Summary
설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.
Abstract
그들은 많은 인간 질병에 관여 하 고 치료 적 개입에 대 한 잘 검증된 대상 포함 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 제약 산업에 매우 중요 있습니다. 특히 수용 체의 기능을 억제, 작은 합성 분자를 포함 한 리드 화합물의 발견 약물 개발에 중요 한 초기 단계 이며, 특정, 민감하고 강력한 세포 기반 분석에 의존. 여기, 우리 설명 운동 세포 분석 결과 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 갖는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 활성화를 억제 하는 특정 수용 체 길 항 제를 식별 하는 데 주로 사용 하는 형광 판독 하 여 그 내 인 성 ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) 이 방법의 주요 장점은 있다는 것 이다 또한 부여 기본 agonistic 속성 (즉, 세포내 캘리포니아2 + 농도 부재에서 CXCL12의 증가 도출 하는 화합물) 또는 화합물 화합물의 심사 allosteric 바인딩 사이트와의 상호 작용을 통해 수용 체의 기능 변조 (즉, 포지티브 및 네거티브 allosteric 변조기 (PAMs 및 NAMs, 각각)). 아래쪽 측면에서 autofluorescent 화합물은 분석 결과 판독, 신뢰할 수 있는 데이터 해석 함으로써 방해를 방해할 수 있습니다. 대부분이 분석 결과 구현할 수 있습니다, 최소한의 적응으로 많은 다른 GPCRs의 활성화 리드 세포내 캘리포니아2 +의 출시에 대 한 일반적인 약물 발견 분석 결과로.
Introduction
GPCRs는 extracellular ligand 바인딩 시 신호 변환 폭포를 활성화 하는 세포 표면 단백질의 중요 한 superfamily. 그들은 다양 한 세포내 신호 통로 결국 생물학 응답1,2의 개시 귀착되는 자극 펩 티 드, 단백질 호르몬, 생물 아민, 지질 등의 큰 다양성에 의해 활성화 될 수 있다 . 또한, GPCRs 관련 된 많은 경우 모든, 발달 및 생리 적 프로세스와 많은 인간 질병 장애 GPCR 신호 또는 수용 체 overexpression와 연결. GPCRs는 그러므로 약1,3에서 가장 검증 된 약리 목표 사이.
일반적으로, GPCR 약물 발견 워크플로 셀룰러 심사 분석 활성화 작은 분자, 단일 클론 항 체, 등 특정 GPCR의 활동을 조절 수 있는 펩 티 드 화합물의 식별으로 시작 합니다. GPCR 신약 같은 화합물에 대 한 검색을 존재 하는 다양 한 유형의 분석 실험에 대부분의 중반-를 높은 처리량 검열 캠페인와 호환 됩니다. 가장 많이 사용 되는 분석 실험 포함 수용 체 바인딩 실험, 형광 또는 발광 기반 분석 실험의 소위 2 차 메신저 (예를 들어, 캘리포니아2 +, 순환 아데노신 monophosphate (AMP)), phenotypic 수준에서 변동 감지 심사 분석, 및 β-arrestin 모집4분석 실험. 분석 결과의 특정 유형에 대 한 선택, 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 또한 사전 지식에 관한 특정된 GPCR의 신호 속성에 의해 결정 됩니다. 길 항 제는 GPCR에 바인딩 heterotrimeric G 단백질의 α 소 단위에 guanidine 3 인산 염 (GTP)에 대 한 guanidine diphosphate (GDP)의 교환 catalyzing 구조적 변화를 유도 합니다. 그 후 Gα-GTP 소 단위 Gβγ 소 단위에서 dissociates 고 두 소 단위 신호 통로 더 시작 됩니다. 가수분해 GTP 분자와 Gα의 후속 다시 협회의 GDP와 Gβγ 소 단위 복구할 것 이다 G 단백질 그것의 비활성 형태5,6. 따라 시퀀스 유사성 Gα 소 단위의 G 단백질의 종류 정의 (GsG나, Gq, G12/13)7. Gα 를 통해 신호 소 단위 (Gs)를 통해 상승 증가 등 여러 가지 일반적인 답변을 또는 준다 순환 앰프 생산 및 세포내 캘리포니아2 + (Gq)를 통해 동원 (G나)를 통해 감소5 ,7. Gβγ 소 단위 세포내 이펙터 경로 유도 할 수 있습니다. 예를 들어, G나의 활성화 시-결합 된 GPCRs, Gβγ 직접 phospholipase C (PLC-β) 이노 시 톨 3 인산 염 (IP3)를 생산 하는 세포내 상점7 캘리포니아2 + 의 릴리스 자극 수 . 수용 체 활성화, 다음 GPCRs GPCR kinases (GRKs) β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하 여 phosphorylated는. 이 프로세스는 G 단백질 신호 종료 하 고 수용 체 탈 감 작 및 결국 국제화. Β-arrestins 다른 신호 통로8를 신호 하는 G 단백질의 독립 실행할 수 있는 다중 분자 복합물을 형성 수 있습니다.
G나chemokine 수용 체 subfamily 내-결합된 CXCR4는 GPCR 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 많은 관심을 제기 하고있다. 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1)에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 주어진 바이러스 항목 및 감염, 화합물 CXCR4를 대상으로 처음으로 개발 되었다 항 HIV 약물 후보9. 더 최근에, 증거의 성장 시체는 지적 했다 중요 한 역할을 CXCR4 위한 tumorigenesis 및 암 전이 뿐만 아니라 종양에 잘 검증 된 치료 대상 만들기에10. 20 개 이상 유형의 인간 암 및 컨트롤 종양 세포 생존, 확산, 그리고 마이그레이션 뿐만 아니라 종양 관련 신생10CXCR4 매우 표현 된다. 다른 화학 수업의 CXCR4 antagonists 설명된11,12, AMD3100 현재 림프 종의 치료 하는 동안 사용 되는 줄기 세포 동원 요원으로 병원에서 사용 하기 위해 승인 작은 분자에만 하지만 이전 되었습니다. 그리고 골 수 종 환자13,14. 임상 시험 진행 안전 및 여러 다른 CXCR4 길 항 근의 종양학12에 강한 초점 하지만 다른 인간 질병에 효능을 평가 하는. 주어진 CXCR4 길 항 제에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램, 향상 된 pharmacokinetic 속성, 향상 된 생체 이용률, 또는 잠재적으로 적은 부작용 소설 화합물에 대 한 검색 보증 된다.
여기, 키네틱 형광 기반 셀룰러 분석 결과 주로 하는 데 사용 화합물 CXCR4 억제의 능력에 대 한 화면 설명. 이 방법의 형광 측정의 내 생 적인 주 작동 근, chemokine ligand (이전으로 알려진 stromal 세포 파생 요소 1α (CXCL12에 의해 CXCR4 활성화 시 갖는 세포내 캘리포니아2 + 농도의 일시적 증가에 따라 SDF1-α)), 그리고이 CXCL12 유도 캘리포니아2 + 응답 특정 화합물의 잠재적 저해. 이 분석 결과에서는 U87 인간의 세포종 세포 인간의 CXCR4 수용 체를 표현 안정적으로 사용 됩니다. 동시에 이러한 셀 CXCR7, 관련된 chemokine 수용 체는 또한 CXCL1215,,1617의 내 생 적인 표현 부족. CXCR7는 이전 또한 보였다 CXCR4와 heterodimers 형성 수18이 후자의 수용 체 신호 속성을 변조 함으로써. 세포내 캘리포니아2 + CXCR4 중재의 수준에 있는 동요는 CXCR4 로드 모니터링 fluo-2 acetoxymethyl (오전) 에스테 르, 셀 침투성 높은 선호도 형광 캘리포니아2 ++ 세포-염료를 바인딩. Fluo-2 오전은 490에서 흥분 수 단일 파장 형광 분자 nm의 방출 형광 520에서 측정 하는 동안 nm. 캘리포니아2 + 바인딩을 사이 Ca2 +넓은 동적 범위에 따라 증가 하는이 방출 형광-바운드 및 언바운드 상태. 형광 신호 증가, 몇 분의 시간 간격 내에서 발생 하는 과도 이며 이후에 붕괴 것입니다. 수용 체 활성화의 수준으로 형광 방출 더 상호의 피크 높이입니다. 자체 분석 결과 분석 결과에 pipetting 단계 표준화를 수 있는 통합된 pipetting 시스템을 보유 하 고 있는 강화 CCD (ICCD) 카메라를 갖춘 형광 microplate 리더를 사용 하 여 수행 됩니다 ( 재료의 표참조) . 또한, 형광 신호는 미 판의 모든 우물에서의 동시 측정에 사용 되는 형광 판독기의 또 다른 주요 장점은입니다. 첫 번째는 동안 조사 (예를 들어, 고정된 농도에 또는 희석 시리즈에 작은 분자의 패널) 화합물 fluo-2 오전에 추가 분석 결과의 부분 로드 CXCR4+ U87 셀 뒤에 ~ 10 분 잠복기 화합물의 잠재적인 agonistic 효과 지속적으로 실시간으로 측정 됩니다. 그런 다음에 생 길 항 제 (즉, CXCL12) 연상 CXCR4 중재 일시적인 증가 세포내 캘리포니아2 +의 수준에서 셀에 추가 됩니다. 분석 결과의이 부분 동안에 시험된 화합물의 잠재적인 대립 활동을 평가할 수 있습니다. 분석 결과 일반적인 워크플로의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다.
이 Ca2 + 동원 분석 결과 경쟁 CXCR4 길 항 제 (즉, 생 주 작동 근 묶는 수용 체를 자극을 방지 하는 화합물)의 억제 효능을 결정을 위해 주로 사용 되는 있지만 그것은 또한 수용 체 주 작동 근을 식별할 수 있습니다 및, 더하여, 화합물을 바인딩 allosteric 사이트 (즉, 세 생 주 작동 근에 의해 점령 orthosteric 바인딩 사이트에서 다른 사이트)에 의해 그들의 기능을 발휘. 화합물의 후반 종류의 예로 allosteric 촉진제 및 PAMs 및 NAMs19,20있습니다. 특정 수용 체 길 항 근으로 NAMs CXCL12 유도 캘리포니아2 + 응답을 억제 것, 반면 PAMs이이 응답을 향상 시킬 것 이다 (또한 토론 을 참조 하십시오 섹션). 이 방법을 적용할 수 있는 최소한의 최적화 노력으로 다른 GPCRs에 적어도 예상 된다 분석 결과 특히 대상 CXCR4 여기서 설명, 비록 그들은 세포내 캘리포니아2 +의 출시를 통해 신호 하는 경우.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 섹션 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
1입니다. U87의 유지 보수입니다. CD4.hCXCR4 셀
- 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장.
참고: 체 외에서 세포 라인이이 프로토콜에 사용 되는 U87 세포종 세포 라인 안정적으로 차별화 4의 클러스터 (CD4)와 인간의 표현 CXCR4 앞에서 설명한17되었습니다. C d 4와 CXCR4 세포 표면 표현 cytometry에 의해 지속적으로 모니터링 및 식 수준 유지 시간이 지남에 따라 일정 (~ 100 %CD4+ 와 ~ 100 %CXCR4+ 세포). 수용 체 식 수준을 조사 흐름 cytometry 절차의 사용 된 셀 라인의 세대에 대 한 자세한 설명을이 프로토콜의 범위 내에서 않습니다.- 80-85 %confluency 2 차 배양 세포입니다. 세포 배양 하기 전에 실내 온도 (RT)를 도달 하는 모든 시 약을 허용 합니다.
- 셀에서 바른된 문화 매체를 제거 하 고 씻어 5 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 한 번 셀 단층.
- 0.25 %trypsin-EDTA의 3 mL를 추가 하 고 셀 단층 위에 균등 하 게 배포. 트립 신-EDTA의 초과 제거 그리고 세포 분리를 시작 때까지 37 ° C에서 최대 5 분을 품 어.
- 신선한 완전 한 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) + 0.01 M HEPES + 적절 한 선택 대리인)의 10 mL를 추가 합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀을 resuspend. 살 균 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
- 선택 방법을 사용 하 여 실행 가능한 세포의 수를 계산 합니다. U87 세포종 세포의 생존은 일반적으로 도달 ~ 100%.
참고: 셀 숫자를 여러 가지 방법으로 확인할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 trypan 푸른 얼룩 ( 재료의 표참조)에 따라 자동된 세포 분석 시스템을 사용의 표준 처리 절차, 하지만 다른 매너 똑같이 잘 작동 합니다. - T75 문화 플라스 크에서 25 mL 신선한 성장 매체의 최종 볼륨을 2 x 106 또는 3 x 106 (가능한) 셀을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
참고: 3 x 106 셀 사용 됩니다 셀 2 일 후 80-90 %confluency 도달할 것 이다. 2 x 106 셀 사용 하는 경우 그들은 3 일 후 동일한 confluency를 도달할 것 이다. 세포의 성장 율 먼저 결정 되어야 합니다 실험적으로 다른 세포 선을 사용 하는 경우.
2. Ca2 + 동원 분석 결과 대 한 셀의 시드
- 뿌리고 (0 일), 코트 블랙 벽으로 폴리스 티 렌 96 잘 접시 클리어 셀의 날에 세포 부착을 촉진 하기 위하여 0.1% 젤라틴 솔루션 ( 재료의 표참조)을 하단.
참고: 젤라틴으로 96 잘 접시의 코팅 미리 코팅된 접시, 상용 ( 재료의 표참조)를 사용 하는 경우 생략할 수 있습니다. 조사 프로토콜 계속 하기 전에 각 셀 라인에 대 한 수동 코팅 대신 미리 코팅된 접시의 사용을 평가 하는 것이 좋습니다.- 100 ml PBS 1%의 솔루션을 얻기 위해 젤라틴 1g를 추가 하 여 젤라틴 솔루션을 준비 합니다. 더 사용 하기 전에 PBS로 10 배 희석. 젤라틴의 가용성을 높이기 위해 열 37 ° c 솔루션
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 당 0.1% 젤라틴 용액의 100 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 2 h에 대 한 품 어
- 한편, 코팅된 96 잘 접시에 뿌리기 위해 셀을 준비 합니다.
- 문화 플라스 크에서 세포를 분리, 신선한 성장 매체에서 resuspend 그리고 그들을 계산 trypan 푸른 얼룩 메서드를 사용 하 여.
- 실시간에서 x 400g에 5 분 동안 50 mL 튜브에 셀 아래로 회전
- 신선한 성장 매체에 셀 resuspend (DMEM + 10 %FBS + 1 %HEPES, 아무 항생제) 106 (가능한) 셀/mL x 0.1의 셀 밀도 얻기 위해.
- 접시 위에 튀기 고는 조직에 그것을 건조 하 여 분명 바닥 블랙 벽 격판덮개에서 젤라틴 솔루션을 제거 합니다. 200 µ L/잘 초과 젤라틴을 제거 하 고 다시 접시를 뒤집어 PBS를 추가 합니다.
- 세포 현 탁 액 (0.2 x 105 셀에 해당)의 200 µ L 당 젤라틴 코팅 96 잘 접시에 잘 분배 (지금부터이 접시 하나 추가 참조 됩니다 "측정 플레이트"로).
- 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 접시를 품 어.
3. 로드는 형광 캘리포니아2 + 셀-중요 한 염료
- 1 일에 실제 캘리포니아2 + 동원 분석 결과, 로드는 형광 캘리포니아2 +시드 셀의 시작을 수행-바인딩 염색 fluo-2 오전.
- 200 mL 행 크의 균형 소금물 (HBSS, 10 배, 아니 페 놀 레드, 아무 나트륨 중 탄산염) 40 mL HEPES (1 M)를 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 2 L의 최종 볼륨을 가져오고 추가 4 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 초순 물을 추가 합니다. 마그네틱 감동을 통해 BSA를 분해. (NaOH)과 7.4에 pH를 조정 하 고 필터링 솔루션.
참고: 모든 다음 단계 동안 동일한 버퍼, "분석 결과 버퍼"로 사용 됩니다. - 준비 재고 솔루션 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) (4 mM) 형광 캘리포니아2 +-구분 염색 fluo-2 오전. 과도 한 빛에 노출을 하지 마십시오. 분해 1 mg fluo-2 오전 (분자량: 1,061 g/mol) 235.6 µ L DMSO에.
- 오전 fluo-2의 작업 솔루션을 준비 합니다. 한 분석 결과 96 잘 접시 믹스 fluo-2 오전 재고 솔루션 (4mm)의 12.5 µ L 12.5 µ L 비 계면 활성 제 (예, pluronic f-127) 폴리올 솔루션 (20% 무게/볼륨 DMSO, 재료의 표참조). 15 mL 튜브에 11 mL 분석 결과 버퍼에이 혼합물의 22 µ L를 추가 합니다. 오전 fluo-2의 최종 농도 4 µ M.
참고: 비 계면 활성 제 셀 로드 향상의 결과에서 그리고 fluo-2 오전의 수성 가용성을 개선 하기 위해 분산 대리인으로 사용 됩니다. Solubilize DMSO에 계면 활성 제, 37 ° C 및 혼합 균질 성 해결책을 얻기 위해 정기적으로 샘플을 열. - 접시 위에 튀기 고 종이 수건에 건조 하 여 측정 96 잘 접시의 이전 시드 세포에서 성장 매체를 제거 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 잘 당 염료 솔루션을 로드의 100 µ L을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에서 45 분 동안 품 어.
- 200 mL 행 크의 균형 소금물 (HBSS, 10 배, 아니 페 놀 레드, 아무 나트륨 중 탄산염) 40 mL HEPES (1 M)를 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 2 L의 최종 볼륨을 가져오고 추가 4 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 초순 물을 추가 합니다. 마그네틱 감동을 통해 BSA를 분해. (NaOH)과 7.4에 pH를 조정 하 고 필터링 솔루션.
4. 준비 96 잘 폴 리 프로필 렌 플레이트 Chemokine Ligand CXCL12 또는 조사 화합물을 포함 하
- 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 (PP) 96 잘 접시를 ( 재료의 표참조)를 가져옵니다.
- CXCL12의 재고 솔루션을 허용 (1 mg/mL)와 실시간에 equilibrate를 조사 화합물의 재고 솔루션
참고: CXCL12의 재고 솔루션 초순 0.01 %Tween20 보충 및 단일-사용 aliquots로-20 ° C에서 저장에 준비가 되어 있습니다. - 분석 결과 버퍼에서 CXCL12의 집중된 솔루션 x 5를 준비 (250 ng/mL와 같은 31.25 nM) 및 5 (분석 결과 버퍼)에 각 화합물의 농도 희석 배.
- 접시를 미리 정의 된 레이아웃에 따라 적절 한 96 잘 접시에 재고 솔루션을 분배. 분배 75 µ L/잘에서 CXCL12를 포함 하는 접시 ("chemokine 접시"), 분배 50 µ L/잘에 화합물 ("복합 플레이트")를 포함 하는 접시.
참고: 두 화합물 그리고 CXCL12 마침내 될 측정 판에 분배 시 5 배 희석. 그것은 또한 부정적인 제어 우물만 분석 결과 버퍼 chemokine 플레이트와 복합 플레이트 모두에 포함 된을 포함 하는 것이 중요. 또한 긍정적인 제어 웰 스 포함 되도록 해야 (즉, chemokine 접시에서 CXCL12 하지만 분석 결과 버퍼 복합 플레이트의 해당 우물에서 우물).
- CXCL12의 재고 솔루션을 허용 (1 mg/mL)와 실시간에 equilibrate를 조사 화합물의 재고 솔루션
5. 프로토콜 설정을 형광 Microplate 리더
참고:이 프로토콜에 사용 되는 형광 microplate 리더가 불린다 재료의 테이블에.
- 먼저, 형광 플레이트 리더의 쿨러 단위에 전환 하 고 자체 형광 판독기에 전환 합니다. 몇 분 동안 시작 하 고 시스템의 소프트웨어를 오픈 하자.
- 다음 단계를 포함 하는 드래그 앤 드롭 메뉴를 사용 하 여 분석 결과 프로토콜을 만듭니다.
- "설정" 상자에서 'Read_Mode' 여기 파장 선택: 470-495 nM; 방출 파장: 515-575 nM.
참고: 선택 된 파장은 Ca2 +와 함께 사용 하기에 적합-민감한 염료 fluo2. - 자동 장치의 소스 2 위치 시킨 복합 플레이트에 화합물의 혼합에 대 한 "TF와 믹스" (전송 액체) 상자 포함 (단계 6.4 참조). 자동으로 발음 하 고 세 번 혼합 각 잘 솔루션의 15 µ L을 선택 합니다. 20 µ L 액체 표면 아래에 피 펫 팁의 높이 조정 합니다. 포부와 분배 50 µ L/s의 속도 설정 합니다.
참고: 피 펫 팁의 높이 피 펫 팁 아래 왼쪽은 볼륨을 말합니다. 예를 들어, 복합 플레이트의 우물 포함 50 µ L, 높이 30 µ L의 액체 표면 아래 20 µ L에 해당 합니다. 믹스에 복합 솔루션, 혼합의 속도, 위치는 피 펫의 볼륨 팁, 중 고 믹싱 사이클 수가 모두 조정 될 수 있다 소프트웨어를 사용 하 여. - "전송 액체" 상자에서 각각의 그 20 µ L 정의 복합 플레이트에서 잘 측정 판으로 옮겨질 것 이다. 20 µ L에서 피 펫 팁을 위치 액체 아래 즉, 화합물의 열망 중 높이 30 µ L, 높이 60 µ L 측정 판에 분배 하는 동안에 표면. 50 µ L/s에서 포부의 속도 25 µ L/s에서 분배의 속도 설정 합니다.
참고: 복합 플레이트 포함 잘 당 솔루션의 50 µ L (단계 4.1.3 참조), 높이 30 µ L의 액체 표면 아래 위치 20 µ L에 해당 하는 따라서. 측정 판 잘 당 분석 결과 버퍼의 80 µ L를 포함 것 이다 (단계 6.3 참조), 60 µ L의 높이 팁의 비슷한 위치에 해당 하는 따라서. - "TF와 읽기" 버튼을 선택 합니다. 첫 번째 기간 동안 60 읽기 (형광 측정) 1 s. 정의 10 읽기 전에 측정 판에 화합물의 분배 기록과 50 읽고 나중의 읽기 간격 시간을 선택 합니다. 정의 읽기 간격 시간이 30 초 간격 및 18 읽습니다.
참고:이 단계 동안 형광 측정 됩니다 운동 (정의 된 시간 간격)에 대 한 ~ 총에서 10 분. - 세 번 프로토콜에 "세척 팁" 버튼을 포함 합니다. 각 세척 단계 내에서 유체 종류 선택: 액체 (초순) 또는 액체 B (70% 에탄올), 세척 주기 (1), 펌프의 수 속도 (빠른), 그리고 스트로크 (5) 각 중 수 세척 단계.
참고: 첫 번째 중 마지막 세척 단계 액체 A 사용 된다, B는 두 번째 세척 단계 액체 동안. - "일시 중지 Pipettor" 기능을 포함 합니다. 300에 대 한 일시 중지 pipettor 설정 s.
참고: 프로토콜에서이 단계를 포함 하 여 형광 판 리더 장치에 통합 되어, pipettor 머리 일시 중지 5 분에 대 한 프로토콜을 계속 하기 전에. - 장치의 소스 3 위치에 위치 하는 chemokine 접시에서 CXCL12 솔루션의 자동 혼합 수 있도록 "믹스와 TF" 상자 포함 (단계 6.4 참조). 자동으로 발음 하 고 세 번 혼합 각 잘 솔루션의 15 µ L을 선택 합니다. 포부와 혼합, 동안 액체 표면 아래 피 펫 팁 20 µ L를 배치 합니다. 포부와 분배의 속도 50 µ L/s 설정 됩니다.
참고: 비슷한 단계 5.2.2에 관해서는, 이러한 매개 변수를 조정할 수 있습니다. - 이후 "전송 액체" 상자에서 각 25 µ L 그 정의 chemokine의 격판덮개 측정 판에 전송 됩니다. 위치 팁 20 µ L 액체 아래 즉, 높이 55 µ L 75 µ L/잘 포함 된 chemokine 접시에서 열망 하는 동안에 표면 (단계 4.1.3 참조), 그리고 높이 80 µ L 측정 판에 분배 하는 동안에. 50 µ L/s에서 포부의 속도 25 µ L/s에서 분배의 속도 설정 합니다.
- "TF와 읽기" 버튼을 포함 합니다. 첫 번째 기간 동안 145 읽기 1 s. 정의 5 읽기 CXCL12 측정 판에 분배 하기 전에 기록 되 고 140 읽고 나중의 읽기 간격 시간을 선택 합니다. 6 s와 선택의 읽기 간격 시간으로 두 번째 간격 정의 20 읽기.
참고: 합쳐 전체 프로토콜에 걸쳐 243 읽기 (형광 측정) 기록: 78 단계 5.2.4 165 5.2.9 단계에서. - 5.2.5 단계, 프로토콜에 "세척 팁" 버튼 3 회를 포함 비슷합니다.
참고:이 단계는 프로토콜의 끝에를 포함 하 여 팁 다시 팁을 변경 하지 않고도 다른 분석 결과 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다 수 있습니다.
- "설정" 상자에서 'Read_Mode' 여기 파장 선택: 470-495 nM; 방출 파장: 515-575 nM.
- "단계 온도 설정" 버튼을 클릭 하 고 37 ° c.를 선택 하 여 37 ° C에서 소자의 온도 설정
6. 실행 형광 분석 결과
- 측정 후 접시는 인 큐베이 팅 45 분에 대 한 버퍼를 로드 (단계 3.1.5 참조), 접시를 뒤집어 여 버퍼를 제거 하 고 조직에 그것을 건조.
- 분석 결과 버퍼의 150 µ L/잘 추가 하 여 시드 셀을 세척 하 고 2 분 동안 품 어.
- 접시를 뒤집어 여 버퍼를 다시 제거 합니다. 멀티 채널 피 펫과 분석 결과 버퍼의 80 µ L/잘 추가 합니다.
- 그들의 적절 한 위치에 있는 장치에 모든 접시를 넣어: 소스 2 위치에서 복합 플레이트, 소스 3 위치에서 chemokine 플레이트 및 읽기 위치에서 측정 플레이트. 소스 1 팁 위치에 검은 팁의 상자를 넣어. 소자의 문을 종료 하 고 프로토콜을 계속 하기 전에 5 분 동안 품 어.
- 접시 위에 배경 상대 빛 단위 (RLUs) 및 형광 분산 결정 하 "프로토콜 신호 테스트" 버튼을 선택 합니다. 새 창이 팝업 됩니다. "신호 테스트"를 선택 합니다.
참고:이 단계 동안 배경 RLUs ICCD 카메라 형광 판독기 장치의 광학 구획에 통합에 의해 결정 됩니다. 이러한 RLUs의 Ca2 +여기에서 유래-민감한 염료 (fluo-2) 발광 다이오드 (Led)에 의해 (LED 출력 파장 470-495 nm). 8000-10000 RLUs의 값은이 응용 프로그램에 적합. RLUs 수 있습니다, 필요한 경우 수 적응 여기 강도 (가감 강도 선택), 또는 카메라 게이트 (선택 게이트 오픈) 변경 하 여. 접시 위에 분산 적으로 7.5% 미만 해야 합니다. - 8000-10000 RLUs의 배경 값 가져온 경우 "업데이트"를 선택 합니다. 저장 단추를 클릭 하 여 주요 프로토콜을 저장 합니다.
참고: 이렇게, 프로토콜 신호 테스트에서 설정은 진행 됩니다 주요 프로토콜. - "실행" 버튼을 누르면 분석 결과 실행 합니다.
7. 데이터 분석 및 품질
- 분석 결과 완료 된 후 시스템의 소프트웨어에서 "분석" 상자를 엽니다.
- "구성 수정"과 "베이스 라인에 응답"을 선택로 이동 합니다. 정의 1과 끝 측정 5;에 측정에서 시작 베이스 라인 1 말은 형광 측정 1와 5 사이 각 잘 계산 됩니다.
참고: 모든 추가 측정 특정에서 잘이 잘 전용 베이스 라인 1에 의해 분할 된다.- 베이스 라인 2 측정 83까지 측정 78에서 시작 하려면 정의 (CXCL12 측정 83 후 적절 하 게, 다시 평균 형광 계산 각 사이 잘 측정 78 83 고이 수정 계수는 다음 모든 측정에 적용 됩니다 측정 83)입니다.
- 체크 상자를 활성화 "백분율로 표시" 및 "배경 빼기".
- "구성 운동 감소"로 이동 합니다. CXCL12 유도 캘리포니아2 + 응답에 화합물의 억제 효과 평가 하려면 최대-최소 243 (즉, 최종 측정) 측정 84 (즉, 첫 번째 측정 후 CXCL12은 적절 하 게)에서 시작을 선택 합니다.
참고: 최대-최소 84 측정과 측정 사이의 기준선에 최소 및 최대 응답의 차이 선택 하 여 243 보고 됩니다. 측정 11 및 측정 78 사이 시작 최대-최소 선택 기준 1 기준으로 기준선에 최소 및 최대 응답의 차이 보고 됩니다. 이 값을 사용할 수 있습니다 화합물의 잠재적인 agonistic 활동 분석, 토론을 참조). - 데이터는 시스템의 소프트웨어 구상 될 것입니다. 필요한 경우 추가 분석 및 시각화 다른 일반적인 분석 소프트웨어 패키지에서에 대 한 원시 데이터를 내보냅니다.
- "구성 수정"과 "베이스 라인에 응답"을 선택로 이동 합니다. 정의 1과 끝 측정 5;에 측정에서 시작 베이스 라인 1 말은 형광 측정 1와 5 사이 각 잘 계산 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U87 세포내 캘리포니아2 + 동원에서 CXCL12 자극의 효과. CD4.CXCR4+ 와 U87입니다. CD4 세포 Ca2 + 동원 분석 결과와 평가 했다. 분석 결과 버퍼에 추가 되었습니다 (그림 1) 프로토콜의 첫 번째 pipetting 단계 동안 추가 됩니다 일반적으로 시험 화합물의 20 µ L, 대신 fluo-2 오전 로드 U87. CD4.CXCR4+ 측정 판에 셀. 단계에서 두 번째 분배, CXCL12의 다양 한 농도 (0.2-102.4 nM, 최종 농도) 측정 판에 적절 했다. 형광, 캘리포니아2 +의 방출의 복용량 의존 증가 복용량 의존 증가 보여주었다 (그림 2A). 여기, 부정적인 컨트롤 샘플 두 추가에 있는 분석 결과 버퍼만 측정 플레이트에 추가 되었습니다 그 우물을 나타냅니다 (즉, 0 nM CXCL12), 응답 (그림 2A)의 부재에 결과. 증가 양의 CXCL12 유도 (그림 2A) 동안 부패 하는 형광의 증가 수준. 이러한 데이터에서 복용량 응답 곡선 "최대-최소 응답 기준선에" (즉, CXCL12 추가 후 첫 번째 측정) 84 측정과 측정 243 사이 따라 생성 된 (즉,., 프로토콜에 최종 측정 ). 비선형 회귀를 사용 하 여 EC50 값 (즉, 절반 최대한 응답을 연상 하는 데 필요한 농도) 결정 했다 고 1.14에 해당 nM (그림 2B). 아니 형광 캘리포니아2 +-응답 했다 높은 농도 에서도 CXCL12, 의해 갖는 관련 (102.4 nM) 때 U87. CD4 세포 기능 CXCR4 식 부족 사용 되었다. 이 측정 CXCL12에 의해 갖는 수용 체 특이성을 보여 줍니다 (그림 2C).
이 세포 기반 분석 결과 특히 CXCR4을 대상으로 하는 작은 분자의 식별에 대 한 응용 프로그램 및 CXCL12 유도 Ca2 + 동원을 억제 수 있는 키입니다. 활성 화합물 (이 하 "조회 수")를 식별 하는 경우에, 그들은 더 화합물의 직렬 희석 테스트 하 고 좀 더 자세하게에서 억제 효능을 분석 하 여 특징 될 수 있습니다. 예를 들어, bicyclam AMD3100, 강력한 안티 hiv-1 활동21,22, 잘 설립 된 작은 분자 CXCR4 특정 수용 체 길 항 효과 그림 3에 나와 있습니다. AMD3100의 농도 시리즈 (n = 4, 1/3 희석 시리즈에서 1.37 nM 최종 농도까지 3 µ M) U87에 적절 했다. CD4.CXCR4+ 세포 프로토콜의 첫 번째 단계. 화합물은 다음 셀을 함께 품 어 수 ~ 10 분 동안 형광 신호는 지속적으로 기록 되었다. 6.4 다음 CXCL12의 nM (50 ng/mL, 최종 농도) CXCR4 중재 Ca2 + 동원을 유도 하는 동시에 세포 격판덮개의 모든 우물에 추가 되었습니다. AMD3100의 다른 희석이이 응답의 복용량 의존 저해 그림 3A에 표시 됩니다. 이 경우에, 다음 CXCL12의 그래프의 일부만 표시 됩니다. 네거티브 제어 (파란 선) 유일한 버퍼 분석 결과 (AMD3100, 아니 CXCL12 우물에 추가 가진 아무 사전 외피)에 적용 했다, 응답의 예상된 부족 결과로. 긍정적인 통제 (빨간 선)는 6.4에서 샘플에 해당 nM CXCL12 AMD3100의 이전 부 화 없이 우물에 추가 되었습니다 (그림 3A). 이러한 정의에 따라 부정적이 고 긍정적인 제어는 Z' 값이 분석이 결과에 일반적으로 0.5 ~ 1. 복용량 응답 곡선 비 선형 회귀 계산된 IC50 값 770.8로 인에 의해 생성 된 AMD3100의 억제 효능을 결정 하기 위해 nM (그림 3B). 추가 설명 하려면 비활성 화합물의 동작, maraviroc이이 실험에서 포함 되었다. Maraviroc은 특히 CC chemokine 수용 체 5 (CCR5) 그로 인하여 차단 억제는 작은 분자 (CCR5)-트로픽 에이즈-1 감염23 . 고 농도 (10 µ M 최종 농도) 에서도 화합물의 억제 효과가 없습니다 CXCR4 중재 Ca2 + 응답 (그림 3A)에 관찰 되었다.
마지막으로,이 Ca2 + 동원 분석 결과 다른 GPCRs, CC chemokine ligand 5 (CCL5)의 직렬 희석 공부에 적용할 수 있습니다 보여 주기 위해 CCR5에 대 한 내 인 성 ligand CCR5 표현 하는 셀에 추가 되었습니다 (U87. CD4.CCR5+) 정확 하 게 같은 실험 조건 및 하드웨어 설정을 사용 하 여. 복용량-의존 형광 캘리포니아2 + 응답 CCL5의 직렬 희석의 추가 후 설명 된다 (그림 3C). 또한,와 달리 CXCR4에 영향, 100 가진 사전 외피 maraviroc의 nM (최종 농도)이이 응답 (그림 3D)를 강력 하 게 저해.
그림 1: 분석 결과 워크플로의 도식 개요. 0 셀 분명 바닥 96 잘 접시 블랙 벽에서 시드 GPCR (이 경우 CXCR4)에 대 한 관심의 표현 고 하룻밤 37 ° C, 5% CO2에서 성장 된다. 주 1에서 형광 기반 Ca2 + 분석 결과 수행 됩니다. 셀은 처음 한 형광 캘리포니아2 +로드-민감한 염료 (fluo-2AM) 어둠 속에서 RT에서 45 분 동안 incubated 하 고. "Chemokine 판"과 "복합 플레이트" 준비 (PP 폴 리 프로필 렌 =). 염료를 로드와 함께 부 화, 후 시드 셀 분석 결과 버퍼 (150 µ L/잘) 후 80 µ L/잘 분석 결과 버퍼의 추가 함께 한 번 씻어 있습니다. 모든 접시는 다음 인 큐베이 팅 5 분 37 ° C에서 장치에 대 한 분석 결과 시작 하기 전에. 관심 (예를 들어, 작은 분자)의 화합물은 측정 격판덮개의 우물으로 원하는 농도에서 적절 하 게 그리고에 품 어 수 ~ 형광 지속적으로 측정 하는 동안 10 분. 다음, GPCR (여기 CXCL12)의 내 생 적인 주 작동 근의 고정된 농도 Ca2 + 릴리스 연상 추가 되 고 형광 시간이 지남에 따라 더 기록 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 주 작동 근 활동 CXCL12 CXCR4에의+ 세포와 감지 된 응답의 특이성. (A) U87 Ca2 + 동원에서 CXCL12의 복용량-의존 효과. CD4.CXCR4+ 세포입니다. (B) 측정 84와 243 복용량 응답 곡선 생성 된 계산 하는 EC50 값 사이의 기준선에 최대-최소 응답에 따라 (n = 4, ± SD를 의미). (C) U87에 적절 했다 때 응답이 CXCL12에 의해 유도 되었다. CD4 세포 CXCR4 부족입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 그림 CXCR4 CXCR4 길 항 제 (AMD3100)와 비 활성 화합물 (maraviroc)의 효과의+ 세포와 그것의 내 생 적인 주 작동 근, CCL5에 의해 CCR5의 활성화. (A) 복용량 의존 6.4를 추가 하 여 갖는 Ca2 + 동원에 AMD3100의 억제 효과 nM CXCL12 U87. CD4.CXCR4+ 세포입니다. Maraviroc (10 µ M 최종 농도)에서 CXCL12 유도 캘리포니아2 + 응답에 아니 억제 효과 보였다. 측정 84 243 사이 기준선에 최대-최소 응답 기준 (B), 억제 복용량 응답 곡선 생성 및 IC50 값 770.8 계산 했다 nM (n = 4, ± SD를 의미). (C) 복용량 의존의 내 생 적인 주 작동 근, CCL5에 의해 CCR5의 활성화. CCR5 중재 Ca2 + 응답 100 셀의 사전 외피에 의해의 (D) 저해 maraviroc의 nM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
캘리포니아2 +-동원 분석 결과 여기에 설명 된 이전을 식별 하 고 특성 수용 체 길 항 근 CXCR417를 대상으로 하는 유용한 도구가 될 표시 되었습니다. 그러나 그것은,,이 방법을 적용할 수 있는 일반적으로 그들의 활성화 시 cytosolic 캘리포니아2 + 릴리스를 실행 하는 다른 GPCRs의 큰 그룹에 CCR5 관련된 chemokine 수용 체에 대 한 볼 수 있듯이 예상. 반면 CCR5 경우 정확 하 게 같은 실험 조건 적용 될 수 있었다, 프로토콜 (예:도금에 휴대폰 번호, 형광 염료와 셀의 로드)의 여러 단계 필요가 있을 것 이다 다시 최적화를 분석 결과 전송 하기 전에 다른 GPCRs 유리한 신호 대 잡음 비율을 얻기 위하여. 여기에 중요 한 문제는 적당 한 체 외에서 세포 호스트의 관심 및 Ca2 + 통로 기능 결합 GPCR의 높은 수준의 표현을 허용 선택 이기도 합니다. CXCR4, 경우 인간의 세포종 U87 셀 때문에 선택 되었다: (1) CXCR7의 내 생 적인 표현의 부족 (관련된 chemokine 수용 체 CXCR4로 동일한 주 작동 근을 차지 하 고), (2) 자신의 능력을 Ca2 +CXCR4 활성화 하-신호 통로, (3) 형광 반응의 유리한 동적 범위와 Ca2 +세포의 로딩 후 얻은-민감한 염료, 그리고 (4) 분석 결과에 그들의 우수한 부착 플레이트 최소화 셀 절차에 걸쳐 소요. 이러한 매개 변수를 모두 각 소설 GPCR의 각 세포 식 시스템에 대 한 실험적으로 결정 해야 합니다.
다른 GPCR에 대 한 유사한 분석 결과 설정할 때 몇 가지 대체 단계 또는 프로토콜에 시 약 여겨질 수 있다. 예를 들어, 다른 캘리포니아2 +-이 프로토콜에서 사용 하는 대신 fluorophore (fluo-2)에 대 한 민감한 fluorophores (예를 들어, fluo-4, fluo-3)를 사용할 수 있습니다. 경우에 느슨하게 접착 셀, 셀의 세척 dislodging24셀을 최소화 하기 위해 노-세척 염료를 도입 하 여 생략할 수 있습니다. 또한, 세척 단계를 제외 하 고는 프로토콜에서 분석 결과 처리량 더욱 높일 것 이다. 이 분석 결과 세포 내 생 적인 표현의 CXCR4, 예를 들어 여러 종류의 인간 암 세포 라인10,25를 포함 하 여 보여주는 또한 수행할 수도 있지만 그것 언급 되어야는 안정적으로 transfected 세포와 높은 GPCR 라인 시간 동안 안정적으로 유지 하는 식 수준은 얻을 수 있습니다. 이 더 귀 착될 것 이다 발음 분석 결과 측정, 더 큰 창 고 일관 된 신뢰할 수 있는 데이터 해석에 대 한 오랜 동안 성능 시험. Endogenously 셀을 사용 하는 경우 CXCR4 표현 그것은 어려울 것 이다 훨씬 더이 결과 달성 하기 위해.
분석 결과의 주요 결점은 형광 측정에 의존. 따라서, autofluorescent 화합물 분석 결과 측정, 신뢰할 수 없는 데이터 해석으로 인해 분석에서 제외를 방해할 수 있습니다. 또한,이 Ca2 + 동원 분석 결과 이상적으로 사용 하 여 수행 심사 시스템 통합된 pipetting 시스템 표준화 된 혼합 수와 dispension 화합물 및 모든 측정 판에 수용 체 주 작동 근의 휴대 동시에 우물. 그러나 분석 결과,, 수 다른, 덜 비싼 형광 microplate 리더 운동 측정 기능을 갖춘 사용에 대 한 적응. 화합물 및 주 작동 근의 추가 다음 손으로 온 시간 증가 하 고 분석 결과 처리량을 낮춘 다는 멀티 채널 펫을 사용 하 여 수동으로 수행 해야 합니다. 또한, 특정된 시간 간격 내에 운동 분석 결과의 형광 측정의 유사한 수를 얻기 어려울 것 이라고 많은 microplate 리더 측정 신호 잘-의해-잘 모든 우물을 측정 하는 높은-엔드 상영 시스템 반면 달성 동시에.
수용 체 길 항 근 수용 체와 내 생 적인 주 작동 근 (CXCL12)에 의해 후속 활성화에 바인딩을 현재 방지 특별히 CXCR411,12를 대상으로 하는 화합물의 주요 카테고리를 형성 합니다. AMD3100, Ca2 + 동원 분석 결과의 성능을 설명 하는 데 사용 된 작은 분자 CXCR4 antagonists26의 가장 눈에 띄는 사례 중 하나입니다. 수용 체 길 항 근, 외 GPCR 다르게 신호를 조절 하는 분자 뿐만 아니라 일반적인 관심 인상. 이 분자에는 역 촉진제로 GPCR PAMs NAMs19,,2027등이 있습니다. 이 원고에서 설명 하는 분석 결과의 흥미로운 기능을 뿐만 아니라 식별할 수 있는 수용 체 길 항 제, 또한 촉진제 및 allosteric 변조기 이다. 그러나, 몇 가지 사소한 적응 분석 결과 및 제한을 고려 될 필요가 있다.
PAMs 및 NAMs 세 수용 체의 내 인 성 ligand에 의해 점령 orthosteric 바인딩 사이트에서 고유 수용 체 사이트에 바인딩합니다. PAMs 힘 및 수용 체의 내 인 성 ligand(s)의 효능을 강화 하는 반면 NAMs 억제 효능 및 내 인 성 ligand(s)19,20의 효능. PAMs 내장 주 작동 근 활동이 있다. 그들은 단지 존재는 생 주 작동 근, 소위 allosteric agonists 달리 활성화 됩니다. Allosteric GPCR 변조기 클래식 수용 체 길 항 근 임상 설정28,29에 적용 될 때 보다 더 적은 부작용을 연상 것이 있기 때문에 그들은 귀중 한 약리 도구. 우리의 분석 결과에 allosteric 촉진제는 CXCR4 뿐만 아니라 즉시 형광 신호의 일시적 증가 보여주고 것 이다+ 세포. 이 신호 수용 체 특이성 같은 분석 결과, 하지만 셀 CXCR4 부족에 동일한 화합물을 테스트 하 여 다음 결정 합니다. 특히 PAMs 심사 때 형광 Ca2 + 응답을 유도 하 생 주 작동 근의 낮은 농도 분석 결과에 사용 해야 합니다. 주 작동 근이 더 낮은 양의 작은 형광 신호 생성 됩니다, 하지만 그것은 추가 수용 체 자극을 감지 하는 더 큰 창을 떠난다. 일반적으로, 수용 체 자극의 EC10-EC30 값에 해당 하는 주 작동 근 농도30,31선택 됩니다. 증가 형광 측정 분석 결과의 첫 번째 단계는 PAM의 추가 발생 하지 것입니다. 그러나, 그것의 내 인 성 길 항 제와 수용 체의 후속 자극 후 형광 캘리포니아2 + 신호 증가할 것입니다. 마찬가지로, 한 남 주 작동 근 또한, 전에 형광 측정을 변경 하지 않습니다 하지만 추가 주 작동 근의 후 수용 체의 응답을 억제가. 따라서, 수용 체 길 항 제와는 남의 활동 프로필 비슷한 볼 것 이다. 그들은 둘 다 주 작동 근 추가 후 형광 반응의 억제에 발생 합니다. 따라서, 추가 실험 연구는 적에 게는 남 사이 감 별 하 요구 된다. 여기, 레이블이 없는 화합물의 고정 된 금액와 경쟁 하는 그것에 의하여 수용 체 바인딩 연구 CXCR417,32 바인딩 귀중 한 전략 사이는 길 항 제, 방지 하는 차별 될 수 있습니다 CXCL12 표시는 수용 체, 그리고 것입니다 그것은 동일한 수용 체 바인딩 사이트를 공유 하지 것으로 남에 바인딩에서 주 작동 근을 표시.
GPCRs의 ligand 독립적인 (또는 기저 또는 제정) 활동 GPCRs recombinantly 표현 기저 활동의 수준 보다 낮은 일반적으로 비록 수많은 GPCRs33 관찰 되었습니다27. 기저 GPCR 활동은 자연스럽 게 발생에 의해 강화 될 수 있다 돌연변이33 및 선도 활동 하고있다 증가 기저 CXCR4 포인트 돌연변이 설명 이전34. 고 효 모에 페로몬 응답 통로에 constitutively 활성이 CXCR4 돌연변이 커플링 [35S] GTPγS 바인딩 실험에 의해, 그것은 표시 했다 그 T140, 강력한 반대로 HIV 활동17,35 펩타이드 기반 CXCR4 적 이 기저 활동을 크게 감소 하 고 따라서 반대 주 작동 근34로 행동을 표시 했다. 메모의 Fura 2 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 동일한 저자 관찰에 캘리포니아2 +작은 과도 감소-관련된 형광 T140의 추가 표현 돌연변이 CXCR4, 기저의 감소를 제안 하는 셀에 다음과 같은 수용 체 활동34 그러나, 순환 pentapeptide 기반 CXCR4 역 촉진제의 추가 패널 분석 T140에서 설계, 캘리포니아2 + 동원 분석 결과 감소 기저 활동의 탐지 덜 간단36이었다. 이 원고에 설명 된 대로 Ca2 + 동원 분석 결과 사용 하 여 야생 타입 CXCR4 표현 하는 셀에 T140의 효과 분석 때 기저 형광 신호에 변화17을관찰 되었다. 또한, 형광 동요는 빠르고 과도 하 고 기저 캘리포니아2 + 의 증가, 예를 들어, 관찰 되지 않는 constitutively 활성 Gαq을 표현 하는 셀에-결합 수용 체4. 함께 찍은, 역 촉진제의 효과 파악 하 고 우리의 분석 결과 함께 안정적으로 평가 불가능 한 경우, 매우 어려운 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 에릭 Fonteyn과 Geert Schoofs 우수한 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 일 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 (no를 부여 합니다. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, no를 부여. G.485.08), 그리고 Fondation Dormeur 파두츠.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).
