Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Кинетическая на основе флуоресценции Ca2 + мобилизации Assay для определения G белка в сочетании рецепторов агонистов, антагонисты и аллостерический модуляторы

Published: February 20, 2018 doi: 10.3791/56780
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

Summary

Описанные сотовой assay предназначен для идентификации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4)-взаимодействующих агентов, которые подавляют или стимулировать, либо конкурсной или allosterically, внутриклеточный Ca2 + релиз, инициированных CXCR4 активации.

Abstract

G белок рецепторы (GPCR) имеют большое значение для фармацевтической промышленности, как они участвуют в многих болезней человека и включают в себя хорошо проверенных цели для терапевтической интервенции. Открытие соединений свинца, включая малые синтетические молекулы, которые специально препятствуют функции рецепторов, является важным первым шагом в разработке лекарств и опирается на чувствительных, конкретные и надежный анализов на основе ячеек. Здесь, мы описать кинетические сотовой пробирного с флуоресцентные индикация, предназначена главным образом для выявления рецептор специфических антагонистов, которые тормозят внутриклеточных Ca2 + релиз вызывали после активации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4) путем его эндогенного лиганда, КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12). Основным преимуществом этого метода является, что он также позволяет скрининг соединений, наделенных агонистических свойств (например, соединения, вызывая увеличение внутриклеточной Ca2 + концентрации в отсутствие CXCL12) или соединений Модулирует функции рецепторов через взаимодействие с аллостерический привязки сайтов (то есть, положительные и отрицательные аллостерический модуляторы (ПАМС и NAMs, соответственно)). С другой стороны autofluorescent соединений может мешать пробирного индикация, препятствуя интерпретации надежных данных. Скорее этот assay может осуществляться, с минимальной адаптации, как открытие assay дженериков для многих других GPCR, из которых Активация приводит к выбросу внутриклеточных Ca2 +.

Introduction

GPCR являются важным надсемейства клеток поверхности белков, которые активируют каскады трансдукции сигнала внеклеточных лигандов привязки. Они могут быть активированы широкий спектр стимулов, включая пептиды, белки гормоны, биогенные амины и липиды, что приводит к инициации различных внутриклеточных сигнальных путей и в конечном итоге биологических реакций1,2 . Кроме того GPCR участвуют во многих, если не все, развития и физиологических процессов и многих заболеваний человека связаны с неблагополучной GPCR сигнализации или рецептор гиперэкспрессия. GPCR, поэтому среди самых проверенных фармакологических целей в медицине1,3.

Как правило рабочий процесс обнаружения наркотиков ХВГФ начинается с сотовой скрининг анализов, способствующих выявлению соединений, таких как малые молекулы, моноклональных антител и пептиды, которые можно модулировать активность конкретного GPCR. В GPCR лекарств, что существует множество различных типов анализов для поиска таких соединений большинство из которых являются совместимыми с середины - для высокопроизводительного скрининга кампаний. Наиболее часто используемые анализы включают в себя эксперименты связывания рецептора, флуоресценции или свечения на основе обнаружения колебания уровня так называемых вторичных посыльных (например, Ca2 +, циклический аденозинмонофосфат (AMP)), фенотипические анализы отбор проб и β-arrestin набора assays4. Выбор для конкретного типа assay может зависеть от нескольких факторов, но также определяется предварительного знания, касающиеся сигнальных свойства данного GPCR. Агонист, привязка к ХВГФ вызывает конформационные изменения, катализирующих обмена дифосфат (ВВП) гуанидина для гуанидина трифосфата (GTP) на α-субъединица гетеротримерные G белков. Впоследствии Gα-GTP Субблок дистанцируется от субъединицаβγ G, и оба подразделения будут инициировать дальнейшие сигнальных путей. Гидролиз GTP-молекулы и последующего повторного ассоциации Gα- ВВП и Gβγ подразделений будет восстановить G-белка в ее неактивной конформации5,6. Основываясь на последовательность сходства субъединицы Gα определены различные типы G белков (Gs, G,i, Gq, G12/13)7. Сигнализации через Gα Субблок дает подняться несколько типичных ответы, такие как увеличение (через Gs) или уменьшить (через G,я) ЦАМФ производства и внутриклеточных Ca2 + мобилизации (через Gq)5 ,7. Gβγ субблоков могут также заставить внутриклеточные эффекторные пути. Например, после активации G,я-спаренных GPCR, Gβγ может непосредственно стимулировать фосфолипазы С (PLC-β) производить инозитол трифосфата (IP-3), который вызывает выпуск Ca2 + от внутриклеточного магазинов7 . После активации рецептора являются фосфорилированных GPCR, GPCR киназ (GRK), что способствует взаимодействию с β-arrestins. Этот процесс завершается G белка сигнализации и приводит к рецепторов десенсибилизации и в конечном итоге интернализации. Β-arrestins также возможность формирования различных молекулярных комплексов, которые могут вызвать другие сигнальные пути, независимо от сигнализации8G-белка.

В подсемейство хемокиновых рецепторов, Gя-спаренных CXCR4 является GPCR, вызвавший большой интерес как перспективные цели для обнаружения наркотиков. Учитывая ее созданы роль как основных ко-рецептор для вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1) вирусный вход и инфекции, соединений, ориентация CXCR4 были первоначально разработаны как анти-ВИЧ наркотиков кандидатов9. Совсем недавно растущее количество доказательств указал на важную роль для CXCR4 опухолей и рака метастаз, что делает его хорошо проверенных терапевтических цели в онкологии, а также в10. CXCR4 высоко выражается в более чем двадцати видов человеческих раковых и выживание клетки опухоли контроля, распространение и миграции, а также ангиогенез опухоли, относящиеся10. Антагонисты CXCR4 различных химических классов ранее были описаны11,,12, но только малые молекулы, которые AMD3100 в настоящее время одобрен для использования в клинике как агент мобилизации стволовых клеток, используемый во время лечения лимфомы и больных миеломой13,14. Клинические испытания проводятся для оценки безопасности и эффективности нескольких других антагонистов CXCR4 в различных заболеваний человека, но с особым упором на онкологии12. Учитывая многие потенциальные приложения CXCR4 антагонистов, поиск новых соединений с улучшенные фармакокинетические свойства, повышение биодоступности или потенциально меньше побочных эффектов является оправданным.

Здесь, кинетическая на основе флуоресценции сотовой пробирного главным образом используется для экрана для соединений, способных ингибирующих CXCR4 описан. Флуоресцентный измерение этого метода основано на преходящее повышение концентрации внутриклеточного Ca2 + вызывали после активации CXCR4 к его эндогенного агонист, хемокиновых лигандом CXCL12 (ранее известный как стромальные клетки получены фактор 1α ( SDF1-α)) и потенциальные ингибирование этой CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ конкретных соединений. В этот assay клетки человека глиобластома U87, стабильно выражая человека рецептор CXCR4 используются. В то же время эти клетки отсутствие эндогенного выражение CXCR7, связанной с хемокиновых рецепторов, которая также связывает CXCL1215,16,17. CXCR7 ранее также доказано быть способны формировать гетеродимерами с CXCR4, тем самым модуляции сигналов свойства этой последней рецептор18. Колебания уровня внутриклеточного Ca2 + опосредовано CXCR4 контролируются путем загрузки CXCR4+ клеток с эфира fluo-2 acetoxymethyl (AM), клетки проницаемой высоким сродством флуоресцентные Ca2 +-привязка красителя. FLUO-2 утра является одной длины волны флуоресцентные молекула, которая может быть возбужден в 490 Нм, в то время как его флуоресценции выбросов измеряется в 520 Нм. Этот флуоресценции выбросов увеличивает Ca2 + привязки, с большим динамическим диапазоном между Ca2 +-связанные и свободные государства. Увеличение флуоресцентного сигнала преходящими, происходящих в течение интервала времени несколько минут и потом будет распадаться. Пик высота Флуоресцентные выбросов еще коррелирует с уровнем активации рецептора. Сам генотипирования с помощью Считыватель микропланшетов флуоресценции, оснащена камерой активизировались CCD (ICCD), которая обладает интегрированной системы дозирования, которая позволяет стандартизация дозирования шаги в assay (см. Таблицу материалы) . Кроме того одновременное измерение флуоресцентного сигнала на всех скважинах Гонав является еще одним ключевым преимуществом флуоресценции Reader, которая используется. Во время первой частью соединений под следствием (например, группа малых молекул в фиксированной концентрации или в серии разрежения) добавляются к fluo-2 утра assay загружен CXCR4+ U87 клетки следуют ~ 10 мин инкубационный период во время которой потенциальные агонистических эффект соединений непрерывно измеряется в режиме реального времени. Затем, эндогенного агонистов (т.е., CXCL12) добавляется к клетки вызывают CXCR4-опосредованной преходящее повышение уровня внутриклеточного Ca2 +. В ходе этой части assay может оцениваться потенциальной антагонистической активности проверенных соединений. Схематический обзор общего процесса анализа представлена на рисунке 1.

Хотя этот Ca2 + мобилизации assay главным образом были использованы для выявления и определения ингибирующее потенции конкурентоспособных CXCR4 антагонистов (например, соединения, препятствующие эндогенного агониста для привязки и стимулировать рецептор), он также можно определить агонистами рецепторов и, Кроме того, соединения, прилагать свои функции путем связывания на аллостерический участках (например, сайты, которые топографически отличается от привязки сайта orthosteric, оккупирована эндогенного агонист). К последней категории соединений примеры аллостерический агонисты и пам и NAMs19,20. Тогда как антагонисты рецепторов конкретных, а также NAMs будет препятствовать CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ, СМУУ усилит этот ответ (см. также обсуждение раздела). Хотя assay описаного конкретно цели CXCR4, предполагается, что этот метод может применяться для других GPCR с минимальным оптимизации усилий, по крайней мере если они сигнала через освобождение внутриклеточных Ca2 +.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все шаги, описанные в разделах 1 и 2 проводятся в стерильных условиях в поток Ламинарный шкаф.

1. поддержание U87. CD4.hCXCR4 клетки

  1. Рост клеток в колбах T75 культуры при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.
    Примечание: В пробирке клеток линии используется в этот протокол является линия клеток глиобластомы U87, стабильно выражая Кластер дифференцировки 4 (CD4) и человека CXCR4 и был ранее описанных17. Поверхности выражение клеток CD4 и CXCR4 непрерывно контролируется проточной цитометрии и уровни выражения остаются неизменными с течением времени (~ 100% CD4+ и ~ 100% CXCR4+ клеток). Подробное описание поколения используется клеточной линии и процедуры потока цитометрии расследовать рецептор выражение уровня не находится в пределах сферы применения данного протокола.
    1. Субкультура клетки на 80-85% confluency. Разрешить все реагенты до комнатной температуры (RT) до культивирования клеток.
    2. Удалите с кондиционерами питательной среды из клеток и мыть монослое клеток с 5 мл фосфатный буфер (PBS).
    3. Добавить 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и распределить его равномерно по монослое клеток. Затем удалите избыток трипсина ЭДТА и инкубировать до 5 мин при 37 ° C, до тех пор, пока клетки начинают отсоединить.
    4. Добавьте 10 мл свежего полный рост средних (Дульбекко орла изменения среднего (DMEM) + 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) + 0,01 М HEPES + соответствующий выбор агентов). Ресуспензируйте клетки, нежно закупорить вверх и вниз. Суспензию клеток передавать стерильные 50 мл трубки.
    5. Подсчитать количество жизнеспособных клеток с помощью метода выбора. В случае клеток глиобластомы U87, жизнеспособность обычно достигает ~ 100%.
      Примечание: Числа клеток может быть определено несколькими способами. Мы регулярно использовать систему анализа автоматизированные ячейки, основанные на Трипановый синий окрашивание (см. Таблицу материалы) согласно его стандартная обработка процедуры, но другие манеры должны работать одинаково хорошо.
    6. Добавить 2 x 10-6 или 3 х 106 клеток (жизнеспособные) окончательный объем 25 мл свежего роста средних в колбе T75 культуры и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
      Примечание: Если используются 3 х 106 клеток клетки достигнет confluency 80-90% после 2 дней. Если используются 2 x 106 клеток, они будут достигать же confluency после 3 дней. Темпы роста клеток должны сначала определяться эмпирически, если используются другие клеточные линии.

2. Заполнение ячеек для Ca2 + мобилизации Assay

  1. На дне клетки пассированый (день 0), пальто со стенами черный 96-луночных плит с четкими снизу (см. Таблицу материалы) с 0,1% раствор желатина для облегчения клеток вложение.
    Примечание: Покрытие 96-луночных пластин с желатином может опустить, если предварительно покрытых плитами, которые являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы), используются. Рекомендуется оценить использование предварительно покрытых пластин вместо ручной покрытие для каждой ячейки строки под следствием продолжения с протоколом.
    1. Готовят раствор желатина, добавив 1 г желатина до 100 мл PBS для получения 1% раствора. Развести в 10 x с PBS перед дальнейшим использованием. Для повышения растворимости желатина, тепло решение 37 ° C.
    2. 100 мкл раствора 0,1% желатина на хорошо 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов. Проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
  2. В то же время готовить клетки для посева в 96-луночных пластины с покрытием.
    1. Отсоединить клетки от культуры колбу, Ресуспензируйте их в свежих роста среднего и считать их с помощью Трипановый синий окрашивания метода.
    2. Спин вниз клетки в 50 мл трубки 5 мин на 400 x g на RT.
    3. Ресуспензируйте клетки в свежих роста среднего (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, не антибиотики) для получения плотность клеток 0.1 x 106 (жизнеспособные) клеток/мл.
  3. Удалите раствор желатина из плит со стенами черный с четкой нижней, переворачивая пластину и сушки на ткани. Добавьте 200 мкл/хорошо PBS для удаления избыточного желатина и снова Переверните пластину.
  4. Отказаться от 200 мкл суспензии клеток (соответствующий 0,2 x 105 клеток) за хорошо в пластину 96-луночных желатин покрытием (теперь одна эта пластинка будет далее именоваться пластину «измерения»).
  5. Инкубируйте пластину на ночь при 37 ° C и 5% CO2.

3. Загрузка клеток с флуоресцентные Ca2 + -чувствительных краситель

  1. В день 1 выполняют фактическое Ca2 + мобилизации assay, начиная с загрузкой в сеяный клеток с флуоресцентные Ca2 +-связывание красителя fluo-2 AM.
    1. Подготовьте аналитический буфер путем добавления 40 мл HEPES (1 М) 200 мл Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS, 10 x, не фенола красного, не бикарбонат натрия). Добавление ультрачистая вода для получения окончательный объем 2 Л и добавить 4 g бычьим сывороточным альбумином (БСА). Растворите BSA через магнитные перемешивания. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 (с NaOH) и фильтр решение.
      Примечание: Во время все следующие шаги используется тот же буфер, именуемые «assay buffer».
    2. Подготовить раствор (4 мм диметилсульфоксида (ДМСО)) флуоресцентных Ca2 +-чувствительных красителя fluo-2 AM. Избегайте чрезмерного воздействия света. Растворить 1 мг fluo-2 утра (молекулярный вес: 1 061 г/моль) в 235.6 мкл ДМСО.
    3. Подготовка рабочего раствора fluo-2 AM. Для одной пластины 96-луночных пробирного смесь 12,5 мкл раствора fluo-2 AM штока (4 мм) и 12,5 мкл неионогенных ПАВ полиола (например, плюрониевого f-127) раствор (20% вес/объем в ДМСО, смотрите Таблицу материалы). 22 мкл этой смеси, 11 мл пробы буфер в 15 мл. Конечная концентрация fluo-2 AM-4 мкм.
      Примечание: Неионогенных ПАВ используется как агент Дисперсия для улучшения водный растворимость fluo-2 утра и, в последствии, для повышения нагрузки ячейки. Чтобы солюбилизировать последнего сурфактанта в ДМСО, тепло образца при 37 ° C и перемешайте регулярно, чтобы получить однородный раствор.
    4. Удалите среднего роста от ранее в сеяный клеток в пластину 96-луночных измерения, переворачивая пластину и сушки на бумажное полотенце.
    5. 100 мкл загрузки раствор красителя на хорошо с помощью многоканальных дозаторов и проинкубируйте 45 мин на RT в темноте.

4. Подготовка 96-луночных полипропилена плиты, содержащие хемокиновых лигандом CXCL12 или соединения под следствием

  1. Получите раунд полипропилена (PP) 96-луночных поддоны (см. Таблицу материалы).
    1. Разрешить Стоковый раствор CXCL12 (1 мг/мл) и Стоковый раствор соединений под расследование, чтобы сбалансировать на RT.
      Примечание: В ультрачистая вода дополнена 0,01% Tween20 и хранятся при температуре-20 ° C как одноразовые аликвоты готовится Стоковый раствор CXCL12.
    2. Подготовить 5 x концентрированный раствор CXCL12 в assay buffer (250 нг/мл, которая равна 31,25 Нм) и 5 x концентрации разбавления каждого соединения (в assay buffer).
    3. Отказаться от акций решения в соответствующие пластины 96-луночных согласно макет предопределенные пластины. Отказаться от 75 мкл/хорошо в пластину, содержащие CXCL12 («плита хемокиновых»), обойтись 50 мкл/хорошо в пластину, содержащих соединения («составные Латы»).
      Примечание: Оба соединений и CXCL12 наконец станет разбавленной 5 x после розлива в пластину измерения. Важно также включить отрицательный контроль скважины, содержащие только Пробирная буфер в составной плиты, а также пластину хемокиновых. Также положительный контроль скважины должны быть включены (т.е., колодцы с CXCL12 в пластину хемокиновых, но с Пробирной буфера в соответствующий скважинах составной плиты).

5. протокол настройки на Считыватель микропланшетов флуоресцирования

Примечание: Считыватель микропланшетов флуоресценции, используемые в настоящем Протоколе передается в Таблицы материалов.

  1. Сначала включите кулер единица флуоресценции пластины читателя и затем на флуоресценции читатель сам. Позвольте начать за несколько минут и откройте системного программного обеспечения.
  2. Создайте протокол assay, с помощью перетаскивания и меню, которое включает в себя следующие шаги:
    1. В диалоговом окне «Параметры» выберите «Read_Mode» с длиной волны возбуждения: 470-495 Нм; Длина волны излучения: 515-575 Нм.
      Примечание: Выбранный волнах подходят для использования с Ca2 +-чувствительных краситель fluo2.
    2. Включить поле «Mix с TF» (жидкости) для автоматического смешивания соединений в пластину соединения, которые будут поставлены в источник 2 позиции устройства (см. шаг 6.4). Выберите 15 мкл раствора в каждой скважине автоматически наддува и смешанные три раза. Отрегулируйте высоту наконечники на 20 мкл ниже уровня жидкости. Установите скорость аспирации и дозирования по 50 мкл/сек.
      Примечание: Высота наконечники относится к тому, что осталось под пипеткой советы. Например если скважины составной плиты содержат 50 мкл, высота 30 мкл соответствует 20 мкл ниже уровня жидкости. Объем составные решения, принятые смешивать, скорость смешивания, позиция пипеткой советы во время смешивания, и количество циклов смешивания все регулируется с помощью программного обеспечения.
    3. В диалоговом окне «Передача жидкости» определить что 20 мкл каждого колодца от составной плиты будет передаваться в пластину измерения. Поместите наконечники на 20 мкл ниже жидкости поверхности, то есть, на высоте 30 мкл при аспирации соединений и высота 60 мкл во время отпуска в пластину измерения. Установите скорость аспирации на 50 мкл/с и скорость подачи 25 мкл/сек.
      Примечание: Составные табличка содержит 50 мкл раствора на хорошо (см. шаг 4.1.3), таким образом, высота 30 мкл соответствует позиции 20 мкл ниже уровня жидкости. Пластину измерения будет содержать 80 мкл аналитического буфера за хорошо (см. шаг 6.3), таким образом, высота 60 мкл соответствует аналогичной позиции советов.
    4. Нажмите кнопку «Чтение с TF». Во время первого интервала выберите 60 гласит (флуоресцентные измерения) с временем чтения интервал 1 s. определить, что 10 гласит записываются перед подачей соединений в пластину измерения, и 50 читает потом. Определить второй интервал с чтения интервал 30 s и 18 читает.
      Примечание: Во время этого шага флуоресценции будет измеряться кинетически (промежутки времени) на ~ 10 мин в целом.
    5. Включите кнопку «Вымыть советы» в протоколе три раза. В рамках каждой стирки шаг, выберите тип жидкости: жидкость (ультрачистая вода) или жидкости B (на 70% спирте), количество циклов стирки (1), насос скорость (быстро), и количество штрихов (5) во время каждой мыть шаг.
      Примечание: Во время первого и последнего мыть шаг жидкости A используется, во время второй мыть шаг жидкость, которую B используется.
    6. Включите функцию «Пауза дозаторов». Установите дозаторов для остановки на 300 s.
      Примечание: Включив этот шаг в протоколе, дозаторов головы, которая интегрирована в считывающее устройство флуоресценции пластины, паузу на 5 мин перед продолжением протокол.
    7. Включить поле «Mix с TF» разрешить автоматическое Перемешивание раствора CXCL12 в хемокиновых пластины, которая будет располагаться в источник 3 позиции устройства (см. шаг 6.4). Выберите 15 мкл раствора в каждой скважине автоматически наддува и смешанные три раза. При аспирации и смешивания позиция пипеткой советы 20 мкл ниже уровня жидкости. Скорость аспирации и дозирования устанавливается 50 мкл/сек.
      Примечание: Аналогичные как шаг 5.2.2, эти параметры можно отрегулировать.
    8. В поле «Передача жидкости» последующих определить что 25 мкл от каждой хорошо из хемокиновых плита будет передаваться в пластину измерения. Позиция советы 20 мкл ниже жидкости поверхности, то есть, на высоте 55 мкл при аспирации от хемокиновых пластина, которая содержит 75 мкл/хорошо (см. шаг 4.1.3) и в высоту 80 мкл во время отпуска в пластину измерения. Установите скорость аспирации на 50 мкл/с и скорость подачи 25 мкл/сек.
    9. Включите кнопку «Чтение с TF». Во время первого интервала выберите 145 читает с чтения интервал 1 s. определить, что 5 гласит записываются перед подачей CXCL12 в пластину измерения, и 140 читает потом. Определить второй интервал с чтения интервал 6 s и выберите 20 читает.
      Примечание: Вместе взятые, на протяжении всего протокола записываются 243 читает (флуоресцентные измерений): 78 на этапе 5.2.4 и 165 во время шага 5.2.9.
    10. Подобный шаг 5.2.5, включают в себя кнопку «Вымыть советы» три раза в протоколе.
      Примечание: Включая этот шаг в конце протокола позволяет, что советы могут быть повторно использованы для выполнения другой пробирного без необходимости изменения советы.
  3. Установите температуру устройства при 37 ° C, нажав кнопку «Установить этап температуры» и выбрав пункт 37 ° C.

6. Запуск Assay флуоресцирования

  1. После измерения пластина инкубировали с загрузкой буфер для 45 мин (см. шаг 3.1.5), удалить буфер, перевернув пластину и сушить на ткани.
  2. Вымойте посеян клетки путем добавления 150 мкл/хорошо аналитического буфера и инкубировать в течение 2 мин.
  3. Снова удалите буфер, перевернув пластину. Добавьте 80 мкл/хорошо аналитического буфера с многоканальные пипетки.
  4. Положите все пластины в устройство в их соответствующие позиции: составные источник 2 позиции, хемокиновых пластины на источник 3 позиции и измерения крышку на позицию чтения. Поставьте коробку черного советы в источник 1 советы позиции. Устройства дверь и проинкубируйте 5 мин перед продолжением протокол.
  5. Выберите кнопку «Протокол сигнала тест» для определения фона относительной легких единиц (RLUs) и отклонение люминесцентная через пластину. Новое окно хлопнет вверх. Выберите «Проверить сигнал».
    Примечание: Во время этого шага, фон RLUs, определяются ICCD камеры, которая интегрирована в отсеке оптика флуоресценции считывающее устройство. Эти RLUs в результате возбуждения Ca2 +-чувствительных краситель (fluo-2), светоизлучающие диоды (СИД) (Светодиодные выходной волны 470-495 нм). 8000-10000 RLUs значений хорошо подходит для этого приложения. RLUs может при необходимости, адаптировать путем изменения интенсивности возбуждения (выберите Exc. интенсивности), или ворота камеры (выберите ворота открыты). Расхождение над пластину в идеале должно быть менее 7,5%.
  6. Выберите «Обновление», если получены значения фон 8000-10000 RLUs. Сохраните основной протокол, нажав на кнопку Сохранить.
    Примечание: Поступая таким образом, параметры протокола тест сигнала будет переноситься основного протокола.
  7. Запуск анализа, нажав на кнопку «RUN».

7. анализ данных и качество

  1. После завершения анализа откройте окно «Анализ» в программное обеспечение системы.
    1. Перейдите к «Настройка исправления» и выбрать «ответ по базовой линии». Определение базовой линии 1 начать на измерения 1 и в конце измерений 5; средняя флуоресценции будет рассчитываться в каждой скважине между измерения 1 и 5.
      Примечание: Все дальнейшие измерения от конкретного хорошо разделяются это хорошо конкретных базовой линии 1.
      1. Определение базовой линии 2, чтобы начать измерение 78 до измерения 83 (CXCL12 распределяется после измерения 83; снова среднее флуоресценции рассчитывается в каждом хорошо между измерения 78 и 83 и это поправочный коэффициент применяется для всех измерений после измерение 83).
    2. Активировать галочку «Показывать в процентах» и «вычитание фона».
    3. Перейти к «Настройка кинетическая сокращение». Чтобы оценить эффект соединений на CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ, выбирайте макс-мин, начиная с измерения 84 (то есть, первое измерение, после чего обойтись CXCL12) 243 (то есть, окончательный расчет).
      Примечание: Выбирая макс-мин разницу между минимальной и максимальной реакции над базовой линии между измерения 84 и сообщается 243. Если макс-мин начиная между измерения 11 и 78, сообщается разница между минимальной и максимальной реакции над базовой линии относительно базовой линии 1. Это значение может использоваться для анализа потенциальных агонистических активности соединений, см. обсуждение).
    4. Данные будут визуализированы в программное обеспечение системы. При необходимости, экспорт необработанных данных для дополнительного анализа и визуализации в других общих пакетов программного обеспечения анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эффект CXCL12 стимуляция внутриклеточных Ca2 + мобилизации в U87. CD4.CXCR4+ и U87. CD4 клеток проводилась с Ca2 + мобилизации assay. Вместо 20 мкл, комплекса тестов, обычно будет добавлен на первом шаге дозирования протокола (рис. 1), аналитический буфер был добавлен в fluo-2 утра загружен U87. CD4.CXCR4+ клетки в пластину измерения. На втором шаге дозирования, различные концентрации CXCL12 (0,2-102,4 Нм, конечная концентрация) были обойтись в пластину измерения. Продемонстрировано дозозависимое увеличение флуоресценции, соотнося с дозозависимое увеличение выпуска Ca2 +, (рис. 2A). Здесь, в образце отрицательный контроль представляет собой этих скважин, в которых на оба дополнения только Пробирная буфер был добавлен к пластине измерения (т.е., 0 Нм CXCL12), в результате чего отсутствие реакции (рис. 2A). Все большее количество CXCL12 вызвать повышение уровня флуоресценции которые распад со временем (рис. 2A). Из этих данных, дозы кривой ответ был создан на основании «макс-мин ответ по базовой линии» между измерения 84 (то есть, первое измерение после добавления CXCL12) и 243 (т.е., окончательный расчет в протоколе ). С помощью нелинейной регрессии, значение50 EC (то есть, концентрации, необходимые для половины максимальный отклик) было определено и соответствует 1.14 Нм (рис. 2B). Не флуоресцентные Ca2 +-связанных, реакция была вызвана CXCL12, даже при высокой концентрации (102.4 Нм), когда U87. CD4 клеток, не хватает функциональной CXCR4 выражения были использованы. Это демонстрирует рецептор специфика измерения, вызываемую CXCL12 (рис. 2 c).

Ключ приложения для идентификации малых молекул, конкретно ориентированная на CXCR4 этот assay на основе ячеек и способны ингибирования CXCL12-индуцированной Ca2 + мобилизации. Если выявляются активных соединений («хитов»), они могут далее характеризоваться тестирования серийных разведений соединения и анализируя ингибирующее потенции в более подробно. Например эффект bicyclam AMD3100, антагонистом устоявшихся малые молекулы рецептор CXCR4 конкретных с мощным анти-ВИЧ-1 деятельность21,22, показана на рисунке 3. Концентрация серии AMD3100 (n = 4, 3 мкм до 1,37 Нм конечная концентрация в серии разбавления 1/3) был обойтись на U87. CD4.CXCR4+ клеток на первом этапе протокола. Затем соединения разрешили инкубации с ячейками для ~ 10 мин, в течение которого сигнал флуоресценции был записан непрерывно. Затем 6.4 Нм CXCL12 (50 нг/мл, конечная концентрация) был добавлен для всех скважин пластину клеток одновременно, чтобы побудить CXCR4-опосредованной Ca2 + мобилизации. Ингибирование дозозависимый этой реакции различных разведениях AMD3100 показано на рисунке 3A. В этом случае отображается только часть графика, после добавления CXCL12. Как только буфер отрицательный контроль (синяя линия) был применен в assay (без предварительной инкубации с AMD3100, не CXCL12, добавлены к скважинам), что приводит к ожидаемой отсутствие реакции. Положительный контроль (красная линия) соответствует образцы в котором 6.4 Нм CXCL12 был добавлен в скважинах без предварительной инкубации AMD3100 (рис. 3A). Основываясь на эти определенные негативные и позитивные управляет Z' в этот assay обычно значение между 0,5 и 1. Для того чтобы определить ингибирующее потенции AMD3100 кривая доза реакция была порождена нелинейной регрессии, вытекающих в расчетное значение50 IC 770.8 Нм (рис. 3B). Чтобы далее проиллюстрировать поведение-активные соединения, маравирок был включен в этом эксперименте. Маравирок является маленькой молекулы специально ингибирующих CC хемокиновых рецепторов 5 (CCR5) тем самым блокируя (CCR5)-Тропик ВИЧ-1 инфекции23 . Даже при высокой концентрации (10 мкм конечная концентрация) не тормозящий эффект этого соединения был замечен на CXCR4-опосредованной Ca2 + ответ (рис. 3A).

Наконец, чтобы продемонстрировать, что этот Ca2 + мобилизации assay может также применяться для изучения других GPCR, последовательного растворения CC хемокиновых лигандом 5 (CCL5), эндогенных лигандов для CCR5, был добавлен к клеткам, выражая CCR5 (U87. CD4.CCR5+) с использованием точно так же экспериментальных условий и параметров оборудования. Дозозависимый флуоресцентные Ca2 + ответ проявляется после добавления последовательного растворения CCL5 (рис. 3 c). Кроме того в отличие от ее влияние на CXCR4, предварительное инкубации с 100 Нм (конечная концентрация) Маравирок сильно ингибировала этот ответ (рис. 3D).

Figure 1
Рисунок 1: Схематичный обзор процесса пробирного. На день 0 клетки выражая GPCR интерес (в данном случае CXCR4) посеян в черном стеной 96-луночных пластины с четкой дном и выращиваются на ночь при 37 ° C и 5% CO2. На 1 день на основе флуоресценции Ca2 + генотипирования. Клетки сначала загружаются с флуоресцентные Ca2 +-чувствительных краситель (fluo-2 утра) и инкубированы для 45 мин на RT в темноте. «Хемокиновых» и «составные крышку» готовятся (PP = полипропилен). После инкубации с загрузкой краситель клетки в сеяный раз промывают пробирного буфера (150 мкл/хорошо) после чего добавляется 80 мкл/хорошо аналитического буфера. Затем все пластины инкубируют за 5 мин в устройстве при 37 ° C перед началом assay. Затем, обойтись в нужной концентрации в колодцы измерения пластины и разрешено Инкубируйте соединений интерес (например, малых молекул) ~ 10 мин, в то время как непрерывно измеряется флуоресценции. Далее фиксированная концентрацию эндогенных агонист ХВГФ (здесь CXCL12) добавляется к вызывают Ca2 + выпуска и флуоресценции далее записывается со временем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Агонист деятельность CXCL12 на CXCR4+ клеток и специфичности выявленных ответа. (A) дозозависимый эффект CXCL12 на Ca2 + мобилизации в U87. CD4.CXCR4+ клетки. (B) основано на ответ макс-мин за базовый между измерения 84 и 243, кривая доза ответ был создан и значение50 EC, рассчитанное (n = 4, означает ± SD). (C) ответа не было вызвано CXCL12, когда он был обойтись на U87. Не хватает CXCR4 клеток CD4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Иллюстрация эффекта CXCR4 антагонистов (AMD3100) и не активных соединений (Маравирок) на CXCR4+ клеток и активации CCR5 к его эндогенного агонист, CCL5. (A) дозозависимый ингибирующее влияние AMD3100 на Ca2 + мобилизации вызывали путем добавления 6.4 Нм CXCL12 до U87. CD4.CXCR4+ клетки. Маравирок (в конечной концентрации 10 мкм) показал не ингибирующее влияние на CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ. (B) на основе ответ макс-мин над базовой линии между измерения 84 и 243, кривая ингибирующее доза ответ был создан и значение50 было рассчитано для 770.8 Нм (n = 4, означает ± SD). (C) дозозависимый активации CCR5 к его эндогенного агонист, CCL5. (D) Ингибирование CCR5-опосредованной Ca2 + ответ предварительной инкубации клеток с 100 Нм Маравирок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 +-пробирного мобилизации, описанных ранее было показано, быть ценным инструментом для выявления и характеризуют антагонисты рецепторов, ориентация CXCR417. Однако, ожидается что этот метод может в целом применяться к большой группе других GPCR, которые вызывают цитозольной Ca2 + релиз после их активации, как показано для смежных хемокиновых рецепторов CCR5. Тогда как в случае CCR5 может применяться точно так же экспериментальных условиях, несколько шагов в протоколе (например, номер ячейки на покрытие, Загрузка клеток с флуоресцентной краской) нужно будет повторно оптимизированный перед передачей assay для другие GPCR, для того чтобы получить благоприятное соотношение сигнал шум. Также важным вопросом здесь является выбор подходящего в vitro сотовой принимающей позволяя высокого уровня выражение GPCR интерес и функциональной муфта для Ca2 + путь. В случае CXCR4, клеток глиобластомы человека U87 были выбраны из-за: (1) отсутствие эндогенного выражения CXCR7 (связанные хемокиновых рецепторов, который занимает же агонист как CXCR4), (2) их способность пара CXCR4 активации для Ca2 +-сигнализации путь, (3) благоприятные динамический диапазон флуоресцентные ответ получен после загрузки клеток с Ca2 +-чувствительных красителя и (4) их отличные присоединения к assay плиты минимизации мобильный помеха на протяжении всей процедуры. Все из этих параметров может потребоваться экспериментально определены для каждого романа GPCR интерес и каждой системы сотовой выражение.

При создании аналогичного анализа для другой GPCR, можно считать несколько альтернативных шагов или реагенты в протоколе. Например, другие Ca2 +-чувствительных флуорофоров (например, fluo-4, fluo-3) могут быть использованы в качестве альтернативы для Флюорофор (fluo-2), используемые в настоящем Протоколе. В случае из слабо придерживаясь клетки, мытья клетки может быть опущен путем введения без мыть красители для сведения к минимуму выбивании24ячейки. Кроме того за исключением Стиральная шаг из протокола позволит еще больше увеличить пропускную способность пробирного. Хотя этот assay может также выполняться с клетками, показаны эндогенного выражение CXCR4, к примеру, включая несколько видов человеческих раковых клеток линии10,25, следует отметить, что с стабильно transfected клеток линии высокой ХВГФ уровни выражения, которые остаются стабильными со временем могут быть получены. Это приведет к более произносится Пробирной измерений, увеличить окно для интерпретации надежных данных и последовательно анализа производительности в течение длительных периодов времени. При использовании клетки эндогенно выражая CXCR4 он будет гораздо труднее достичь этого результата.

Основным недостатком анализа является, что он основывается на измерении флуоресценции. Следовательно autofluorescent соединений может мешать пробирного измерение, которое исключает их из анализа из-за интерпретации ненадежных данных. Кроме того этот Ca2 + мобилизации идеально генотипирования с использованием сотовой, скрининг система с комплексной системой дозирования, которая позволяет стандартизированный смешивания и шинстве соединений и агонист рецептора в пластину измерений во всех Уэллс одновременно. Assay может однако, быть адаптированы для использования с другими, менее дорогим флуоресценции Гонав читателей с возможностями Кинетические измерения. Добавление соединений и агонист затем нужно будет выполняться вручную с помощью многоканальных пипеток, которые увеличит hands on время и снижает пропускную способность пробирного. Кроме того получить такое же количество измерений флуоресценции в течение заданного интервала времени кинетического анализа будет трудно достичь, как многие читатели Гонав измерения сигналов-скважины, тогда как high-end Скрининг систем измерения всех скважин одновременно.

Антагонисты рецепторов, предотвращение связывания рецептора и последующей активации эндогенного агонистов (CXCL12) в настоящее время составляют основную категорию соединений, специально ориентированных на CXCR411,12. AMD3100, малые молекулы, которая была использована для иллюстрации производительности Ca2 + мобилизации assay, является одним из наиболее известных примеров CXCR4 антагонисты26. Помимо антагонисты рецепторов молекулы, которые регулируют GPCR сигнализации по-разному вызывают общий интерес, а также. Эти молекулы включают в себя обратные агонисты, а также GPCR ПАМС и NAMs19,20,27. Интересной особенностью assay, описанные в этой рукописи является, что он не может определить только антагонисты рецепторов, но и агонисты и аллостерический модуляторы. Однако некоторые незначительные адаптации пробирного и ограничения должны приниматься во внимание.

Пам и NAMs привязку к рецепторов топографически отличается от привязки сайта orthosteric, занимаемых эндогенных лигандов рецепторов. ПАМС повышения потенции и/или эффективность эндогенных рецепторов ligand(s), в то время как NAMs препятствовать потенции и/или эффективность эндогенного ligand(s)19,20. Пам имеют никакой внутренней агонист деятельности. Они активны только в присутствии эндогенного агонист, в отличие от так называемых аллостерический агонистов. Потому что аллостерический GPCR модуляторы бы вызывают меньше побочных эффектов, чем антагонисты рецепторов классической при применении в клинических параметров28,29, они являются ценным фармакологическим инструменты. В нашем assay аллостерический агонисты вызовет преходящее повышение сигнала флуоресценции сразу же после добавления к CXCR4+ клеток. Рецептор специфичность этого сигнала затем должна определяться путем тестирования же соединение с же assay, но и на клетки, не хватает CXCR4. Когда конкретно скрининг на ПАМ, более низкой концентрации эндогенного агонист следует использовать в assay побудить флуоресцентный Ca2 + ответ. Хотя это меньшее количество агонист будет генерировать меньше флуоресцентного сигнала, он оставляет окно большего размера для выявления дополнительных рецептор стимуляции. Как правило концентрация агонистом, соответствующее значению30 - EC EC10стимуляции рецепторов выбирается30,31. Добавление PAM во время первой части assay не приведет к увеличению флуоресцентные измерения. Однако флуоресцентный Ca2 + сигнал после последующей стимуляции с его эндогенного агонист рецептора увеличится. Аналогично ДН не изменяют флуоресцентные измерения до агонист сложения, но препятствовать рецепторов ответ после добавления агониста. Таким образом будет выглядеть профиль деятельности антагонистов рецепторов и дн. Они оба приведет в торможении флуоресцентные ответ после добавления агониста. Таким образом необходимы дальнейшие экспериментальные исследования для выявления различий между антагонист и дн. Здесь, рецептор привязки исследования которой немеченого соединения конкурировать с фиксированное количество помечены CXCL12 для привязки CXCR417,32 может быть ценным стратегию для различения антагонист, который помешает с меткой агонист от связывания рецептора, и нам, что бы не так, как он бы не поделиться же сайт связывания рецептора.

Лиганд независимую (или базальный или учредительных) деятельность GPCR наблюдается для многочисленных GPCR33 , хотя уровень базальной активности обычно является довольно низким, когда GPCR выражаются recombinantly27. Базальная ХВГФ активность может быть повышена благодаря естественным мутации33 и Точечная мутация приводит к увеличению базального CXCR4 деятельность была описанные ранее34. Сцепка этот конститутивно активных мутант CXCR4 феромонов ответ путь в дрожжей и [35S] GTPγS привязки экспериментов, было показано что Т140, антагонистом CXCR4 на основе пептида с мощным анти-ВИЧ активности17,35 значительно сократили это базальной активности и таким образом было показано вести себя как обратная агонист34. Следует отметить, в Фура-2 на основе флуоресценции Ca2 + мобилизации assay же авторы наблюдается небольшой преходящее снижение в Ca2 +-связанной с флуоресценцией, после добавления Т140 выражая мутант CXCR4, предлагая Снижение базальной клетки рецептор деятельности34. Однако при анализе дополнительной табличкой циклических на основе пентапептид CXCR4 обратные агонисты от Т140, обнаружение Снижение базальной активности с Ca2 + мобилизации assay был менее очевидно,36. Когда эффект Т140 на клетки, выражая дикого типа CXCR4 был проанализирован с помощью Ca2 + мобилизации assay, как описано в этой рукописи, никаких изменений в базальной флуоресценции сигнал наблюдалась17. Кроме того, колебания флуоресценции быстро и переходных и увеличению базального Ca2 + например, не соблюдаются в клетках, выражая конститутивно активных Gαq-рецепторы4в сочетании. Взятые вместе, эффект обратные агонисты будет очень трудно, если не невозможно, определить и оценить надежно с нашего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Фонтейн и Geert Schoofs за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана ку Лёвен (Грант нет. PF/10/018), фондах воор Wetenschappelijk институте (FWO, Грант нет. G.485.08) и Фонд Dormeur Вадуц.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-2 AM Abcam ab142775 fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G pluronic acid
Gelatin Sigma G9391
AMD3100 Sigma A5602-5 mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc kind gift of AnorMed antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12 PeproTech 300-28A
Chemokine ligand CCL5 PeproTech 300-06
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco (Life Technologies) 41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1 M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red Gibco (Life Technologies) 25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Falcon tubes, 50 mL Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid Costar/Fisher Scientific 10530753 assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates Thermo Scientific (VWR) 732-2661 plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system Molecular Devices Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm Molecular Devices 0200-6128 Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm Molecular Devices 0200-6203 emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head Molecular Devices 0310-4536 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks Molecular Devices software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL Beckman Coulter cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile Corning 3340 Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  3. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  4. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
  5. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
  6. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  7. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  8. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  9. Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
  10. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  11. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  12. Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  13. Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
  14. DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
  15. Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  16. Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
  18. Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
  19. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  20. Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
  21. Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
  22. Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
  23. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  24. Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
  25. Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
  26. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  27. Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
  28. Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
  29. Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
  30. Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
  31. Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
  32. Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  33. Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
  34. Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
  35. Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
  36. Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).

Tags

Медицина выпуск 132 G связью белка рецептора хемокиновых КЭС хемокиновых рецепторов 4 флуоресценции на основе ячеек пробирного Ca2 + мобилизация агонист антагонист лекарственных препаратов аллостерический модулятор малые молекулы
Кинетическая на основе флуоресценции Ca<sup>2 +</sup> мобилизации Assay для определения G белка в сочетании рецепторов агонистов, антагонисты и аллостерический модуляторы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., … More

Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., Schols, D., Van Loy, T. A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators. J. Vis. Exp. (132), e56780, doi:10.3791/56780 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter