Summary
O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca2 + lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.
Abstract
G receptores (GPCRs) são de grande importância para a indústria farmacêutica como eles estão envolvidos em muitas doenças humanas e incluem metas bem validadas para a intervenção terapêutica. Descoberta de compostos de chumbo, incluindo pequenas moléculas sintéticas, que inibem especificamente a função do receptor, é um passo inicial importante no desenvolvimento de drogas e se baseia em ensaios de cell-based sensíveis, específicos e robustos. Aqui, descrevemos um ensaio cinético de celular com um visor fluorescente projetado principalmente para identificar os antagonistas de receptores específicos que inibem o intracelular Ca2 + lançamento evocado mediante a ativação do receptor chemokine CXC 4 (CXCR4) por seu ligante endógeno, o ligante de chemokine CXC 12 (CXCL12). A principal vantagem deste método é que ele também permite o rastreio dos compostos dotados de propriedades intrínsecas de agonísticos (ou seja, compostos, provocando um aumento de Ca2 + concentração intracelular na ausência de CXCL12) ou compostos função do receptor através da interação com sítios de ligação alostéricos de modulação (ou seja, moduladores alostéricos positivos e negativos (PAMs e NAMs, respectivamente)). No lado de baixo, autofluorescent compostos podem interferir com a leitura do ensaio, prejudicando, assim, interpretação de dados fiáveis. Muito provavelmente este ensaio pode ser implementado, com mínimas adaptações, como um ensaio de descoberta de medicamentos genéricos para muitos outros GPCRs cuja a ativação leva à liberação de Ca intracelular2 +.
Introduction
GPCRs são uma importante superfamília de proteínas de superfície celular que ativam cascatas de transdução de sinal com ligação ligante extracelular. Eles podem ser ativados por uma grande variedade de estímulos, incluindo hormônios proteicos, peptídeos, aminas biogênicas e lipídios, o que resulta no início de diversas vias de sinalização intracelulares e respostas biológicas eventualmente1,2 . Além disso, GPCRs estão envolvidos em muitos, se não todos, processos fisiológicos e de desenvolvimento e muitas doenças humanas são associadas com superexpressão de sinalização ou receptor GPCR disfuncional. GPCRs são, portanto, entre os alvos farmacológicos mais validados em medicina1,3.
Normalmente, um fluxo de trabalho de descoberta de drogas GPCR começa com ensaios de rastreio celular permitindo a identificação de compostos como pequenas moléculas, anticorpos monoclonais e peptídeos que podem modular a atividade de um determinado GPCR. Na descoberta da droga GPCR muitos tipos diferentes de ensaios existem para pesquisar por tais compostos, a maioria dos quais são compatíveis com campanhas de meados - a seleção da elevado-produção. Os ensaios mais utilizados incluem experiências de ligação do receptor, fluorescência ou luminescência com base em ensaios de detecção de flutuações no nível dos chamados mensageiros secundários (por exemplo, Ca2 +, adenosina monofosfato cíclica (AMP)), fenotípicos ensaios de triagem e recrutamento de β-arrestin ensaios4. A escolha de um determinado tipo de ensaio pode depender de vários fatores, mas também é determinada pelo conhecimento prévio das propriedades de sinalização de um determinado GPCR. Agonista obrigatório para um GPCR induz uma mudança conformacional catalisar a troca de difosfato de guanidina (PIB) para trifosfato de guanidina (GTP) sobre a subunidade α-de proteínas via G. Posteriormente a subunidade de -GTP Gαdissocia-se da subunidadeβγ de G... e as duas subunidades iniciará novas vias de sinalização. Hidrólise da molécula de GTP e subsequente re-associação da Gα- PIB e Gβγ subunidades irão restaurar a proteína G em sua conformação inativa5,6. Com base na similaridade da sequência de subunidadeα G são definidos diferentes tipos de proteínas G (G,s, G,eu, Gq, G12/13)7. Sinalização através da Gα subunidade dá origem a várias respostas típicas, tais como o aumento (via Gs) ou diminuir (via Geu) de produção de AMP cíclico e Ca2 + mobilização intracelular (via Gq)5 ,7. Gβγ subunidades são também capazes de induzir vias efetoras intracelulares. Por exemplo, após a ativação de Geu-GPCRs acoplados, Gβγ diretamente podem estimular a fosfolipase C (PLC-β) para produzir o inositol trifosfato (IP3) que provoca a liberação de Ca2 + do intracelulares lojas7 . Após a ativação do receptor, GPCRs são fosforiladas por quinases GPCR (GRKs), que promove a interação com β-arrestins. Este processo termina a sinalização de proteína G e leva a internalização e, eventualmente, a dessensibilização do receptor. Β-arrestins também são capazes de formar complexos multi moleculares que podem desencadear outras vias de sinalização independentes da proteína G sinalização8.
Dentro da subfamília de chemokine receptores, o Geu-CXCR4 acoplado é um GPCR que suscitou muito interesse como um alvo promissor para a descoberta de medicamentos. Dado seu papel estabelecido como um grande receptor de co para vírus de imunodeficiência humana 1 (HIV-1) entrada viral e infecção, compostos visando CXCR4 foram inicialmente desenvolvidos como anti-VIH droga candidatos9. Mais recentemente, um conjunto crescente de evidências tem apontado um papel importante para CXCR4 em metástase tumorigênese e câncer, tornando-se um alvo terapêutico bem validado em Oncologia também10. CXCR4 é altamente expressa em mais de vinte tipos de câncer humano e sobrevivência de células de tumor de controles, proliferação e migração, bem como relacionados ao tumor angiogênese10. Antagonistas de CXCR4 de diferentes classes químicas anteriormente foram descritos11,12, mas só a pequena molécula que AMD3100 atualmente é aprovado para uso na clínica como um agente de mobilização de células-tronco utilizado durante o tratamento de linfoma e pacientes de mieloma13,14. Ensaios clínicos estão em andamento para avaliar a segurança e a eficácia dos vários outras antagonistas de CXCR4 em diferentes doenças humanas, mas com um forte foco na oncologia12. Tendo em conta as muitas aplicações potenciais para CXCR4 antagonistas, a busca de novos compostos com propriedades farmacocinéticas melhoradas, melhor biodisponibilidade ou potencialmente menos efeitos colaterais é garantida.
Neste documento, um ensaio de celular baseado em fluorescência cinético usada principalmente para tela para compostos capazes de inibir o CXCR4 é descrita. A medição fluorescente desse método baseia-se o aumento transiente de Ca2 + concentração intracelular evocado após a ativação de CXCR4 pelo seu agonista endógena, o ligante de chemokine CXCL12 (anteriormente conhecido como células do estroma derivadas fator 1 α ( SDF1-α)) e a inibição de potencial desta resposta2 + Ca CXCL12-induzida por compostos particulares. Neste ensaio, células de glioblastoma humano u-87 estàvel expressando o receptor CXCR4 humano são utilizadas. Ao mesmo tempo, estas células faltam expressão endógena de CXCR7, um receptor do chemokine relacionados que também vincula CXCL1215,16,17. CXCR7 anteriormente também foi mostrado para ser capaz de formar heterodímeros com CXCR4, desse modo, modulando as propriedades sinalização deste último receptor18. Flutuações no nível de intracelular Ca2 + mediada por CXCR4 são monitoradas por carregar o CXCR4+ células com éster acetoximetil fluo-2 (AM), uma célula-permeável de alta afinidade fluorescente Ca2 +-vinculação a tintura. Fluo-2 AM é uma molécula fluorescente único comprimento de onda que pode ser excitada em 490 nm, enquanto sua emissões a fluorescência é medida em 520 nm. Esta fluorescência de emissão aumenta em cima de Ca2 + ligação, com um grande alcance dinâmico entre a Ca2 +-vinculado e não vinculado a estado. O aumento do sinal fluorescente é transitório, ocorrendo dentro de um intervalo de tempo de alguns minutos e irá decair depois. A altura da emissão fluorescente mais correlaciona-se com o nível de ativação do receptor. O ensaio em si é executado usando um leitor de microplacas de fluorescência equipado com uma câmera CCD intensificou-se (ICCD) que possui um sistema de pipetagem integrado que permite a padronização das etapas pipetagem no ensaio (ver Tabela de materiais) . Além disso, a medição simultânea do sinal fluorescente em todos os poços de uma microplaca é outra grande vantagem do leitor de fluorescência que é usado. Durante a primeira parte do ensaio os compostos sob investigação (por exemplo, um painel de pequenas moléculas com uma concentração fixa ou em uma série de diluição) são adicionados à AM fluo-2 carregado CXCR4+ u-87 células seguiram por um ~ período de incubação de 10 min durante o qual o potencial efeito agonístico dos compostos é continuamente medido em tempo real. Em seguida, o agonista endógeno (i.e., CXCL12) é adicionado às células para evocar um aumento transiente CXCR4-mediada do nível intracelular Ca2 +. Durante esta parte do ensaio pode ser avaliada a potencial atividade antagonista dos compostos testados. Uma visão esquemática do fluxo de trabalho geral do ensaio é apresentada na Figura 1.
Embora este ensaio de Ca2 + mobilização tem sido usado principalmente para identificar e determinar a potência inibitória dos antagonistas competitivas de CXCR4 (ou seja, compostos que impedem que o agonista endógeno para vincular e estimulam o receptor), também pode identificar agonistas dos receptores e, além disso, os compostos que exercem sua função por ligação alostéricos locais (ou seja, sites que topograficamente diferem o sítio de ligação do orthosteric ocupado pelo agonista endógeno). Exemplos desta última categoria de compostos agonistas alostéricos e PAMs e NAMs19,20. Considerando que os antagonistas dos receptores específicos, bem como NAMs iria inibir a resposta2 + Ca induzida por CXCL12, PAMs aumentaria essa resposta (Veja também discussão seção). Embora o ensaio aqui descritos especificamente metas CXCR4, prevê-se que este método pode ser aplicado a outros GPCRs com esforço de otimização mínima, pelo menos se eles sinal através do lançamento do intracelular Ca2 +.
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Protocol
Nota: Todos os passos descritos nas seções 1 e 2 são realizados em condições estéreis em um fluxo laminar.
1. manutenção do u-87. Células CD4.hCXCR4
- Crescem as células em frascos de cultura T75 em 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada.
Nota: A linha celular em vitro utilizada neste protocolo é uma linhagem de células de glioblastoma u-87 estàvel expressando cluster de diferenciação 4 (CD4) e humanos CXCR4 e tem sido descrito anteriormente17. Expressão de superfície celular de CD4 e CXCR4 é continuamente monitorado por citometria de fluxo e os níveis de expressão permanecem constantes ao longo do tempo (~ 100% CD4+ e ~ 100% CXCR4+ células). Uma descrição detalhada da geração da linha celular usado e do processo de citometria de fluxo para investigar os níveis de expressão do receptor não é no âmbito do presente protocolo.- Células de subcultura a confluência de 80-85%. Permitir que todos os reagentes atingirem a temperatura (RT) antes de cultivo celular.
- Retire o meio de cultura condicionado as células e lave a monocamada de células uma vez com soro fisiológico 5 mL tamponado fosfato (PBS).
- Adicionar 3 mL de 0,25% do trypsin-EDTA e distribuí-lo uniformemente sobre a monocamada de células. Em seguida retirar o excesso de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C até 5 min até as células começam a separar.
- Adicione 10 mL de meio fresco crescimento completo (de Dulbecco médio (DMEM modificado águia) + 10% de soro Fetal bovino (FBS) + 0,01 M HEPES + agentes de seleção apropriada). Ressuspender as células pipetando delicadamente acima e para baixo. Transfira a suspensão de células para um tubo estéril 50 mL.
- Conte o número de células viáveis, utilizando um método de escolha. No caso de células de glioblastoma u-87, viabilidade geralmente atinge ~ 100%.
Nota: Número de células pode ser determinado de várias maneiras. Rotineiramente usamos um sistema de análise de célula automatizado baseado em trypan azul coloração (ver Tabela de materiais) de acordo com seu padrão de manipulação, procedimentos, mas outras maneiras deve funcionar igualmente bem. - Adicionar 2 x 106 ou 3 x 106 células (viáveis) para um volume final de 25 mL de meio de crescimento fresco em um frasco de cultura T75 e incubar a 37 ° C e 5% de CO2.
Nota: Se 3 x 106 células são usadas as células chegará a confluência de 80-90% depois de 2 dias. Se 2 x 106 células são usadas, eles atingem a mesma confluência após 3 dias. A taxa de crescimento das células primeiro deve ser determinada empiricamente se outras linhas de célula são usadas.
2. a propagação das células para o ensaio de Ca2 + mobilização
- No dia da célula passagem (dia 0), casaco preto de paredes poliestireno placas 96 poços com espaço livre inferior (veja Tabela de materiais) com uma solução de gelatina de 0,1% para facilitar a fixação da célula.
Nota: Revestimento das placas de 96 poços, com gelatina pode ser omitido se pré-revestida placas, que estão comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais), são usados. Recomenda-se avaliar o uso de placas pré-revestidas em vez de revestimento manual para cada linhagem celular sob investigação antes de continuar com o protocolo.- Prepare a solução de gelatina, adicionando 1 g de gelatina para 100 mL de PBS para obter uma solução de 1%. Dilua de 10 x com PBS antes de nova utilização. Para melhorar a solubilidade de gelatina, aquecer a solução a 37 ° C.
- Adicione 100 µ l da solução de gelatina 0,1% por poço da placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal. Incubar durante 2 h em RT.
- Entretanto, prepare as células para semeadura em placa de 96 poços revestida.
- Separar as células do frasco de cultura, resuspenda-los em meio de cultura fresco e contá-las usando trypan azul método de coloração.
- Gire para baixo as células em um tubo de 50 mL durante 5 min à x 400g no RT
- Ressuspender as células em meio de cultura fresco (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, sem antibióticos) para obter uma densidade de células de 0,1 x 10 (viável)6 células/mL.
- Retire a solução de gelatina as chapas de parede preto com fundo transparente por capotar a placa e secá-lo em um tecido. Adicione 200 µ l/poço PBS para remover o excesso gelatina e vire a placa novamente.
- Dispense a 200 µ l de suspensão de célula (correspondente a 0,2 x 105 células) por poço da placa de 96 poços revestidos de gelatina (a partir de agora um esta placa será ainda mais referido como a "placa de medição").
- Incube a placa durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
3. carregamento das células com uma fluorescente de Ca2 + -corante sensível
- No dia 1, executar o real Ca2 + mobilização ensaio, começando com o carregamento das células semeados com a fluorescente Ca2 +-ligação tingir fluo-2h.
- Prepare-se buffer de ensaio, adicionando 40 mL HEPES (1m) para equilibrada solução 200 mL do Hank salina (HBSS, 10 x, sem vermelho de fenol, sem bicarbonato de sódio). Adicione água ultrapura para obter um volume final de 2 L e adicionar 4 g de albumina de soro bovino (BSA). Dissolva a BSA através de agitação magnética. Ajustar o pH para 7,4 (com NaOH) e filtrar a solução.
Nota: Durante todas as etapas a seguir a mesma reserva, referida como "buffer de ensaio", é usada. - Prepare uma solução stock (4 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) do fluorescente Ca2 +-sensível tingir fluo-2h. Evite a exposição excessiva à luz. Dissolver 1 mg fluo-2 AM (peso molecular: 1.061 g/mol) em 235.6 µ l DMSO.
- Prepare uma solução de trabalho de fluo-2h. Para uma placa de 96 poços ensaio misturar 12,5 µ l de solução-mãe de AM fluo-2 (4 mM) e solução de poliol (por exemplo, pluronic f-127) 12,5 µ l surfactante não iônico (20% peso/volume em DMSO, consulte Tabela de materiais). Adicione 22 µ l desta mistura para 11 mL de tampão de ensaio em um tubo de 15 mL. A concentração final de fluo-2h é 4 µM.
Nota: O surfactante não iônico é usado como um agente de dispersão para melhorar a solubilidade aquosa de fluo-2 AM e, em consequência, para melhorar o carregamento do celular. Para solubilizar surfactante em DMSO, aquece a amostra a 37 ° C e mistura regularmente para obter uma solução homogénea. - Remova o meio de crescimento de células previamente semeadas em placa de 96 poços de medição por capotar a placa e secá-lo em uma toalha de papel.
- Adicione 100 µ l de solução corante por bem, usando uma pipeta multicanal de carregamento e incubar durante 45 min a RT no escuro.
- Prepare-se buffer de ensaio, adicionando 40 mL HEPES (1m) para equilibrada solução 200 mL do Hank salina (HBSS, 10 x, sem vermelho de fenol, sem bicarbonato de sódio). Adicione água ultrapura para obter um volume final de 2 L e adicionar 4 g de albumina de soro bovino (BSA). Dissolva a BSA através de agitação magnética. Ajustar o pH para 7,4 (com NaOH) e filtrar a solução.
4. preparação de polipropileno de 96 poços placas contendo o ligante Chemokine CXCL12 ou os compostos sob investigação
- Obter placas de 96 poços de polipropileno (PP) fundo redondo (ver Tabela de materiais).
- Permitir que a solução-mãe de CXCL12 (1 mg/mL) e a solução dos compostos sob investigação para equilibrar no RT
Nota: A solução-mãe de CXCL12 é preparada em água ultrapura suplementado com 0.01% Tween20 e armazenado a-20 ° C como alíquotas de uso único. - Preparar uma solução concentrada de CXCL12 no buffer de ensaio de 5x (250 ng/mL, o que equivale a 31.25 nM) e um 5 x concentrada diluição de cada composto (no buffer de ensaio).
- Dispense as soluções estoque em placa de 96 poços apropriada de acordo com um layout de placa predefinidos. Dispense a 75 µ l/poço em placa contendo CXCL12 (a "chapa do chemokine"), dispense a 50 µ l/poço em placa contendo os compostos (a "placa composta").
Nota: Os dois compostos e CXCL12 vai finalmente tornar-se diluído x 5 em cima da placa de medição de distribuição. Também é importante incluir poços de controlo negativo, contendo apenas o buffer de ensaio em tanto a placa composta, bem como a placa do chemokine. Também poços de controle positivo precisam ser incluído (ou seja, poços com CXCL12 da placa do chemokine, mas com buffer de ensaio nos poços da placa composto correspondentes).
- Permitir que a solução-mãe de CXCL12 (1 mg/mL) e a solução dos compostos sob investigação para equilibrar no RT
5. protocolo definições sobre o leitor de microplacas de fluorescência
Nota: O leitor de microplacas de fluorescência usado neste protocolo é referido na Tabela de materiais.
- Ligar o aparelho refrigerador do leitor de placa de fluorescência primeiro e em seguida ligue o leitor de fluorescência em si. Deixe iniciar por alguns minutos e abrir o software do sistema.
- Crie o protocolo do ensaio, usando o menu de arrastar-e-soltar que inclui as seguintes etapas:
- Na caixa "Configurações", selecione 'Read_Mode' com comprimento de onda de excitação: 470-495 nM; comprimento de onda de emissão: 515-575 nM.
Nota: Os comprimentos de onda selecionados são apropriados para uso com o Ca2 +-fluo2 de corante sensível. - Incluem a caixa de "Mix com TF" (fluido de transferência) para mistura automática dos compostos no prato composto, que será colocada na posição de fonte 2 do dispositivo (consulte a etapa 6.4). Selecione 15 µ l de solução em cada poço automaticamente ser aspirado e misturado três vezes. Ajuste a altura das pontas de pipeta em 20 µ l, abaixo da superfície líquida. Defina a velocidade de aspiração e dispensação em 50 µ l/s.
Nota: A altura das pontas de pipeta refere-se ao volume que sobrou por baixo as pontas de pipeta. Por exemplo, se os poços de uma placa composta contém 50 µ l, uma altura de 30 µ l corresponde a 20 µ l, abaixo da superfície líquida. O volume de solução composta levado para misturar, a velocidade de mistura, a posição da pipeta dicas durante a mistura, e o número de ciclos de mistura pode tudo ser ajustado usando o software. - Na caixa de "Transferência de fluído", define que 20 µ l de cada poço da placa de compostos será transferido para a placa de medição. Posicione as pontas de pipeta em 20 µ l abaixo o líquido de superfície ou seja, na altura 30 µ l durante a aspiração dos compostos e na altura 60 µ l durante a dispensação da placa de medição. Defina a velocidade de aspiração em 50 µ l/s e a velocidade de dispensar a 25 µ l/s.
Nota: A placa composta contém 50 µ l de solução por alvéolo (consulte a etapa 4.1.3), assim, uma altura de 30 µ l corresponde a abaixo da superfície líquida, µ l uma posição 20. A placa de medição irá conter 80 µ l de buffer de ensaio por alvéolo (consulte a etapa 6.3), assim, uma altura de 60 µ l corresponde a uma posição similar das dicas. - Selecione o botão de "Leitura com TF". Durante o primeiro intervalo, selecione 60 leituras (medições fluorescentes) com um tempo de intervalo de leitura de 1 s. definir que 10 leituras são registadas antes do fornecimento dos compostos na placa de medição, e 50 lê depois. Definir o intervalo de segundo com um tempo de intervalo de leitura de 30 s e 18 leituras.
Nota: Durante esta etapa de fluorescência será medida cineticamente (com os intervalos de tempo definido) para ~ 10 min no total. - Inclua o botão "Dicas de lavagem" no protocolo de três vezes. Dentro de cada etapa de lavagem, selecione o tipo de fluido: líquido (água ultrapura) ou fluido B (70% de etanol), o número de ciclos de lavagem (1), a bomba de velocidade (rápido), e o número de traços (5) durante cada etapa de lavar.
Nota: Durante a primeira e última lavagem passo fluido A é usado, durante o segundo fluido de passo de lavagem que b é usado. - Incluem a função "Pausa pipeta". Definir a pipeta para pausar para 300 s.
Nota: Incluindo esta etapa no protocolo, a cabeça de pipeta, que está integrada no dispositivo do leitor de placa de fluorescência, fará uma pausa por 5 min antes de continuar o protocolo. - Incluem a caixa de "Mix com TF" para permitir a mistura automática da solução CXCL12 na placa chemokine, que será posicionada na posição 3 de fonte do dispositivo (consulte a etapa 6.4). Selecione 15 µ l de solução em cada poço automaticamente ser aspirado e misturado três vezes. Durante a aspiração e mistura, posicione a pipeta dicas 20 µ l abaixo da superfície líquida. A velocidade de aspiração e dispensação é fixada em 50 µ l/s.
Nota: Semelhantes quanto a etapa 5.2.2, estes parâmetros podem ser ajustados. - Na caixa de "Transferência de fluído" subsequente, definir que 25 µ l de cada bem do chemokine a placa vai ser transferida para a placa de medição. Posição 20 µ l de dicas abaixo o líquido de superfície ou seja, na altura 55 µ l durante a aspiração do chemokine prato que contém 75 µ l/poço (consulte a etapa 4.1.3) e na altura 80 µ l durante a dispensação da placa de medição. Defina a velocidade de aspiração em 50 µ l/s e a velocidade de dispensar a 25 µ l/s.
- Inclua o botão "Leitura com TF". Durante o primeiro intervalo, selecione 145 leituras com um tempo de intervalo de leitura de 1 s. definir que 5 leituras são registradas antes de dispensar CXCL12 na placa de medição, e 140 lê depois. Definir o intervalo de segundo com um tempo de intervalo de leitura de 6 s e selecione 20 leituras.
Nota: Tomados em conjunto, em todo o protocolo inteiro 243 leituras (medições fluorescentes) são registadas: 78 a passo 5.2.4 e 165 durante a etapa 5.2.9. - Semelhante ao passo 5.2.5, incluir o botão "Dicas de lavar" três vezes no protocolo.
Nota: Incluindo esta etapa no final do protocolo permite que as dicas podem ser reutilizadas para realizar mais um ensaio sem a necessidade de alterar as dicas.
- Na caixa "Configurações", selecione 'Read_Mode' com comprimento de onda de excitação: 470-495 nM; comprimento de onda de emissão: 515-575 nM.
- Regule a temperatura do dispositivo a 37 ° C, clicando no botão "Definir a temperatura de palco" e selecionando a 37 ° C.
6. execução do ensaio de fluorescência
- Após a medição placa tem incubado com buffer para 45 min de carregamento (consulte a etapa 3.1.5), remover o tampão por capotar a placa e seque-o em um tecido.
- Lavar as células semeadas adicionando 150 µ l/poço de buffer de ensaio e incubar por 2 min.
- Remova o tampão novamente por capotar a placa. Adicione 80 µ l/poço de buffer de ensaio com uma pipeta multicanal.
- Colocar o dispositivo em sua posição apropriada todos os pratos: o prato composto na posição de fonte 2, chapa de chemokine na posição de fonte 3 e a placa de medição na posição de leitura. Colocar uma caixa de pontas pretas na posição dicas fonte 1. Feche a porta do dispositivo e incubar durante 5 min antes de continuar o protocolo.
- Selecione o botão "Teste de sinal do protocolo" para determinar as unidades de luz relativo de fundo (RLUs) e a variância de fluorescência sobre a placa. Uma nova janela irá aparecer. Selecione "Teste de sinal".
Nota: Durante este passo, fundo RLUs são determinados pela câmera ICCD, que está integrada no compartimento de ótica do dispositivo do leitor de fluorescência. Estes RLUs resultam da excitação do Ca2 +-corante sensível (fluo-2) por (LEDs) de diodos emissores de luz (LED de saída comprimento de onda de 470-495 nm). Valores de 8.000-10.000 RLUs são adequados para esta aplicação. RLUs podem, se necessário, ser adaptados ao alterar a intensidade da excitação (selecione exc. intensidade), ou o portão de câmera (selecione portão aberto). A variação sobre a placa idealmente deve ser inferior a 7,5%. - Selecione "Atualização" se obtêm-se valores de fundo de 8.000-10.000 RLUs. Salve o protocolo principal clicando no botão salvar.
Nota: Ao fazer isso, as configurações do teste de sinal do protocolo serão feitas o protocolo principal. - Execute o ensaio pressionando o botão "Executar".
7. qualidade e análise de dados
- Após o ensaio terminou, abra a caixa de "Análise" no software do sistema.
- Vá para "configurar correções" e escolha "resposta ao longo da linha de base". Definir a linha de base 1 para iniciar na medida 1 e final de medição 5; a fluorescência média será calculada em cada poço entre 1 e 5 de medição.
Nota: Todas as medidas adicionais de um determinado bem são divididas por esta linha de base bem específicas 1.- Definir a linha de base 2 para iniciar a medição 78 até medição 83 (CXCL12 é dispensado após a medida 83; novamente a fluorescência média é calculada em cada bem entre fator de correção de medição 78 e 83 e este é aplicado a todas as medidas a seguir medida 83).
- Ative a caixa "mostrar como porcentagem" e "subtrair a fundo".
- Vá para "Configurar redução cinética". Para avaliar o efeito inibitório de compostos na resposta induzida por CXCL12 Ca2 + , escolha Max-Min, a partir de medição 84 (isto é, a primeira medida após o qual CXCL12 é dispensado) para 243 (ou seja, a medição final).
Nota: Escolhendo o Max-Min a diferença entre a mínima e máxima de resposta ao longo da linha de base entre medição 84 e 243 é relatado. Se o Max-Min é escolhido começando entre medição 11 e 78, a diferença entre a mínima e máxima de resposta ao longo da linha de base em relação à linha de base 1 é relatada. Esse valor pode ser usado para analisar a atividade agonística potencial dos compostos, veja a discussão). - Os dados vão ser visualizados no software do sistema. Se necessário, exporte os dados brutos para análise adicional e visualização em outros pacotes de software de análise comum.
- Vá para "configurar correções" e escolha "resposta ao longo da linha de base". Definir a linha de base 1 para iniciar na medida 1 e final de medição 5; a fluorescência média será calculada em cada poço entre 1 e 5 de medição.
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Representative Results
O efeito da estimulação CXCL12 na mobilização2 + Ca intracelular no u-87. CD4.CXCR4+ e u-87. Células CD4 foi avaliada com o ensaio de Ca2 + mobilização. Em vez de 20 µ l de composto de teste que normalmente seria adicionado durante a primeira etapa de pipetagem do protocolo (Figura 1), buffer de ensaio foi adicionado para o fluo-2AM carregado u-87. CD4.CXCR4+ células numa placa de medição. Durante a segunda etapa de distribuição, diferentes concentrações de CXCL12 (0.2-102,4 nM, concentração final) foram dispensados em placa de medição. Um aumento dose-dependente em fluorescência, correlacionando com um aumento dose-dependente da liberação de Ca2 +, é demonstrado (Figura 2A). Aqui, a amostra de controlo negativo representa os poços em que em ambas as adições apenas buffer de ensaio foi adicionado para a placa de medição (ou seja, 0 nM CXCL12), resultando na ausência de uma resposta (Figura 2A). Quantidades crescentes de CXCL12 induzem aumento dos níveis de fluorescência que deterioram ao longo do tempo (Figura 2A). A partir destes dados, uma curva de resposta de dose foi gerada com base na "Max-Min resposta ao longo da linha de base" entre medição 84 (isto é, a primeira medida após adição de CXCL12) e 243 (i. e., a medição final no protocolo ). Usando a regressão não-linear, o valor de50 CE (ou seja, a concentração necessária para evocar a resposta máxima metade) foi determinado e corresponde a 1.14 nM (Figura 2B). Não fluorescente Ca2 +-relacionado a resposta foi evocada por CXCL12, mesmo em alta concentração (102,4 nM), quando u-87. Utilizaram-se as células CD4 falta expressão funcional de CXCR4. Isto demonstra a especificidade do receptor da medição evocada por CXCL12 (Figura 2).
Uma chave para este ensaio baseado em pilha é a identificação de moléculas pequenas, alvejando especificamente CXCR4 e que foram capaz de inibir a mobilização de induzida por CXCL12 Ca2 + . Se compostos ativos ("batidas") são identificados, eles podem ser ainda mais caracterizados por testes de diluições em série do composto e analisando a potência inibitória mais detalhadamente. Como exemplo, o efeito da bicyclam AMD3100, um antagonista dos receptores bem-estabelecida pequena molécula CXCR4 específicos com potente atividade anti-HIV-121,22, é ilustrado na Figura 3. Uma série de concentração de AMD3100 (n = 4, 3 µM até concentração final de 1,37 nM em uma série de diluição de 1/3) foi dispensada na u-87. CD4.CXCR4+ células durante a primeira etapa do protocolo. O composto foi então autorizado a incubar com as células para ~ 10 min, durante o qual o sinal de fluorescência foi registrado continuamente. Então 6.4 nM de CXCL12 (50 ng/mL, concentração final) foi adicionado a todas as cavidades da placa da célula simultaneamente para induzir a mobilização de CXCR4-mediada Ca2 + . Inibição dose-dependente da resposta pelas diferentes diluições de AMD3100 é mostrada na Figura 3A. Neste caso, apenas a parte do gráfico após a adição de CXCL12 é mostrada. Como um buffer de controlo negativo (linha azul) só foi aplicado no ensaio (sem pré-incubação com AMD3100, nenhum CXCL12 adicionados aos poços), resultando na falta de resposta esperada. O controle positivo (linha vermelha) corresponde às amostras em qual 6.4 nM CXCL12 foi adicionada aos poços sem incubação prévia de AMD3100 (Figura 3A). Com base nestes definida positiva e negativa controla o Z' valor neste ensaio é normalmente entre 0,5 e 1. A fim de determinar a potência inibitória da AMD3100 uma curva dose-resposta foi gerada por regressão não-linear, resultando em um valor de50 IC calculado de 770.8 nM (Figura 3B). Para ilustrar ainda mais o comportamento de um composto não-ativa, maraviroc foi incluído neste experimento. Maraviroc é uma pequena molécula que inibe especificamente o receptor chemokine CC 5 (CCR5) bloqueando (CCR5)-Trópico de infecção de HIV-123 . Mesmo em alta concentração (concentração final de 10 µM) nenhum efeito inibitório deste composto foi observado na resposta mediada por CXCR4 Ca2 + (Figura 3A).
Finalmente, para demonstrar que este ensaio de Ca2 + mobilização também pode ser aplicado para estudar outros GPCRs, uma diluição serial do ligante de chemokine CC 5 (CCL5), o ligante endógeno para CCR5, foi adicionado para celulas que expressam CCR5 (u-87. CD4.CCR5+) usando exatamente as mesmas condições experimentais e as configurações de hardware. Uma dose-dependente fluorescente Ca2 + resposta é demonstrada após a adição de uma diluição serial de CCL5 (Figura 3). Além disso e em contraste com o seu efeito sobre o CXCR4, pré-incubação com 100 nM (concentração final) de maraviroc fortemente inibida esta resposta (Figura 3D).
Figura 1: visão geral esquemática do fluxo de trabalho do ensaio a. Dia 0 células expressando GPCR de interesse (no caso CXCR4) são semeados em placas de 96 poços paredes de preto com fundo transparente e são cultivadas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2. No dia 1 o ensaio2 + Ca baseado em fluorescência é executado. As células são primeiro carregadas com uma fluorescente Ca2 +-corante sensível (fluo-2h) e incubadas durante 45 min a RT no escuro. Um "chemokine" e "composta chapa" estão preparados (PP = polipropileno). Após a incubação com tintura de carregamento, semeado de células são lavadas uma vez com buffer de ensaio (150 µ l/poço) após o qual é adicionado a 80 µ l/poço de buffer de ensaio. Todas as placas são então incubadas por 5 min no dispositivo a 37 ° C antes de iniciar o ensaio. Então, compostos de interesse (por exemplo, pequenas moléculas) são dispensados na concentração desejada nos poços da placa de medição e permissão para incubar por ~ 10 min enquanto fluorescência é continuamente medida. Em seguida, uma concentração fixa do agonista endógeno do GPCR (CXCL12 aqui) é adicionada para evocar a liberação de Ca2 + e fluorescência é mais gravada ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Atividade de agonista de CXCL12 na CXCR4+ células e especificidade da resposta detectada. (A) o efeito dose-dependente de CXCL12 sobre a mobilização de Ca2 + no u-87. CD4.CXCR4+ células. (B) baseado sobre a resposta do Max-Min ao longo da linha de base entre medição 84 e 243 uma curva dose-resposta foi gerada e o valor de50 CE calculado (n = 4, média ± DP). (C) nenhuma resposta foi induzida por CXCL12 quando ela foi dispensada na u-87. Células de CD4 falta CXCR4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração do efeito de um antagonista de CXCR4 (AMD3100) e um composto não-ativa (maraviroc) na CXCR4+ células e ativação de CCR5 pelo seu agonista endógena, CCL5. (A) Dose-dependente efeito inibitório de AMD3100 sobre a Ca2 + mobilização evocado pela adição de 6.4 nM CXCL12 para u-87. CD4.CXCR4+ células. Maraviroc (na concentração final de 10 µM) não mostrou nenhum efeito inibitório na resposta induzida por CXCL12 Ca2 + . (B) com base na resposta ao longo da linha de base entre medição 84 e 243 Max-Min, uma curva dose-resposta inibitória foi gerada e o valor de50 IC foi calculado para ser 770.8 nM (n = 4, média ± DP). (C) Dose-dependente a ativação do CCR5 pelo seu agonista endógena, CCL5. (D) inibição da resposta mediada por CCR5 Ca2 + de pré-incubação das células com 100 nM de maraviroc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O Ca2 +-ensaio de mobilização aqui descrito anteriormente foi mostrado para ser uma ferramenta valiosa para identificar e caracterizar os antagonistas dos receptores CXCR417de direcionamento. No entanto, prevê-se que este método pode ser mais geralmente aplicado a um grupo grande de outros GPCRs que desencadeiam um citosólico Ca2 + lançamento após a sua ativação, conforme ilustrado pelo receptor relacionados chemokine CCR5. Considerando que, no caso de CCR5 poderiam ser aplicadas exatamente nas mesmas condições experimentais, várias etapas no protocolo (por exemplo, o número de telemóvel no chapeamento, carregamento das células com um corante fluorescente) terá de ser re-otimizado antes de transferir o ensaio de outros GPCRs para obter uma relação sinal-ruído favorável. Uma questão importante aqui é também a seleção de um adequado em vitro celular host permitindo a expressão de alto nível do GPCR de interesse e acoplamento funcional para a via de Ca2 + . Em caso de CXCR4, células de glioblastoma humano u-87 foram escolhidas por causa de: (1) a falta de expressão endógena de CXCR7 (um receptor chemokine relacionados que ocupa o mesmo agonista como CXCR4), (2) sua capacidade de ativação de CXCR4 para o Ca2 +um par-sinalização caminho, (3) a gama dinâmica favorável da resposta fluorescente obtida após o carregamento das células com o Ca2 +-corante sensível e (4) sua excelente aderência para o ensaio de placas minimizando células perturbação durante o procedimento. Todos estes parâmetros talvez precise ser determinado experimentalmente para cada novela GPCR de interesse e de cada sistema de expressão celular.
Quando configurar um ensaio similar de outro GPCR, vários passos alternativos ou reagentes no protocolo podem ser considerados. Por exemplo, outros Ca2 +-fluorophores sensíveis (por exemplo, fluo-4, fluo-3) pode ser usado como uma alternativa para o fluoróforo (fluo-2), usada no presente protocolo. No caso de células frouxamente aderidas, lavagem das células podem ser omitidas, introduzindo a não-lavagem corantes para minimizar a célula desalojar24. Além disso, excluindo a etapa de lavagem do protocolo aumentariam ainda mais taxa de transferência do ensaio. Embora este ensaio também pode ser realizado com células mostrando a expressão endógena de CXCR4, por exemplo, incluindo vários tipos de câncer humano célula linhas10,25, note-se que com células transfectadas estàvel linhas alta GPCR níveis de expressão que permanecem estáveis ao longo do tempo podem ser obtidos. Isso resultará em mais pronunciado medições de ensaio, uma janela maior para interpretação de dados fiáveis e consistente desempenho durante períodos mais longos de ensaios. Ao usar células endogenamente expressando CXCR4 será muito mais difícil de alcançar este resultado.
Um inconveniente principal do ensaio é que se baseia em uma medição de fluorescência. Daí, compostos de autofluorescent podem interferir com a medição do ensaio, que exclui-los da análise devido à interpretação de dados não confiável. Também, este ensaio de Ca2 + mobilização idealmente é executado usando um celular triagem sistema equipado com um sistema de pipetagem integrado que permite mistura padronizada e dispension de compostos e agonista do receptor na placa de medição em todos os poços simultaneamente. O ensaio pode, no entanto, ser adaptado para o uso com outros, menos leitores de microplacas caro fluorescência com capacidades de medição cinético. A adição de compostos e agonista então precisaria ser executada manualmente usando pipetas multicanais, o que aumentarão a hands-on-time e reduz a taxa de transferência do ensaio. Além disso, a obtenção de um número semelhante de fluorescência medições dentro de um intervalo de tempo determinado de um ensaio cinético seria difícil de alcançar, como muitos leitores de microplacas medem sinais bem por Considerando que sistemas high-end triagem medem todos os poços ao mesmo tempo.
Antagonistas dos receptores, impedindo a ligação para o receptor e o subsequente ativação pelo agonista endógeno (CXCL12) atualmente formam a principal categoria de compostos visando especificamente CXCR411,12. AMD3100, a molécula pequena que foi usada para ilustrar o desempenho do Ca2 + mobilização ensaio, é um dos exemplos mais proeminentes de CXCR4 antagonistas26. Além de antagonistas dos receptores, moléculas que regulam GPCR sinalização diferentemente criar interesse geral também. Essas moléculas incluem agonistas inversas, bem como GPCR PAMs e NAMs19,20,27. Uma característica interessante do ensaio descrito neste manuscrito é que ele não só pode identificar antagonistas dos receptores, mas também agonistas e moduladores alostéricos. No entanto, algumas pequenas adaptações para o ensaio e limitações precisam ser tomadas em conta.
PAMs e NAMs vinculam a sítios receptores topograficamente distintos do local de ligação do orthosteric ocupado por ligante endógeno do receptor. Considerando que o PAMs aumentar a potência e/ou a eficácia de ligand(s) endógena do receptor, NAMs inibem a potência e/ou a eficácia do ligand(s) endógeno19,20. PAMs não tem nenhuma atividade intrínseca do agonista. Eles só são ativos na presença do agonista endógeno, ao contrário dos chamados agonistas alostéricos. Porque moduladores alostéricos do GPCR evocaria menos efeitos colaterais do que a clássica antagonistas dos receptores quando aplicada em ambientes clínicos28,29, são valiosas ferramentas farmacológicas. No nosso ensaio, agonistas alostéricos evocaria um aumento transitório do sinal de fluorescência imediatamente após a adição para o CXCR4+ células. Especificidade do receptor deste sinal então deve ser determinada testando o mesmo composto com o mesmo ensaio, mas em células falta CXCR4. Quando especificamente triagem para PAMs, uma baixa concentração de agonista endógena deve ser usada no ensaio para induzir uma fluorescente Ca2 + resposta. Embora essa quantidade baixa de agonista irá gerar um sinal fluorescente menor, deixa uma janela maior para detectar a estimulação de receptores adicionais. Normalmente, uma concentração de agonista, correspondente ao valor de30 CE10- CE da estimulação do receptor é escolhida30,31. Adição de uma PAM durante a primeira parte do ensaio não resultaria em uma maior medida fluorescente. No entanto, o fluorescente Ca2 + sinal após estimulação subsequente do receptor com a agonista endógena aumentaria. Da mesma forma, um NAM não altera a medição fluorescente antes da adição do agonista, mas inibem a resposta do receptor após a adição do agonista. Portanto, o perfil de atividade de um antagonista do receptor e um NAM vai olhar similar. Eles ambos resultará na inibição da resposta fluorescente após adição do agonista. Portanto, mais estudos experimentais são necessários para discriminar entre um antagonista e um NAM. Aqui, estudos de ligação do receptor no qual compostos sem rótulo competem com uma quantidade fixa de rotulado CXCL12 para ligação em CXCR417,32 pode ser uma estratégia valiosa para discriminar entre um antagonista, que impeça a rotulado de agonista de ligação para o receptor e um NAM que não como isso não iria partilhar o mesmo sítio de ligação do receptor.
Actividade independente (ou basal ou constitutiva) ligante de GPCRs tem sido observada para numerosos GPCRs33 , embora o nível de atividade basal geralmente é bastante baixo quando GPCRs são expressos recombinantes27. Atividade basal do GPCR pode ser reforçada pela ocorrência natural de mutações33 e uma mutação de ponto, levando ao aumento basal CXCR4 atividade tem sido descrevem anterior34. Por acoplamento este mutante de CXCR4 constitutivamente ativo para o caminho de resposta de feromônio em leveduras e por experiências de vinculação de GTPγS [35S], foi mostrado que T140, um antagonista de CXCR4 baseado em peptídeo com potente anti-HIV atividade17,35 diminuiu significativamente esta atividade basal e, portanto, mostrou-se comportar como um agonista inverso34. De nota, um Fura-2 baseado em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio os mesmos autores observaram uma pequena diminuição transitória em Ca2 +-relacionada fluorescência após adição de T140 para células expressando mutante CXCR4, sugerindo uma diminuição de basal receptor atividade34. No entanto, quando analisar um painel adicional dos cíclicos baseados em pentapeptide CXCR4 inversas agonistas projetado da T140, detecção de reduzida atividade basal com um ensaio de Ca2 + mobilização foi menos simples36. Quando o efeito da T140 em celulas que expressam o tipo selvagem CXCR4 foi analisado usando o Ca2 + mobilização ensaio conforme descrito neste manuscrito, nenhuma mudança no sinal de fluorescência basal foi observada17. Além disso, as flutuações de fluorescência são rápidos e transitórios e aumento basal Ca2 + , por exemplo, não ocorram nas células expressando constitutivamente ativo Gαq-acoplados a receptores4. Tomados em conjunto, o efeito dos agonistas inversas seria muito difícil, se não impossível de identificar e avaliar de forma confiável com nosso ensaio.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Eric Fonteyn e Geert Schoofs excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo KU Leuven (conceder n. PF/10/018), o Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, conceder n. G.485.08) e a Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
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