladen. CD4.CXCR4+ Zellen in der Messung-Platte. Während der zweiten Dosierschritt, unterschiedliche Konzentrationen von CXCL12 (0,2-102,4 nM, Endkonzentration) wurden in der Messung Platte verzichtet. Eine dosisabhängige Zunahme der Fluoreszenz, korrelieren mit eine dosisabhängige Erhöhung der Freisetzung von Ca2 +, gezeigt (Abbildung 2A). Hier stellt die negative Kontrollprobe diesen Brunnen in dem an beiden Ergänzungen nur Testpuffer, um die Messung Platte hinzugefügt wurde (d. h., 0 nM CXCL12), was das Ausbleiben einer Reaktion (Abbildung 2A). CXCL12 in zunehmendem Maße induzieren erhöhte Spiegel von Fluoreszenz, die im Laufe der Zeit (Abbildung 2A) zerfallen. Aus diesen Daten wurde eine Dosis-Antwort-Kurve generiert anhand der "Max-Min-Antwort über Baseline" zwischen 84 (d. h., die erste Messung nach CXCL12 Zugabe) Messung und Messung 243 (zB., die letzte Messung im Protokoll ). Mit nicht-lineare Regression,50 Leitfähigkeitswert (d.h. die Konzentration erforderlich, um die halbe maximale Reaktion hervorzurufen) wurde ermittelt und entspricht 1,14 nM (Abb. 2 b). Keine Leuchtstoffröhren Ca2 +-bezogene Antwort wurde hervorgerufen durch CXCL12, auch in hoher Konzentration (102,4 nM), wenn U87. CD4-Zellen fehlt funktionalen CXCR4 Ausdruck dienten. Dies zeigt die Rezeptor-Spezifität der Messung, hervorgerufen durch CXCL12 (Abbildung 2).
Ein Schlüssel Anwendung für zellbasierte Assays die Identifizierung kleiner Moleküle gezielt an CXCR4 ist und in der Lage, Hemmung der CXCL12-induzierte Ca2 + Mobilisierung. Wenn Wirkstoffe ("Hits") gekennzeichnet sind, können sie weiter indem serielle Verdünnungen der Verbindung testen und analysieren die inhibitorische Potenz näher charakterisiert werden. Als Beispiel ist die Wirkung der Bicyclam AMD3100, eine gut etablierte niedermolekularer CXCR4-spezifische-Rezeptor-Antagonisten mit potenten anti-HIV-1-Aktivität21,22, in Abbildung 3dargestellt. Eine Konzentrationsreihe von AMD3100 (n = 4, 3 µM bis 1,37 nM Endkonzentration in einer Verdünnung von 1/3-Serie) auf U87 verzichtet wurde. CD4.CXCR4+ Zellen während des ersten Schritts des Protokolls. Die Verbindung durfte dann mit den Zellen für inkubieren ~ 10 min, während dessen das Fluoreszenzsignal wurde kontinuierlich aufgezeichnet. Dann 6,4 nM von CXCL12 (50 ng/mL, Endkonzentration) wurde hinzugefügt, um alle Brunnen der Zellplatte gleichzeitig induzieren die CXCR4-vermittelten Ca2 + Mobilisierung. Dosisabhängige Hemmung dieser Reaktion durch die verschiedenen Verdünnungen von AMD3100 zeigt Abbildung 3A. In diesem Fall wird nur der Teil des Diagramms nach Zugabe von CXCL12 gezeigt. Als Negativkontrolle (blaue Linie) nur Puffer in der Probe (keine Vorinkubation mit AMD3100, keine CXCL12 hinzugefügt, um den Brunnen) angewandt wurde, wodurch das erwartete Ausbleiben einer Reaktion. Die Positivkontrolle (rote Linie) entspricht die Proben in welcher 6,4 nM CXCL12 wurde hinzugefügt, um Brunnen ohne vorherige Inkubation von AMD3100 (Abb. 3A). Basierend auf diesen definiert negative und positive steuert die Z' Wert in diesem Test ist in der Regel zwischen 0,5 und 1. Um die inhibitorischen Potenz des AMD3100 bestimmen eine Dosis-Wirkungs-Kurve wurde erstellt durch eine nichtlineare Regression in einen berechneten IC50 Wert des 770.8 nM (Abb. 3 b). Um das Verhalten einer inaktiven Verbindung weiter zu verdeutlichen, wurde in diesem Experiment Maraviroc aufgenommen. Maraviroc ist ein kleines Molekül, insbesondere Hemmung des CC Chemokin-Rezeptors 5 (CCR5) dadurch blockiert (CCR5)-Tropen HIV-1 Infektion23 . Auch bei hoher Konzentration (10 µM Endkonzentration) wurde keine hemmende Wirkung dieser Verbindung auf die CXCR4-vermittelten Ca2 + Antwort (Abbildung 3A) beobachtet.
Schließlich zeigen, dass dieser Ca2 + Mobilisierung Assay auch angewendet werden kann, um andere GPCRs, eine serielle Verdünnung des CC Chemokin Liganden 5 (CCL5), studieren der endogene Liganden für CCR5, wurde hinzugefügt, um Zellen mit dem Ausdruck CCR5 (U87. CD4.CCR5+) mit genau der gleichen Versuchsbedingungen und Hardwareeinstellungen. Eine dosisabhängige fluoreszierende Ca2 + Antwort zeigt sich nach Zugabe einer serielle Verdünnung von CCL5 (Abbildung 3). Darüber hinaus, und im Gegensatz zu seinen Auswirkungen auf CXCR4, Vorinkubation mit 100 nM (Endkonzentration) von Maraviroc stark gehemmt diese Antwort (Abbildung 3D).
Abbildung 1: Schematische Übersicht über den Assay Workflow. Am Tag 0 Zellen mit dem Ausdruck der GPCR von Interesse (in diesem Fall CXCR4) in schwarz-von Mauern umgebene 96-Well-Platten mit klaren Boden ausgesät werden und über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2angebaut. Am 1. Tag wird die Fluoreszenz basierenden Ca2 + Assay durchgeführt. Zellen werden zunächst mit einer fluoreszierenden Ca2 +geladen-empfindlichen Farbstoff (Fluo-2 Uhr) und für 45 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Bereiten wir ein "Chemokin Platte" und "zusammengesetzte Platte" (PP = Polypropylen). Nach der Inkubation mit dem Farbstoff laden werden gesetzte Zellen einmal mit Testpuffer (150 µL/Well) gewaschen, wonach 80 µL/Well Testpuffer hinzugefügt wird. Alle Platten werden dann für 5 min in das Gerät bei 37 ° C inkubiert, vor Beginn des Tests. Dann sind Verbindungen des Interesses (z.B. kleine Moleküle) verzichtet auf die gewünschte Konzentration in die Vertiefungen der Platte Messung und durfte für inkubieren ~ 10 min während Fluoreszenz kontinuierlich gemessen wird. Als nächstes eine feste Konzentration des endogenen Agonisten von GPCR (hier CXCL12) wird hinzugefügt, um Ca2 + Release evozieren und Fluoreszenz wird im Laufe der Zeit weiter aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Agonist Tätigkeit von CXCL12 auf CXCR4+ Zellen und Spezifität der erkannten Antwort. (A) die dosisabhängige Wirkung von CXCL12 auf Ca2 + Mobilisierung in U87. CD4.CXCR4+ Zellen. (B) anhand der Max-Min-Antwort über Basislinie zwischen Messung 84 und 243 eine Dosis-Wirkungs-Kurve wurde generiert und den Leitfähigkeitswert50 berechnet (n = 4, bedeuten ± SD). (C) keine Antwort von CXCL12 induziert wurde, wenn es auf U87 verzichtet wurde. CD4-Zellen CXCR4 fehlt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Beispiel für die Wirkung von einem CXCR4-Antagonisten (AMD3100) und eine inaktive Verbindung (Maraviroc) auf CXCR4+ Zellen und Aktivierung von CCR5 durch seine endogene Agonist, CCL5. (A) dosisabhängig hemmende Wirkung von AMD3100 auf die Ca2 + Mobilisierung hervorgerufen durch Hinzufügen von 6,4 nM CXCL12 bis U87. CD4.CXCR4+ Zellen. Maraviroc (bei 10 µM Endkonzentration) zeigte keine hemmende Wirkung auf die CXCL12-induzierte Ca2 + Antwort. (B) bezogen auf die Max-Min-Antwort über Basislinie zwischen Messung 84 und 243, eine hemmende Dosis-Wirkungs-Kurve wurde generiert und der IC50 Wert wurde berechnet 770.8 nM (n = 4, bedeuten ± SD). (C) Dosis-abhängige Aktivierung von CCR5 durch seine endogene Agonist, CCL5. (D) Hemmung der CCR5-vermittelten Ca2 + Äußerung Vorinkubation der Zellen mit 100 nM von Maraviroc. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Ca2 +-Mobilisierung Assay beschriebenen hat zuvor gezeigt, dass ein wertvolles Instrument zu identifizieren und zu charakterisieren, targeting CXCR417-Rezeptor-Antagonisten. Es ist, jedoch erwartet, dass diese Methode im Allgemeinen kann für eine große Gruppe von anderen GPCRs, die eine cytosolische Ca2 + Version auf ihre Aktivierung auslösen angewendet werden wie für den entsprechenden Chemokin-Rezeptor CCR5 dargestellt. Im Falle von CCR5 genau die gleichen Versuchsbedingungen angewandt werden könnte, müssen mehrere Schritte im Protokoll (z. B.Zellzahl im Überzug, Beladung der Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff) neu optimierte werden vor der Übertragung des Tests zu anderer GPCRs um ein günstiges Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Hier ein wichtiges Thema ist auch die Auswahl eines geeigneten in-vitro- zelluläre Hosts ermöglicht High-Level Expression von GPCR und funktionelle Kopplung auf Ca2 + Pfad. Im Falle von CXCR4, wurden wegen der menschlichen Glioblastom U87 Zellen ausgewählt: (1) der Mangel an endogenen Expression von CXCR7 (eine verwandte Chemokin-Rezeptor, die den gleichen Agonist als CXCR4 belegt), (2) ihre Fähigkeit, CXCR4-Aktivierung, um die Ca2 +paar-Signalisierung Weg, (3) die günstige Dynamikbereich der fluoreszierenden Antwort nach der Beladung der Zellen mit der Ca2 erhalten +-empfindlichen Farbstoff, und (4) ihr ausgezeichnete festhalten an der Assay-Platten zu minimieren Zelle Störungen während des Verfahrens. All diese Parameter müssen für jede Roman GPCR von Interesse und jede zelluläre Expressionssystems experimentell ermittelt werden.
Beim Einrichten eines ähnlichen Assays für ein weiteres GPCR können mehrere alternative Schritte oder Reagenzien im Protokoll betrachtet werden. Zum Beispiel andere Ca2 +-sensible Fluorophore (z.B., Fluo-4, Fluo-3) könnte als Alternative für das Fluorophor (Fluo-2) in diesem Protokoll verwendeten verwendet werden. Im Falle von lose anhaftende Zellen, Waschen der Zellen durch die Einführung von keine-Wash Farbstoffe zur Minimierung von Zelle verdrängen24weggelassen werden könnte. Darüber hinaus würde mit Ausnahme der Waschschritt aus dem Protokoll der Assay-Durchsatz weiter erhöhen. Obwohl dieser Test auch mit Zellen zeigen endogenen Expression von CXCR4, zum Beispiel verschiedene Arten von menschlichen Krebs Zelle Linien10,25, einschließlich durchgeführt werden könnte ist anzumerken, dass mit stabil transfizierten Zellen hohe GPCR Linien Ausdruck-Ebenen, die im Laufe der Zeit stabil bleiben erhalten. Dadurch wird mehr ausgeprägt Assay Messungen, assay ein größeres Fenster für zuverlässige Dateninterpretation und konsistente Leistung über einen längeren Zeitraum. Wenn Zellen mit endogen werden auszudrücken CXCR4 viel schwieriger, dieses Ergebnis zu erreichen.
Ein großer Nachteil des Tests ist, dass er auf eine Fluoreszenzmessung. Daher können Autofluorescent Verbindungen mit der Test-Messung, stören, die ihnen von der Analyse aufgrund von unzuverlässigen Dateninterpretation ausschließt. Auch dieser Ca2 + Mobilisierung Assay idealerweise erfolgt über eine Mobilfunk-screening-System ausgestattet mit einem integrierten Pipettier System, das ermöglicht standardisierte mischen und Dispension Verbindungen und Rezeptor Agonist in die Messung Platte in allen gleichzeitig Brunnen. Der Test könnte, jedoch für die Verwendung mit anderen, weniger teure Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser mit kinetischen Messmöglichkeiten angepasst werden. Die Zugabe von Verbindungen und Agonist müsste dann manuell mit Mehrkanal-Pipetten, die hands-on-Zeit erhöht und senkt den Assay Durchsatz durchgeführt werden. Wäre darüber hinaus erhalten eine ähnliche Anzahl von Fluoreszenz-Messungen innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls eines kinetischen Assays schwer zu erreichen, wie viele Mikrotestplatte Leser Signale gut durch gut messen, während High-End-Screening-Systeme alle Brunnen messen gleichzeitig.
-Rezeptor-Antagonisten verhindern Bindung an den Rezeptor und anschließende Aktivierung von endogenen Agonisten (CXCL12) derzeit bilden die Hauptkategorie Verbindungen gezielt an CXCR411,12. AMD3100, die kleines Molekül, das verwendet wurde, um die Leistung des Ca2 + Mobilisierung Assays, illustrieren ist eines der prominentesten Beispiele für CXCR4-Antagonisten26. Neben-Rezeptor-Antagonisten erhöhen Moleküle, die GPCR Signalisierung anders regulieren sowie allgemeinem Interesse. Diese Moleküle sind inverse Agonisten sowie GPCR PAMs und NAMs19,20,27. Ein interessantes Feature des Assays in diesem Manuskript beschrieben ist, dass es nicht nur-Rezeptor-Antagonisten, aber auch Agonisten und allosterische Modulatoren identifizieren kann. Einige kleinere Anpassungen an der Assay und Einschränkungen müssen jedoch berücksichtigt werden.
PAMs und NAMs binden an Rezeptoren topographisch unterscheidet sich von der Orthosteric-Bindungsstelle von den Rezeptor endogenen Liganden besetzt. PAMs steigern die Potenz und/oder Wirksamkeit von endogenen Ligand(s) den Rezeptor, hemmen NAMs die Potenz und/oder Wirksamkeit der endogenen Ligand(s)19,20. PAMs haben keine intrinsische Agonist-Aktivität. Sie sind nur im Beisein der endogenen Agonisten, im Gegensatz zu sogenannten allosterische Agonisten tätig. Da allosterische Modulatoren GPCR weniger Nebenwirkungen als klassische Rezeptor-Antagonisten bei Anwendung im klinischen Umfeld28,29, hervorrufen würde, sind sie wertvolle pharmakologische Werkzeuge. In unserem Test, allosterische Agonisten würde evozieren eine vorübergehende Erhöhung der das Fluoreszenzsignal unmittelbar nach Ergänzung der CXCR4+ Zellen. Rezeptorspezifität dieses Signal sollte dann durch Tests die gleiche Verbindung mit dem gleichen Assay, sondern auf Zellen fehlt CXCR4 ermittelt werden. Beim speziell für PAMs screening, sollte eine geringere Konzentration des endogenen Agonisten induzieren eine fluoreszierende Ca2 + Antwort in der Probe verwendet werden. Obwohl diese niedrigeren Betrag der Agonist eine kleinere Fluoreszenzsignal generieren wird, lässt er ein größeres Fenster zur Stimulation der zusätzliche Rezeptoren erkennen. In der Regel ist eine Agonist-Konzentration entspricht der EG-10-30 EC von Stimulation der Rezeptoren30,31gewählt. Zugabe von einem PAM während der erste Teil des Tests würde eine erhöhte Fluoreszenz Messung führen. Allerdings würde das Ca2 + Fluoreszenzsignal nach folgenden Stimulation des Rezeptors mit seiner endogenen Agonisten erhöhen. Ebenso, ein NAM ändert nichts an die fluoreszente Messung vor Zugabe der Agonist, sondern hemmt den Rezeptor-Reaktion nach Zugabe von Agonisten. Daher wird das Aktivitätsprofil ein Rezeptor-Antagonist und ein NAM ähneln. Beide führen die Hemmung der fluoreszierenden Antwort nach Zugabe der Agonist. Daher sind weitere experimentelle Untersuchungen zur Unterscheidung zwischen Antagonist und ein NAM notwendig. Hier, Rezeptor-Bindung-Studien wobei unbeschriftete Verbindungen mit einem festen Betrag von konkurrieren CXCL12 beschriftet, für Bindung an CXCR417,32 kann eine sinnvolle Strategie zur Unterscheidung zwischen Antagonist, die verhindern würde die mit der Bezeichnung Agonist aus der Bindung an den Rezeptor und eine NAM, das wäre nicht so, wie es die gleichen Rezeptor-Bindungsstelle nicht teilen würde.
Liganden selbständigen (oder basale oder konstitutive) Tätigkeit von GPCRs ist für zahlreiche GPCRs33 beobachtet worden, obwohl die basale Aktivität in der Regel eher niedrig ist rekombinant ausgedrückt GPCRs27. Basale GPCR-Aktivität kann verbessert werden, durch natürlich vorkommende Mutationen33 und einer Punktmutation führt zu erhöhten basalen CXCR4 Aktivität wurde früher34beschrieben. Durch die Kopplung dieser konstitutiv aktiv CXCR4-Mutante zu Pheromon Antwort Weg in Hefe und durch [35S] GTPγS verbindliche Experimente wurde gezeigt, dass T140, einem Peptid-basierte CXCR4-Antagonisten mit potenten Anti-HIV Aktivität17,35 diese basale Aktivität deutlich verringert und somit konnte gezeigt werden, wie eine inverse Agonisten34Verhalten. Der Hinweis, in einem Fura-2 Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay die gleichen Autoren beobachtet einen kleinen vorübergehenden Rückgang Ca2 +-Verwandte Fluoreszenz, die nach Zugabe von T140 zum Ausdruck Mutant CXCR4, was auf einen Rückgang der basalen Zellen Rezeptor-Aktivität-34. Bei der Analyse einer Zusatztafeln zyklische Pentapeptid-basierte CXCR4 inverse Agonisten von T140 konzipiert, war Erkennung von reduzierten basale Aktivität mit einem Ca2 + Mobilisierung Assay jedoch weniger einfach36. Wenn die Wirkung von T140 auf Zellen, die mit dem Ausdruck Wildtyp CXCR4 mit Ca2 + Mobilisierung Assay, wie in diesem Manuskript beschrieben analysiert wurde, war keine Änderung der basalen Fluoreszenzsignal17beobachtet. Darüber hinaus Fluoreszenz Schwankungen sind schnell und vorübergehend und Erhöhungen der basalen Ca2 + , zum Beispiel nicht eingehalten in Zellen, die mit dem Ausdruck konstitutiv aktiv Gαq-gekoppelten Rezeptoren4. Zusammen genommen, wäre die Wirkung der inverse Agonisten sehr schwierig, wenn nicht gar unmöglich, zu erkennen und zuverlässig mit unserem Test zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Eric Fonteyn und Geert Schoofs für ausgezeichnete technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven (keine zu gewähren. PF/10/018), den Fonds Voor Wetenschappelijk Onderzoek-(FWO, Nein zu gewähren. G.485.08), und die Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).
