Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

Published: February 20, 2018 doi: 10.3791/56780
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

Summary

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Abstract

Onlar birçok insan hastalıkları içinde yer alan ve terapötik müdahale için iyi doğrulanmış hedefleri içerir gibi ilaç endüstrisi için büyük önem G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır. Keşif kurşun bileşikleri, özellikle reseptör'ın işlevi inhibe, küçük sentetik moleküller de dahil olmak üzere uyuşturucu gelişiminde önemli bir ilk adımdır ve hassas, belirli ve güçlü hücre tabanlı deneyleri üzerinde dayanır. Burada, biz Kinetik bir hücresel tahlil ile öncelikle CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) etkinleştirme uyarılmış intrasellüler Ca2 + serbest inhibe özel reseptör antagonistleri tanımlamak için tasarlanmış bir floresan okuma tarafından açıklamak onun endojen ligand CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12). Ayrıca tarama Iç agonistik özellikleri (örneğin, intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu yokluğunda CXCL12 bir artış alabilme bileşikleri) veya bileşikler ile donatılmış bileşiklerin sağlar Bu yöntemin önemli bir avantajı olduğunu reseptör'ın işlevi allosteric bağlayıcı siteleri ile etkileşim yoluyla oransal (Yani, pozitif ve negatif allosteric modülatörler (PAMs ve NAMs, sırasıyla)). Aşağı tarafta, autofluorescent bileşikler böylece güvenilir veri yorumu engelleyici tahlil'ın okuma ile etkileşebilir. Büyük olasılıkla bu tahlil, en az uyarlamalar ile jenerik ilaç keşif tahlil için birçok diğer GPCRs hangi bir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak için belgili tanımlık harekete geçirmek yol olarak uygulanabilir.

Introduction

GPCRs önemli bir üst aile cep yüzey proteinlerin sinyal iletim cascades ekstraselüler ligand taşıması üzerine harekete geçirmek vardır. Çeşitli hücre içi sinyal yolları ve sonunda biyolojik yanıt-e doğru1,2 başlatma sonuçları uyaranlara peptidler, protein hormonlar, Biojenik aminler ve lipidler, dahil olmak üzere büyük bir çeşitlilik tarafından etkinleştirilebilir . Ayrıca, GPCRs birçok, eğer tüm, gelişimsel ve fizyolojik süreçler söz konusu ve birçok insan hastalıkları işlevsiz GPCR sinyal veya reseptör overexpression ile ilişkilidir. GPCRs bu nedenle tıp1,3en doğrulanmış farmakolojik hedefler arasında bulunmaktadır.

Genellikle, küçük moleküller, Monoklonal antikor ve belirli bir GPCR etkinlik modüle peptidler gibi bileşiklerin kimliği etkinleştirme hücresel tarama deneyleri GPCR ilaç keşif iş akışı başlar. GPCR ilaç keşfi, böyle bileşikler için aramak için farklı türlerde deneyleri mevcut olan en orta - için yüksek-den geçerek tarama kampanyaları ile uyumludur. En çok kullanılan deneyleri reseptör bağlama deneyler, dahil floresan veya ışıldama göre sözde ikincil haberci (örneğin, Ca2 +, siklik adenozin monofosfattır (AMP)), fenotipik düzeyde dalgalanması tespit deneyleri tarama testleri ve β-arrestin işe alım deneyleri4. Tahlil belirli bir türü için seçim birden fazla faktöre bağlı olabilir, ama aynı zamanda belirli bir GPCR sinyal özellikleri ile ilgili ön bilgi tarafından belirlenir. Bir GPCR bağlama agonist guanidin nükleotittir (GSYİH) guanidin trifosfat (GTP) için exchange katalizlerler konformasyonal değişim α-alt heterotrimeric G protein neden olmaktadır. Daha sonra Gα-GTP alt birimi Gβγ alt birimi ayrışıp ve her iki alt birimleri daha fazla sinyal yolları başlatacaktır. Hidroliz GTP-molekül ve sonraki yeniden Derneği Gα- GSYİH ve Gβγ alt birimleri gr protein onun etkin olmayan uyum5,6geri yükler. Dayalı sıra Gα alt birim benzerliğini G proteinlerin farklı türleri tanımlanmıştır (Gs,benG, Gq, G12/13)7. Via Gα sinyal alt birimi verir artış artış gibi birkaç tipik yanıt için (Gs) veya (Gben) siklik AMP üretim ve intrasellüler Ca2 + seferberlik (yolu ile Gq) azaltmak5 ,7. Gβγ alt birimleri Ayrıca hücre içi efektör yolları ikna edebiliyoruz. Örneğin,benG aktivasyonu üzerine-eşleşmiş GPCRs, Gβγ doğrudan fosfolifaz açıklaması, Ca2 + hücre içi mağazaları7 tetikleyen C (PLC-β) inositol trifosfat (IP3) üretmek için teşvik . Reseptör aktivasyonu, β-arrestins ile etkileşimi teşvik GPCR kinaz (GRKs) tarafından GPCRs fosforile. Bu işlem G protein sinyal sonlandırır ve reseptör duyarsızlaştırma ve sonunda içselleştirilmesi yol açar. Β-arrestins da diğer sinyal yolları8sinyal G protein bağımsız tetikleyebilir çok moleküler komplekslerin oluşturmak edebiliyoruz.

Kemokin reseptörleri, Gbenalt familya içinde-eşleşmiş CXCR4 çok ilgi ilaç keşfi için umut verici hedef olarak yükseltti GPCR olduğunu. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) 1 için büyük bir co reseptör olarak kurulan rolünü verilen viral giriş ve enfeksiyon, CXCR4 hedefleme bileşikler başlangıçta Anti-HIV ilaç adayları9olarak geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, kanıt büyüyen bir vücut için önemli bir rol CXCR4 için yapım o iyi doğrulanmış bir terapötik hedef Onkoloji de tumorigenesis ve kanser metastaz içinde10işaret etmiştir. CXCR4 son derece insan kanseri ve denetimleri tümör hücre sağkalım, nükleer silahların yayılmasına karşı ve geçiş yanı sıra angiogenez tümör ile ilgili10yirmiden fazla türünde de ifade edilir. Farklı kimyasal sınıfların CXCR4 antagonistleri daha önce açıklanan11,12, ama sadece küçük molekül AMD3100 şu anda Lenfoma tedavi sırasında kullanılan kök hücre seferberlik ajan olarak klinikte kullanımı için onaylanan olmuştur ve Miyelom hastaları13,14. Klinik çalışmalarda emniyet ve birkaç diğer CXCR4 antagonistleri farklı insan hastalıkları, ama Onkoloji12güçlü bir odaklanma ile etkinliğini değerlendirmek için devam etmektedir. Birçok potansiyel uygulama CXCR4 antagonistleri için göz önüne alındığında, geliştirilmiş farmakokinetik özellikleri, Gelişmiş bioavailability veya potansiyel olarak daha az yan etkileri ile roman bileşikler için arama garanti kapsamındadır.

Burada, Kinetik bir floresan tabanlı hücresel tahlil için öncelikle kullanılan ekran CXCR4 inhibe yeteneğine sahip bileşikler için açıklanmıştır. Bu yöntemin floresan ölçüm CXCR4 harekete geçirmek onun endojen agonist Kemokin ligand (stromal hücre türetilmiş gibi faktör 1α (eski adıyla CXCL12 tarafından uyarılmış intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu geçici artış dayanır SDF1-α)) ve bu CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt tarafından belirli bileşikler potansiyel inhibisyonu. Bu tahlil U87 insan glioblastoma hücreler stabil insan CXCR4 reseptör ifade kullanılır. Aynı zamanda, bu hücreler CXCR7, ayrıca CXCL1215,16,17bağlar ilgili Kemokin reseptör endojen ifade eksikliği. CXCR7 daha önce de heterodimers CXCR4 ile şekillendirme yeteneğine sahip olması dolayısıyla bu ikinci reseptör18sinyal özelliklerini oransal gösterilmiştir. Düzeyi tarafından CXCR4 aracılı hücre içi Ca2 + dalgalanmalar CXCR4 yükleyerek izlenir+ hücreleri ile fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, bir hücre geçirgen yüksek afinite floresan Ca2 +-boya bağlama. Fluo-2 490 heyecanlı bir tek dalga boyu floresan molekül olduğu kendi emisyon Floresans 520 ölçülür ise nm nm. Ca2 + bağlama, büyük bir Dinamik Aralık arasında Ca2 +ile üzerine bu emisyon Floresans artırır-bağlı ve devlet ilişkisiz. Floresan sinyal artış geçicidir, birkaç dakika, bir zaman aralığında meydana gelen ve daha sonra çürük. Floresan emisyon daha fazla ilişkilendirir pik yüksekliği reseptörü harekete geçirmek düzeyine sahip. Tahlil kendisi tahlil pipetting adımları standardizasyonu sağlayan entegre bir pipetting sistem sahip bir yoğun CCD (ICCD) kamera ile donatılmış bir floresan Mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek) . Buna ek olarak, aynı anda bir Mikroplaka bütün Wells floresan sinyal kullanılır Floresans okuyucu bir diğer önemli avantajı ölçümdür. İlk soruşturma (örneğin, sabit bir konsantrasyon veya bir seyreltme dizisinde küçük moleküllerin bir panel) altında bileşikler fluo-2 AM eklendi tahlil bir parçası CXCR4 yüklenen+ U87 hücreleri tarafından izlenen bir ~ 10 dk kuluçka dönemi sırasında gerçek zamanlı olarak sürekli bileşikler potansiyel agonistik etkisi ölçülür. O zaman, endojen agonist (örneğin, CXCL12) hücrelere bir CXCR4 aracılı geçici düzeyinde artış intrasellüler Ca2 +uyandırmak eklenir. Bu testin bir parçası sırasında test edilen bileşiklerin potansiyel antagonistik etkinlik değerlendirilebilir. Tahlil'ın genel iş akışı şematik bir bakış şekil 1' de sunulmuştur.

Bu Ca2 + seferberlik tahlil öncelikle tanımlamak ve rekabetçi CXCR4 antagonistleri (Yani, bağlama ve reseptör teşvik endojen agonist önlemek bileşikler), inhibitör potens belirlemek için yolculuklarında uygulanmış olsa o da reseptör agonistleri belirleyebilir ve buna ek olarak, maddeler ve birleşimler işlevlerine göre bağlama (Yani, arazi endojen agonist tarafından işgal orthosteric bağlama site farklı siteleri) allosteric sitelerdeki uygulamayın. Allosteric agonistleri ve PAMs ve NAMs19,20ikinci kategoriye bileşiklerin örnekleridir. NAMs yanı sıra özel reseptör antagonistleri CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt inhibe ise, PAMs bu yanıtı artıracak (Ayrıca bkz: tartışma bölümü). Tahlil burada özellikle hedefleri CXCR4 açıklanan rağmen bu yöntem en az optimizasyonu çaba ile diğer GPCRs için en az uygulanabilir öngörülmektedir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak yolu ile isaret edersem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bölüm 1 ve 2 altında açıklanan tüm adımları laminar akışı kabine steril koşullarda yapılmaktadır.

1. U87 bakım. CD4.hCXCR4 hücreleri

  1. T75 kültür şişeler 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka hücrelerinde büyür.
    Not: Bu protokol için kullanılan vitro hücre kültürünü stabil küme 4 farklılaşma (CD4) ve insan ifade bir U87 glioblastoma hücre çizgidir CXCR4 ve yukarıda açıklanan17oldu. CD4 ve CXCR4 hücre yüzey ifade sürekli Akış Sitometresi tarafından takip ve ifade düzeyleri zaman içinde sabit kalır (~ % 100 CD4+ ve ~ %100 CXCR4+ hücreleri). Kullanılan hücre ve reseptör ifade düzeyleri araştırmak için Akış Sitometresi yordamı üretimi ayrıntılı bir açıklamasını bu protokol kapsamında değil.
    1. Alt kültür hücreleri % 80-85 confluency. Hücre kültürü çalışmalarının daha önce oda sıcaklığında (RT) ulaşmak tüm reaktifler izin.
    2. Hücrelerdeki şartına kültür orta kaldırmak ve hücre monolayer kez 5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın.
    3. 3 mL % 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve eşit olarak hücre monolayer dağıtın. Ardından tripsin-EDTA fazlalığı kaldırmak ve hücreleri ayırmak başlayana kadar 37 ° C'de 5 dakikaya kadar kuluçkaya.
    4. 10 mL taze tam büyüme orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) + %10 Fetal sığır Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + uygun seçimi aracıları) ekleyin. Hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından resuspend. Hücre süspansiyon steril 50 mL tüp aktarın.
    5. Seçtiğiniz yöntemi kullanarak hücrelerin sayısını saymak. U87 glioblastoma hücreleri söz konusu olduğunda, genellikle canlılığı ulaşır ~ % 100.
      Not: Hücre sayıları çeşitli şekillerde belirlenebilir. Trypan ( Tablo malzemelerigörmek) Boyama mavi dayalı bir otomatik hücre analiz sistemi düzenli olarak kullandığımız standart yordamlar, ancak diğer terbiye işleme göre eşit derecede iyi çalışması gerekir.
    6. 2 x 106 veya 3 x 106 () hücrelerin 25 mL taze büyüme aracı olarak bir T75 kültür şişesi son hacmi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
      Not: 3 x 106 hücreler kullanılır hücreleri % 80-90 confluency 2 gün sonra ulaşacak. 2 x 106 hücre kullandıysanız, aynı confluency 3 gün sonra ulaşacak. Diğer hücre hatları kullandıysanız hücrelerin büyüme oranı ilk ampirik olarak tespit edilmelidir.

2. Ca2 + seferberlik tahlil için tohum hücrelerini

  1. Hücre ceket siyah duvarlı polistren 96-şey plakaları ve netlik (0 gün), passaging gününde % 0,1 jelatin çözüm ile hücre eki kolaylaştırmak için (bkz. Tablo reçetesi) alt.
    Not: Eğer piyasada bulunan (bakınız Tablo reçetesi) olan ön kaplamalı plakalar, kullanılan jelatin ile 96-şey plakaların kaplama ihmal. Bu iletişim kuralı ile devam etmeden önce soruşturma altında her hücre satırı yerine el ile kaplama ön kaplamalı plakalar kullanımına değerlendirmek için tavsiye edilir.
    1. Jelatin çözüm 100 mL % 1 çözüm elde etmek için PBS 1 g jelatin ekleyerek hazırlayın. Tarafından daha fazla kullanımdan önce PBS ile 10 x oranında seyreltin. Jelatin çözünürlük artırmak için çözüm ile 37 ° c ısı
    2. 100 µL % 0,1 jelatin çözüm bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plaka kuyu başına ekleyin. Dik 2 h için kuluçkaya
  2. Bu arada, hücreleri kaplamalı 96-şey plaka tohum için hazır olun.
    1. Kültür şişeye hücrelerden ayırmak, onları taze büyüme aracı olarak resuspend ve bunları kabul trypan yöntemi boyama mavi kullanarak.
    2. Spin aşağı 50 mL tüp RT. de 400 x g, 5 min için hücrelerde
    3. Taze büyüme orta hücrelerde resuspend (DMEM + %10 FBS + % 1 HEPES, hiçbir antibiyotik) x 106 (uygun) hücre/mL 0.1 hücre yoğunluğu elde etmek için.
  3. Jelatin çözüm açık alt siyah duvarlı pilakalar plaka üzerinde saygısız ve bir doku üzerinde kurutma tarafından kaldırın. 200 µL/iyi aşırı jelatin kaldırmak ve plaka üzerinde yeniden çevirmek için PBS ekleyin.
  4. Jelatin kaplı 96-şey plaka bir kuyu başına 200 µL (0.2 x 105 hücreleri karşılık gelen) hücre süspansiyon dağıtmak (şu andan itibaren bir tabak daha fazla için "ölçüm plaka" ifade edilecektir).
  5. Gece saat 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.

3. yükleme ile bir floresan Ca2 + hücre-hassas boya

  1. Gün 1 numaralı seribaşı hücre ile floresan Ca2 +yükleme ile başlayan gerçek Ca2 + seferberlik tahlil, gerçekleştirmek-bağlama boya fluo-2 AM.
    1. Tahlil arabellek 40 mL HEPES (1 M) ekleyerek 200 mL Hank'in dengeli tuz solüsyonu için (HBSS, 10 x, yok fenol red, hiçbir sodyum bikarbonat) hazırlayın. 2 L son hacmi edinmek ve 4 g sığır Serum Albumin (BSA) eklemek için ultrasaf su ekleyin. BSA manyetik karıştırma üzerinden geçiyoruz. PH 7,4 (NaOH ile) için ayarlamak ve çözüm filtre.
      Not: tüm aşağıdaki adımları sırasında "tahlil tampon" anılacaktır aynı arabellek kullanılır.
    2. Stok çözeltisi (Dimetil sülfoksit (DMSO) 4 mM) floresan Ca2 +hazırlamak-duyarlı boya fluo-2 AM. Işığa karşı aşırı maruz kaçının. 1 mg fluo-2 dağıtılması AM (Moleküler ağırlığı: 1,061 g/mol) 235,6 µL DMSO içinde.
    3. Fluo-2 AM çalışma çözeltisi hazırlamak. Bir 96-iyi tahlil plaka için 12.5 µL fluo-2 AM hisse senedi çözüm (4 mM) ve 12.5 µL Nonyonik yüzey aktif Poliol (örneğin, pluronic f-127) çözüm mix (%20 ağırlık/hacim DMSO, bkz: Malzemeler tablo). Bu karışımdan 22 µL 11 mL tahlil arabellekte bir 15 mL tüp ekleyin. Son fluo-2 AM 4 µM bölgedir.
      Not: Nonyonik yüzey aktif fluo-2 AM ve sonuç hücre yükleme geliştirmek için sulu çözünürlük artırmak için dispersiyon ajanı kullanılır. Yüzey aktif DMSO içinde solubilize için örnek 37 ° C ve karışımı düzenli olarak homojen bir çözüm elde etmek için ısı.
    4. Büyüme orta 96-şey ölçüm plaka daha önce sağlanan hücrelerden plaka üzerinde saygısız ve bir kağıt havlu kurutma çıkarın.
    5. Boya çözüm bir çok kanallı pipet kullanarak iyi başına yükleme 100 µL ekleyin ve karanlıkta, RT 45 dk için kuluçkaya.

4. Kemokin Ligand CXCL12 veya soruşturma altında bileşikler içeren hazırlanması 96-şey polipropilen levhalar

  1. Yuvarlak alt polipropilen (PP) 96-şey tabak ( Tablo malzemelerigörmek) edinin.
    1. CXCL12 hisse senedi çözüm izin (1 mg/mL) ve RT. equilibrate izlemeye bileşiklerin hisse senedi çözüm
      Not: CXCL12 hisse senedi çözüm %0.01 Tween20 ile desteklenmiş ve tek kullanımlık aliquots-20 ° C'de depolanan ultrasaf su hazırlanır.
    2. 5 x CXCL12 konsantre çözüm içinde tahlil tampon hazırlamak (31,25 eşit 250 ng/mL nM) ve 5 x konsantre seyreltme her bileşik (içinde tahlil tampon).
    3. Önceden tanımlanmış plaka düzen göre uygun 96-şey plaka içine stok çözümleri dağıtmak. 75 µL/iyi içinde CXCL12 içeren plaka dağıtmak ("Kemokin plaka"), 50 µL/iyi içinde bileşikleri ("bileşik plaka") içeren plaka dağıtmak.
      Not: Her ikisi de bileşikleri ve nihayet olmak CXCL12 olacak seyreltilmiş ölçüm plaka dağıtımı üzerine 5 x. Negatif kontrol wells bileşik plaka yanı sıra, hem Kemokin plaka arabellekte sadece tahlil içeren eklemek önemlidir. Ayrıca pozitif kontrol wells dahil edilmesi gerekir (Yani, kuyuları CXCL12 Kemokin plaka ile ama tahlil arabelleği bileşik plaka karşılık gelen Wells ile).

5. iletişim kuralı ayarları Floresans Mikroplaka okuyucu

Not: Bu protokol için kullanılan Floresans Mikroplaka okuyucu Malzemeler tablobaşvurulur.

  1. İlk floresan plaka okuyucu soğutucu birimi kapatın ve floresan okuyucu kendisi açın. Birkaç dakikalığına başlatmak ve sistem yazılımı açık bırak.
  2. Tahlil'ın Protokolü aşağıdakileri içerir sürükle ve bırak menüsünü kullanarak oluşturun:
    1. "Ayarlar" kutusunda, 'Read_Mode' uyarma dalga boyu ile seçin: 470-495 nM; emisyon dalga boyu: 515-575 nM.
      Not: Seçilen dalga boyu ile Ca2 +kullanım için uygundur-hassas boya fluo2.
    2. Aygıtın kaynak 2 konumunda koyacağız bileşik plaka, bileşiklerin otomatik karıştırma için ise "Mix ile TF" (transferi sıvı) kutusu içerebilir (bkz. Adım 6.4). Çözüm 15 µL her şey otomatik olarak emişli ve üç kez karışık için seçin. Pipet ipuçları, sıvı yüzeyinin altında 20 µL yüksekliğini ayarlayın. Aspirasyon ve 50 µL/s dağıtım hızını ayarlayın.
      Not: Pipet ipuçları yüksekliğini pipet İpuçları altında yaptı birimi anlamına gelir. Bileşik bir tabak kuyu 50 µL içeriyorsa, örneğin, 30 µL yüksekliğini sıvı yüzeyinin altında 20 µL karşılık gelir. Karıştırma sırasında bileşik çözüm mix için geçen, karıştırma hızı, pipet konumunu hacmi ipuçları ve döngüleri karıştırma sayısını tüm belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanılarak ayarlanabilir.
    3. O 20 µL her "Sıvı Transfer" kutusunda tanımlayın bileşik plaka kuyudan ölçüm plaka transfer. Pipet ipuçları 20 µL pozisyon sıvı Yani, Yükseklik 30 µL bileşiklerin aspirasyon sırasında ve yükseklik 60 µL ölçüm plaka dağıtımı sırasında yüzey. Aspirasyon 50 µL/s hızı ve 25 µL/s dağıtım hızını ayarlayın.
      Not: Bileşik plaka çözüm iyi başına 50 µL içerir (bkz. Adım 4.1.3), 30 µL yüksekliğini bir pozisyon 20 µL sıvı yüzeyinin altında böylece karşılık gelir. Ölçüm plaka başına iyi tahlil arabellek 80 µL içerir (bkz. Adım 6.3), böylece 60 µL yüksekliğini ipuçları benzer bir konuma karşılık gelir.
    4. "Okuma ile TF" düğmesini seçin. İlk aralığında 10 okuma bileşikler ölçüm plaka dağıtımı önce kaydedilir ve daha sonra 50 okur 1 s. tanımla okuma aralığı süresi ile 60 okuma (floresan ölçüler) seçin. 30 okuma aralığı süresi ile ikinci aralığı tanımlamak s ve 18 defa okundu.
      Not: Bu adımı sırasında Floresans kinetically (tanımlanmış zaman aralıklarında) için ölçülen olacak ~ toplam 10 dak.
    5. "Yıkama İpuçları" düğmesini iletişim kuralında dahil üç kere. Her yıkama adım içinde sıvı türünü seçin: sıvı (ultrasaf su) ya da sıvı B yıkama döngüsü (1), pompa sayısı (% 70 etanol), hız (hızlı) ve vuruş (5) her boyunca sayısı adım yıkayın.
      Not: İlk ve son yıkama adım akıcı A, B kullanılan ikinci yıkama adım sıvı sırasında kullanılır.
    6. "Pause Pipettor" işlevi bulunur. 300 için duraklatmak için pipettor ayarla s.
      Not: Bu adım iletişim kuralında dahil ederek, Floresans plaka okuyucu cihazda entegre edilmiştir, pipettor baş 5 min için protokol devam etmeden önce duraklatılır.
    7. Aygıtın kaynak 3 konumda yerleştirilmiş olacaktır Kemokin plaka, CXCL12 çözümünde otomatik karıştırma sağlamak için "Mix ile TF" kutusunu içerir (bkz. Adım 6.4). Çözüm 15 µL her şey otomatik olarak emişli ve üç kez karışık için seçin. Aspirasyon ve karıştırma sırasında pipet ipuçları 20 µL sıvı yüzeyinin altında yerleştirin. Aspirasyon ve dağıtımı hız 50 µL/s ayarlanır.
      Not: Bu parametreler benzer adım 5.2.2 gelince, ayarlanabilir.
    8. Sonraki "Sıvı Transfer" kutusunda her 25 o µL tanımlayın de Kemokin plaka ölçüm plaka aktarılır. Pozisyon 20 µL ipuçları sıvı Yani, yüksekliği 55 µL 75 µL/iyi içerir Kemokin plaka aspirasyon sırasında yüzey (bkz. Adım 4.1.3) ve yüksekliği 80 µL ölçüm plaka dağıtımı sırasında. Aspirasyon 50 µL/s hızı ve 25 µL/s dağıtım hızını ayarlayın.
    9. "Okuma ile TF" düğmesi ekleyin. İlk aralığında 5 okuma CXCL12 ölçüm plaka dağıtımı önce kaydedilir ve daha sonra 140 okur 1 s. tanımla okuma aralığı süresi ile 145 okuma seçin. 6 s seçeneğini belirleyip bir okuma aralığı süresi ile ikinci aralığı tanımlamak 20 defa okundu.
      Not: birlikte, ele alındığında boyunca tüm protokolünün 243 okuma (floresan ölçüler) kaydedilir: adım 5.2.4'ten ve 165. adımı 5.2.9 78.
    10. 5.2.5 adım, "ipuçları yıka" düğmesi dahil üç kere protokol için benzer.
      Not: Protokolü'nün sonunda bu adım dahil ipuçları ipuçları değiştirmek gerek kalmadan başka bir tahlil gerçekleştirmek için yeniden kullanılabilir sağlar.
  3. Cihazın sıcaklık 37 ° C'de "sahne sıcaklık ayarla" düğmesini tıklatarak ve 37 ° c seçerek ayarlayın

6. çalışan Floresans tahlil

  1. Ölçüm sonra plaka 45 dk için arabellek yükleme ile inkübe (bkz. Adım 3.1.5), plaka üzerinde saygısız tarafından arabellek kaldırmak ve bir doku üzerinde kuru.
  2. 150 µL/iyi tahlil arabelleği ekleyerek numaralı seribaşı hücreleri yıkama ve 2 min için kuluçkaya.
  3. Arabelleğin yeniden plaka üzerinde saygısız kaldırın. 80 µL/iyi tahlil arabelleği çok kanallı pipet ile ekleyin.
  4. Tüm plakaları uygun konumlarına cihazın içine koymak: 2 kaynağı konumundaki bileşik plaka, kaynak 3 pozisyonda Kemokin plaka ve ölçüm plaka okuma konumunda. Bir kutu siyah ipuçları kaynak 1 ipuçları konumda koy. Cihazın kapıyı kapat ve 5 min için protokol devam etmeden önce kuluçkaya.
  5. Plaka üzerinde arka plan göreli ışık birimleri (RLUs) ve floresan farkı belirlemek için "İletişim kuralı sinyal testi" düğmesini seçin. Yeni bir pencere açılır. "Sinyali Test" seçin.
    Not: Bu adım sırasında arka plan RLUs floresan okuyucu cihazın optik bölme entegre ICCD kamera tarafından belirlenir. Bu RLUs Ca2 +uyarma neden-hassas boya (fluo-2) ışık yayan diyotlar (LED'ler) tarafından (LED çıkış dalga boyu 470-495 nm). 8.000-10.000 RLUs değerleri de bu uygulama için uygundur. RLUs gerekirse, uyarma yoğunluğu (Exc. yoğunluğu seçin) veya kamera kapıyı (seçin kapısı açık) değiştirerek adapte edilebilir. Varyans plaka üzerinde ideal % 7.5'den az olmalıdır.
  6. 8.000-10.000 RLUs arka plan değerlerini elde edilen "Update" seçin. Ana protokol kaydetmek için Kaydet düğmesini tıklatarak.
    Not: Böylece, protokolü sinyali test ayarlarından ana protokole devredilmesini.
  7. Tahlil "Çalıştır" düğmesine basarak çalıştırın.

7. veri analizi ve kalite

  1. Tahlil tamamlandıktan sonra sistem yazılım "Analiz" kutusunu açın.
    1. "Düzeltmeleri yapılandırmak" ve "yanıt Bankası hattı üzerinden" seçmek için gidin. Temel ölçüm 1 ve 5 ölçüm sonunda başlatmak için hat 1 tanımlamak; ortalama Floresans her iyi ölçüm 1 ile 5 arasında hesaplanır.
      Not: Belirli bir gelen tüm daha fazla ölçüleri de bu şey özel taban çizgisinin 1 tarafından ayrılır.
      1. Temel ölçüm 78 ölçüm 83 kadar başlatmak için hat 2 tanımlamak (CXCL12 ölçüm 83 sonra reçete; yine ortalama Floresans her şey arasında ölçüm 78 ve 83 ve bu düzeltme faktörü takip tüm ölçümler için uygulanan hesaplanır Ölçüm 83).
    2. Onay kutusunu etkinleştirmek "yüzde olarak göster" ve "arka plan çıkarmak".
    3. "Kinetik azaltma yapılandırmak için" gidin. CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt inhibitör etkisi bileşiklerin değerlendirmek için Max-Min ölçüm 84 (Yani, sonra CXCL12 reçete ilk ölçüm) 243 (Yani, son ölçüm) başlangıç seçin.
      Not: Ölçüm 84 ve ölçüm arasındaki temel üzerinde minimum ve maksimum yanıt arasındaki farkı Max-Min seçerek 243 bildirilmektedir. Max-Min ölçüm 11 ve ölçüm 78 arasında başlayan seçilirse, temel temel 1 göre üzerinde minimum ve maksimum yanıt arasındaki farkı bildirilmektedir. Bu değer kullanılabilir bileşikler potansiyel agonistik etkinliğini analiz etmek, konuyabakın).
    4. Verileri sistem yazılım görüntülenmeyecektir. Gerekirse, ek analiz ve görselleştirme diğer ortak analiz yazılım paketleri için ham veri verin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CXCL12 uyarım intrasellüler Ca2 + mobilizasyon U87 üzerinde etkisi. CD4.CXCR4+ ve U87. CD4 hücreleri Ca2 + seferberlik tahlil ile değerlendirilmesi. Yerine 20 µL normalde Protokolü (şekil 1) pipetting ilk adımında eklendi test bileşik tahlil arabellek eklendi fluo-2 AM U87 yüklü. CD4.CXCR4+ hücrelerde ölçüm plaka. İkinci dağıtım adımı, CXCL12 farklı konsantrasyonları (0.2-102,4 nM, son konsantrasyonu) ölçüm plaka reçete. Floresan, serbest bırakılması Ca2 +, bir doz bağımlı artış ile korele doz bağımlı artış gösterilmiştir (şekil 2A). Burada, hangi, her iki eklemeler sadece tahlil arabellek eklendi ölçüm plakasına bu kuyu negatif denetimi örneğini temsil eder (Yani, 0 nM CXCL12), bir yanıt (şekil 2A) yokluğunda elde edilen. CXCL12 miktarda artan floresan (şekil 2A) zamanla çürüme yüksek düzeyde teşvik. Bu verilerden bir doz yanıt eğrisi "Max-Min yanıt temel üzerinde" ölçüm 84 (Yani, ilk ölçüm CXCL12 toplama sonra) ve ölçüm 243 arasında dayalı oluşturulan (i.e., iletişim kuralındaki son ölçüm ). Doğrusal olmayan regresyon kullanarak, EC50 değeri (Yani, yarım maksimal yanıt uyandırmak için gerekli konsantrasyonu) tespit edildi ve 1.14 için karşılık gelen nM (şekil 2B). Hiçbir floresan Ca2 +-yanıt bile yüksek konsantrasyonu CXCL12 tarafından uyarılmış ilgili (102,4 nM), ne zaman U87. Fonksiyonel CXCR4 ifade eksik CD4 hücreleri kullanılmıştır. Bu CXCL12 tarafından uyarılmış ölçüm reseptör özgüllük gösterilmiştir (şekil 2C).

Bir anahtarı uygulama için bu hücre tabanlı tahlil küçük moleküller özellikle CXCR4 hedef tanımlaması ve CXCL12 kaynaklı Ca2 + seferberlik inhibe yeteneğine. Eğer aktif bileşikler ("sayısı") tanımlanır, onlar daha da bahçedeki seri dilutions test ve inhibitör etki gücüne daha ayrıntılı analiz tarafından karakterize edilebilir. Örneğin, bicyclam AMD3100, bir iyi kurulmuş küçük molekül CXCR4 özgü reseptör antagonisti ile güçlü anti-HIV-1 etkinliği21,22, etkisini şekil 3' te gösterilmektedir. AMD3100 bir konsantrasyon dizi (n = 4, 1/3 seyreltme serisi 1,37 nM son konsantrasyon aşağı 3 µM) U87 üzerinde kalmaması. CD4.CXCR4+ hücreleri Protokolü'nün ilk adımı. Bileşik sonra için hücreler kuluçkaya için izin verildi ~ 10 dk boyunca Floresans sinyal kaydedildi sürekli. O zaman 6.4 nM CXCL12 (50 ng/mL, son konsantrasyonu) aynı anda CXCR4 aracılı Ca2 + seferberlik ikna etmek için hücre plaka bütün wells için eklendi. Bu yanıt AMD3100 farklı dilutions tarafından inhibisyonu doz bağımlı şekil 3Aiçinde gösterilir. Bu durumda, yalnızca bir bölümünü CXCL12 eklenmesi aşağıdaki grafik gösterilir. Bir negatif kontrol (mavi çizgi) tek arabellek tahlil (AMD3100, wells için ekledi hiçbir CXCL12 ile hiçbir ön kuluçka) uygulandı, yanıt beklenen eksikliği kaynaklanan. Hangi 6.4 örneklerinde olumlu denetim (kırmızı çizgi) karşılık gelen nM CXCL12 AMD3100 ön kuluçka olmadan wells için eklendi (şekil 3A). Bunlar üzerinde tanımlanan temel negatif ve pozitif denetler Z', bu tahlil genellikle değerdir 0.5 ve 1 arasında. Bir doz-yanıt eğrisi doğrusal olmayan regresyon bir hesaplanan ŞA50 değeri 770.8, kaynaklanan tarafından oluşturulur AMD3100 inhibitör potens belirlemede nM (şekil 3B). Daha fazla etkin olmayan bileşik davranışını göstermek için maraviroc bu deneyde eklenmiştir. Maraviroc olduğunu özellikle böylece engelleme CC Kemokin reseptör 5 (CCR5) inhibe bağlanabilecek küçük bir moleküldür (CCR5)-tropic HIV-1 enfeksiyonu23 . Bile yüksek konsantrasyonu (10 µM son konsantrasyonu) CXCR4 aracılı Ca2 + yanıt (şekil 3A) üzerinde inhibitör etkisi olan bu bileşik gözlendi.

Son olarak, bu Ca2 + seferberlik tahlil de diğer GPCRs, CC Kemokin ligand 5 (CCL5), seri bir seyreltme çalışmaya uygulanabilir göstermek için endojen ligand CCR5 için eklendi CCR5 ifade hücrelere (U87. CD4.CCR5+) tam olarak aynı deneysel koşullar ve donanım ayarlarını kullanarak. Bir doz bağımlı floresan Ca2 + yanıt CCL5 seri bir seyreltme eklenmesinden sonra gösterilmiştir (şekil 3 c). Buna ek olarak ve onun CXCR4 etkisi, 100 ile ön kuluçka aksine nM maraviroc (son konsantrasyonu) bu yanıtı (şekil 3D) kuvvetle inhibe.

Figure 1
Şekil 1: tahlil'ın iş akışı şematik bakış. Gün 0 hücrelerde GPCR (Bu durumda CXCR4) ilgi ifade siyah duvarlı 96-şey pilakalar ve açık alt tohumlari ve 37 ° C ve %5 CO2gecede yetiştirilir. 1. gün Floresans tabanlı Ca2 + tahlil gerçekleştirilir. Hücreleri ilk yüklü bir floresan Ca2 +ile-hassas boya (fluo-2 AM) ve karanlıkta RT, 45 dakika inkübe. "Kemokin plaka" ve "bileşik plaka" hazırlanır (PP polipropilen =). Boya yükleme ile kuluçka sonra numaralı seribaşı hücreleri bir kez daha sonra 80 µL/iyi tahlil arabelleği eklenir tahlil ile tampon (150 µL/de) yıkanır. Tüm plakaları o zaman içinde belgili tanımlık aygıt 37 ° C'de 5 min için tahlil başlamadan önce inkübe. Sonra bileşikler (örneğin, küçük moleküller) ilgi ölçüm plaka kuyu içine istenilen konsantrasyonu reçete ve için kuluçkaya için izin ~ 10 dk süre Floresans sürekli olarak ölçülür. Daha sonra (burada CXCL12) GPCR endojen agonist sabit bir konsantrasyon Ca2 + yayın uyandırmak için eklenir ve floresan daha fazla zaman içinde kaydedilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Agonist etkinliği CXCR4 üzerinde CXCL12+ hücreleri ve algılanan yanıt özgüllüğü. (A) doz bağımlı etkisi CXCL12 Ca2 + mobilizasyon U87. CD4.CXCR4+ hücreleri. (B) temel ölçüm 84 ve 243 bir doz-yanıt eğrisi oluşturulur ve hesaplanan EC50 değeri arasında üzerinde Max-Min yanıt göre (n = 4, ± SD demek). (C) üzerinde U87 reçete ne zaman yanıt tarafından CXCL12 akımıdır. CD4 hücreleri CXCR4 eksik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Çizimi CXCR4 antagonisti (AMD3100) ve bir etkin olmayan bileşik (maraviroc) CXCR4 üzerindeki etkisini+ hücreleri ve harekete geçirmek-in onun endojen agonist CCL5 tarafından CCR5. (A)doz bağımlı AMD3100 6.4 ekleyerek uyarılmış Ca2 + seferberlik üzerinde inhibitör etkisi nM CXCL12 U87 için. CD4.CXCR4+ hücreleri. Maraviroc (at 10 µM son konsantrasyonu) CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt üzerinde inhibitör etkisi gösterdi. (B) dayalı temel ölçüm 84 ve 243 arasında üzerinde Max-Min yanıt, bir inhibitör doz-yanıt eğrisi oluşturuldu ve ŞA50 değeri 770.8 olarak hesaplanmıştır nM (n = 4, ± SD demek). (C) doz bağımlı CCR5 endojen onun agonist CCL5 tarafından aktivasyonu. CCR5 aracılı Ca2 + yanıt 100 içeren hücrelerin ön kuluçka tarafından inhibisyonu (D) maraviroc nM. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 +-burada açıklanan seferberlik tahlil tanımlamak ve CXCR417hedefleme reseptör antagonistleri karakterize etmek için değerli bir araç olarak daha önce gösterildi. Ancak, bu yöntem daha genel olarak bir sitozolik Ca2 + serbest bırakılmasıyla onların harekete geçirmek, tetikler diğer GPCRs büyük bir grup için ilgili Kemokin reseptör CCR5 gösterildiği gibi uygulanabilir olduğunu tahmin edilmektedir. CCR5 durumunda tam olarak aynı deneysel koşullar uygulanabilir ise birkaç adımda iletişim kuralı (örneğin, cep numarası, kaplama, hücreleri floresan bir boya ile yüklenmesini) için tahlil aktarmadan önce yeniden en iyi duruma getirilmiş olması gerekecektir bir olumlu sinyal-gürültü oranı elde etmek için diğer GPCRs. Önemli bir konu da üst düzey ifade GPCR faiz ve Ca2 + yolu için fonksiyonel bağlantı sağlayan bir uygun vitro hücresel ana seçimdir. CXCR4 durumunda, insan glioblastoma U87 hücreleri nedeniyle seçildi: (1) CXCR7 endojen ifade eksikliği (CXCR4 olarak aynı agonist kapladığı bir ilgili Kemokin reseptör), CXCR4 harekete geçirmek Ca2 +çift (2) yeteneklerini-sinyal Floresan yanıt olumlu dinamik aralığını elde ile Ca2 +hücre yükledikten sonra yol, (3)-hassas boya (4) tahlil mükemmel onların bağlılığı tabaklar minimize hücre ve rahatsızlık prosedürü boyunca. Tüm bu parametrelerin her roman GPCR ilgi ve her hücresel ifade sistem için deneysel olarak belirlenmesi gerekir.

Benzer bir tahlil için başka bir GPCR ayarlarken, birkaç alternatif adımlar ya da reaktifler protokolündeki kabul edilebilir. Örneğin, diğer Ca2 +-hassas fluorophores (örneğin, fluo-4, fluo-3) fluorophore (fluo-2) Bu protokol için kullanılan bir seçenek olarak kullanılabilir. Durumunda, gevşek yapışan hücreleri, hücrelerinin yıkama24kekii hücre en aza indirmek için no-yıkama boya tanıtarak ihmal. Ayrıca, çamaşır adım iletişim kuralından hariç daha da tahlil'ın iş çıkarma yeteneğini artırmak. Her ne kadar bu tahlil de CXCR4 örneğin insan kanser hücre hatları10,25, çeşitli türleri de dahil olmak üzere, endojen ifade gösterilen hücrelerle yapılması bu stabil transfected hücre ile yüksek GPCR hatları olması gerekmektedir zaman içinde stabil ifade düzeyleri elde edilebilir. Bu daha fazla yol açar tahlil ölçümleri belirgin, tutarlı ve güvenilir veri yorumu için daha büyük bir pencere tahlil performansın daha uzun vadede. Hücreleri endogenously kullanırken CXCR4 ifade o bu sonucu elde etmek çok daha zor olacak.

Floresans ölçüm üzerinde dayanır testin büyük bir dezavantaj olduğunu. Bu nedenle, autofluorescent bileşikleri analiz yorumu güvenilir olmayan veriler nedeniyle da bunları dışarıda tutar tahlil'ın ölçüm engelleyebilir. Ayrıca, bu Ca2 + seferberlik tahlil ideal eleme sistemi bir standart karıştırma sağlar entegre pipetting sistem ve dispension bileşikler ve reseptör agonist içine tüm ölçüm plaka ile donatılmış bir hücresel kullanılarak gerçekleştirilir aynı anda kuyuları. Ancak, tahlil diğer, daha az pahalı Floresans Mikroplaka Okuyucular Kinetik ölçüm yetenekleri ile kullanılmak üzere adapte olabilir. Bileşikler ve agonist eklenmesi sonra elleriyle on süreyi artırır ve tahlil'ın verimi düşürür çok kanallı Pipetler, kullanarak el ile yapılması gerekir. Ayrıca, Floresans ölçümler benzer bir dizi Kinetik bir tahlil bir belirtilen saat aralığında elde high-end tarama sistemleri tüm wells ölçmek ise birçok Mikroplaka okuyucu sinyalleri iyi iyi ölçmek ulaşmak için zor olurdu aynı anda.

Reseptör antagonistleri engelleyen bağlama reseptörü ve endojen agonist (CXCL12) tarafından sonraki harekete geçirmek için şu anda özellikle CXCR411,12hedef bileşiklerin ana kategori oluştururlar. AMD3100, Ca2 + seferberlik tahlil, performansını göstermek için kullanılan küçük molekül CXCR4 antagonistleri26en önemli örneklerinden biridir. Reseptör antagonistleri yanı sıra, farklı sinyal GPCR düzenleyen molekülleri genel ilgi de kaldırın. Bu moleküller ters agonistler, yanı sıra GPCR PAMs ve NAMs19,20,27içerir. Bir ilginç, bu el yazması açıklanan tahlil bunu sadece reseptör antagonistleri, aynı zamanda agonistleri ve allosteric modülatörler tanımlayabilmesi özelliğidir. Ancak, bazı küçük uyarlamalar tahlil ve sınırlamalar dikkate alınması gerekir.

PAMs ve NAMs arazi reseptör'ın endojen ligand tarafından işgal orthosteric bağlama sitesinden farklı reseptör sitelere bağlamak. PAMs kudret ve/veya reseptör'ın endojen ligand(s) etkinliğini geliştirmek ise, NAMs kudret ve/veya endojen ligand(s)19,20etkinliği inhibe. PAMs hiçbir içsel agonist etkinliğine sahip. Onlar sadece sözde allosteric agonistler aksine endojen agonist huzurunda etkindir. Allosteric GPCR modülatörler klinik ayarları28',29, uygulanan klasik reseptör antagonistleri daha az yan etkileri uyandırmak çünkü değerli farmakolojik araçlar vardır. Bizim tahlil allosteric agonistler Floresans sinyalinin hemen sonra CXCR4 için ek geçici bir artış uyandırmak+ hücreleri. Bu sinyal reseptör özgüllük sonra aynı bileşik aynı tahlil ile ama CXCR4 eksik hücreleri üzerinde test ederek tespit edilmelidir. Özellikle PAMs için eleme, endojen agonist daha düşük bir konsantrasyon içinde tahlil floresan Ca2 + yanıt ikna etmek için kullanılmalıdır. Bu alt agonist miktarı küçük bir floresan sinyal oluşturur rağmen ek reseptör stimülasyon algılamak için daha büyük bir pencere yaprakları. Genellikle, EC10- EC30 değerini reseptör uyarılması için karşılık gelen bir agonist konsantrasyonu30,31seçilir. Bir PAM ilavesi testin ilk bölümü boyunca artan bir floresan ölçüm yol. Ancak, floresan Ca2 + sinyal reseptör sonraki uyarılması ile onun endojen agonist sonra artış olacaktır. Benzer şekilde, bir NAM agonist ek önce floresan ölçüm değiştirmez ama reseptör'ın yanıt agonist eklenmesinden sonra inhibe etmez. Bu nedenle, bir NAM ve reseptör antagonist aktivite profil benzer görünecektir. Her ikisi de floresan yanıt inhibisyon agonist ek sonra neden olur. Bu nedenle, deneysel çalışmalar daha da bir antagonisti ve bir NAM arasında ayırımcılık yapması gerekir. Buraya, sayede etiketlenmemiş bileşikler ile sabit bir miktar olan rekabet reseptör bağlama çalışmaları için bağlama CXCR417,32 önleyecek bir antagonisti arasında ayırımcılık için değerli bir strateji olabilir CXCL12 etiketli reseptör ve değil aynı reseptör bağlama site paylaşmak gibi istiyorsunuz bir NAM bağlama agonist etiketli.

GPCRs ligand bağımsız (veya Bazal veya kurucu) etkinliği gözlenen için çok sayıda GPCRs33 GPCRs recombinantly ifade edilir zaman Bazal aktivite düzeyi genellikle oldukça düşük olmasına rağmen27. Bazal GPCR aktivite gelişmiş doğal olarak meydana gelen mutasyonlar33 ve etkinliği olmuştur artan Bazal CXCR4 için önde gelen bir nokta mutasyon açıklanan önceki34. O was göstermek için feromon yanıt yolu Maya içinde bu yapısal etkin CXCR4 mutant kaplin ve [35S] GTPγS bağlama deneyler, o T140, güçlü Anti-HIV etkinliği17,35 ile peptid tabanlı CXCR4 antagonisti önemli ölçüde Bazal bu etkinliği azalmıştır ve böylece bir ters agonist34davranmaya gösterildi. Not, bir Fura-2 floresan tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil aynı yazarlar bir küçük geçici düşüş Ca2 +gözlenen-ilgili floresan T140 eklenmesi, Bazal bir düşüş düşündüren mutant CXCR4, ifade hücrelere takip reseptör etkinlik34. Ancak, döngüsel pentapeptid tabanlı CXCR4 ters agonistler oluşan ek bir panel analiz T140 tasarlanmış bir Ca2 + seferberlik tahlil ile sınırlı Bazal aktivite tespiti, daha az basit36oldu. Ne zaman T140 etkisi vahşi türü CXCR4 ifade hücreleri Ca2 + seferberlik tahlil bu el yazması açıklandığı gibi kullanarak analiz edildi, Bazal Floresans sinyal bir değişiklik yok17gözlendi. Ayrıca, Floresans dalgalanmaları hızlı ve geçici ve Bazal Ca2 + artışlar Örneğin, değil gözlenen yapısal etkin Gαqifade hücrelerde-reseptörleri4birleştiğinde. Birlikte ele alındığında, ters agonistler etkisini çok zor, imkansız olmasa tanımlamak ve güvenilir bir şekilde bizim tahlil ile değerlendirmek olurdu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Eric Fonteyn ve Geert Schoofs mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser KU Leuven tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (iki, hayır vermek. G.485.08) ve Fondation Dormeur Vaduz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-2 AM Abcam ab142775 fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G pluronic acid
Gelatin Sigma G9391
AMD3100 Sigma A5602-5 mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc kind gift of AnorMed antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12 PeproTech 300-28A
Chemokine ligand CCL5 PeproTech 300-06
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco (Life Technologies) 41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1 M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red Gibco (Life Technologies) 25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Falcon tubes, 50 mL Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid Costar/Fisher Scientific 10530753 assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates Thermo Scientific (VWR) 732-2661 plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system Molecular Devices Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm Molecular Devices 0200-6128 Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm Molecular Devices 0200-6203 emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head Molecular Devices 0310-4536 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks Molecular Devices software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL Beckman Coulter cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile Corning 3340 Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  3. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  4. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
  5. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
  6. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  7. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  8. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  9. Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
  10. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  11. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  12. Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  13. Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
  14. DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
  15. Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  16. Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
  18. Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
  19. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  20. Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
  21. Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
  22. Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
  23. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  24. Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
  25. Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
  26. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  27. Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
  28. Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
  29. Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
  30. Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
  31. Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
  32. Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  33. Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
  34. Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
  35. Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
  36. Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).

Tags

Tıp sayı 132 G reseptör protein birleştiğinde Kemokin CXC Kemokin reseptör 4 Floresan hücre tabanlı tahlil Ca2 + seferberlik agonist antagonisti ilaç keşif allosteric modülatör küçük moleküller
Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca<sup>2 +</sup> seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., … More

Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., Schols, D., Van Loy, T. A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators. J. Vis. Exp. (132), e56780, doi:10.3791/56780 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter