Summary
De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.
Abstract
G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) zijn van groot belang voor de farmaceutische industrie, omdat ze betrokken bij vele ziekten bij de mens zijn en goed gevalideerde streefniveaus voor therapeutische interventie. Ontdekking van loodverbindingen, met inbegrip van kleine synthetische moleculen, die een specifiek remmende werking van de receptor functie, is een belangrijke eerste stap in de Geneesmiddelenontwikkeling en is afhankelijk van robuuste, gevoelige en specifieke cel-gebaseerde testen. Hier beschrijven we een kinetische cellulaire assay met een fluorescerende uitlezing hoofdzakelijk ontworpen om te identificeren specifieke receptor antagonisten die een remmende werking van de intracellulaire Ca2 + release opgeroepen bij de activering van de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) door haar endogene ligand, de CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). Een belangrijk voordeel van deze methode is dat ook hierdoor screening van verbindingen begiftigd met intrinsieke agonistic eigenschappen (d.w.z., verbindingen die aanleiding kunnen geven tot een toename van de intracellulaire Ca2 + concentratie in de afwezigheid van CXCL12) of verbindingen moduleren van de receptor functie via interactie met allosteric bandplaatsen (d.w.z., positieve en negatieve allosteric modulatoren (PAMs en NAMs, respectievelijk)). Op de keerzijde, kunnen autofluorescent verbindingen interfereren met de bepaling van uitlezing, waardoor het belemmeren van betrouwbare data interpretatie. Waarschijnlijk kan deze test worden uitgevoerd, met minimale aanpassingen, als een generiek geneesmiddel ontdekking assay voor vele andere GPCRs waarvan de Activering tot een vrijval van intracellulaire Ca2 leidt +.
Introduction
GPCRs zijn een belangrijke superfamilie van cel-oppervlakte-eiwitten die signaaltransductie cascades van extracellulaire ligand bindende activeren. Zij kunnen worden geactiveerd door een grote verscheidenheid van stimuli met inbegrip van peptiden, eiwit hormonen, biogenic amines en lipiden, wat in de opening van uiteenlopende intracellulaire signaalroutes en uiteindelijk biologische reacties1,2 resulteert . Bovendien GPCRs zijn betrokken bij velen, als niet alle, ontwikkelings- en fysiologische processen en vele ziekten bij de mens worden geassocieerd met disfunctionele GPCR signalering of receptor overexpressie. GPCRs behoren daarom tot de meest gevalideerde farmacologische doelen in geneeskunde1,3.
Meestal begint een GPCR workflow voor de ontdekking van de drug met cellulaire screening tests waarmee de identificatie van stoffen zoals kleine molecules, monoklonale antilichamen en peptiden die de activiteit van een bepaalde GPCR kunnen moduleren. In GPCR drugontdekking vele verschillende soorten tests bestaan om te zoeken naar dergelijke verbindingen, zijn waarvan de meeste compatibel met midden - tot high-throughput screening campagnes. De meest gebruikte tests omvatten receptor bindende experimenten, fluorescentie- of luminescentie gebaseerd testen schommelingen in het niveau van de zogenaamde secundaire boodschappers (b.v., Ca2 +, cyclisch adenosinemonofosfaat (AMP)), fenotypische opsporen screening tests, en de aanwerving van de β-arrestin testen4. De keuze voor een bepaald soort assay kan afhangen van meerdere factoren, maar wordt ook bepaald door voorafgaande kennis omtrent de signalering eigenschappen van een bepaalde GPCR. Agonist binden aan een GPCR induceert een conformationele verandering katalyseren van de uitwisseling van guanidine (III) difosfaat (BBP) voor guanidine trifosfaat (GTP) op de α-subunit van heterotrimeric G eiwitten. Vervolgens de Gα-GTP subeenheid distantieert van de G-βγ -subunit en beide subeenheden signaalroutes verder zal starten. Hydrolyse van de GTP-molecuul en de daaropvolgende hernieuwde vereniging van de G-α- BBP en Gβγ subeenheden zal herstellen het G-eiwit in de inactieve conformatie5,6. Gebaseerd op volgorde gelijkenis van de Gα subeenheid verschillende soorten G eiwitten zijn gedefinieerd (Gs, GikGq, G12/13)7. Signalering via de G-α subeenheid geeft aanleiding tot verschillende typische reacties zoals de verhoging (via Gs) of daling (via Gik) van cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT productie en intracellulaire Ca2 + mobilisatie (via Gq)5 ,7. Gβγ subeenheden kunnen ook voor het opwekken van intracellulaire effector trajecten. Bijvoorbeeld, na activatie van Gik-gekoppelde GPCRs, Gβγ kunnen direct stimuleren phospholipase C (PLC-β) te produceren inositol trifosfaat (IP-3) die als trigger de vrijlating van Ca2 + van intracellulaire winkels7 fungeert . Na receptor activering, zijn GPCRs phosphorylated door GPCR kinases (GRKs) ter bevordering van de interactie met β-arrestins. Dit proces wordt beëindigd G eiwit signalering en leidt tot receptor desensibilisatie en uiteindelijk internalisering. Β-arrestins kunnen ook multi moleculaire complexen die kunnen leiden tot andere signaalroutes onafhankelijk van signalering van8G-proteïne vormen.
Binnen de onderfamilie van chemokine receptoren, de Gik-gekoppelde CXCR4 is een GPCR die veel belangstelling heeft opgeworpen als een veelbelovende doelwit voor drugontdekking. Gelet op haar gevestigde rol als een belangrijke co receptor voor humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) 1 werden virale ingang en infectie, verbindingen richten CXCR4 in eerste instantie ontwikkeld als anti-HIV drug kandidaten9. Meer recentelijk, een groeiend lichaam van bewijsmateriaal heeft gewezen op een belangrijke rol voor CXCR4 tumorvorming en kanker uitzaaiingen, waardoor het een goed gevalideerde therapeutisch doel in oncologie evenals10. CXCR4 wordt sterk uitgedrukt in meer dan twintig soorten menselijke kanker en overleving van de cel van de tumor van besturingselementen, proliferatie, en migratie alsmede tumor-gerelateerde angiogenese10. CXCR4 antagonisten van verschillende chemische klassen geweest eerder beschreven11,12, maar alleen het kleine molecuul dat amd3100 is momenteel goedgekeurd voor gebruik in de kliniek als een stamcel mobilisatie agent gebruikt tijdens de behandeling van het lymfoom en myeloom patiënten13,14. Klinische proeven zijn aan de gang om de veiligheid en de werkzaamheid van verschillende andere CXCR4 antagonisten in verschillende ziekten bij de mens, maar met een sterke focus op oncologie12. Gezien de vele mogelijke toepassingen voor CXCR4 antagonisten, is het zoeken naar nieuwe verbindingen met verbeterde farmacokinetische eigenschappen, verbeterde biologische beschikbaarheid of potentieel minder bijwerkingen gerechtvaardigd.
Hierin een kinetische fluorescentie gebaseerde cellulaire assay hoofdzakelijk gebruikt voor scherm voor verbindingen kunnen remmen CXCR4 wordt beschreven. De fluorescerende meting van deze methode is gebaseerd op de tijdelijke verhoging van de intracellulaire Ca2 + concentratie opgeroepen op CXCR4 activering door de endogene agonist, de chemokine ligand CXCL12 (voorheen bekend als stromale cel afgeleide factor 1α) SDF1-α)), en de potentiële inhibitie van deze CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie door bepaalde verbindingen. In deze test, worden U87 menselijke glioblastoma cellen stabiel uiting van de menselijke CXCR4 receptor gebruikt. Deze cellen missen op hetzelfde moment, endogene uitdrukking van CXCR7, een verwante chemokine receptor die ook CXCL1215,16,17 bindt. CXCR7 is eerder ook aangetoond te kunnen vormen van de heterodimers met CXCR4, waardoor het moduleren van de signalering eigenschappen van deze laatste receptor18. Schommelingen in de hoeveelheid intracellulair Ca2 + gemedieerd door CXCR4 worden gecontroleerd door het laden van de CXCR4+ cellen met fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, een cel-permeabele hoge affiniteit fluorescerende Ca2 +-bindende kleurstof. Fluo-2 AM is een één golflengte fluorescerende molecule die kan worden enthousiast op 490 nm, terwijl de fluorescentie van de emissie is gemeten op 520 nm. Deze emissie-fluorescentie verhoogt op Ca2 + binding, met een groot dynamisch bereik tussen de Ca2 +-gebonden en ongebonden staat. De toename van fluorescent signaal is van voorbijgaande aard, die zich voordoen binnen een tijdspanne van een paar minuten, en daarna zal vergaan. De piekhoogte van de verdere correlaten van fluorescerende emissie met het niveau van de receptor activering. De test zelf wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescentie microplate lezer uitgerust met een CCD geïntensiveerd (ICCD) camera die beschikt over een geïntegreerde pipetting systeem waarmee de standaardisatie van de pipetting stappen in de analyse (Zie Tabel van materialen) . Bovendien, is de gelijktijdige meting van het fluorescerende signaal in ieder putje van een microplate een ander belangrijk voordeel van de lezer van de fluorescentie die wordt gebruikt. Tijdens het eerste deel van de bepaling die de verbindingen onderzochte (bijvoorbeeld, een panel van kleine moleculen met een vaste concentratie of in een verdunningsreeks) worden toegevoegd aan de fluo-2 AM geladen CXCR4+ U87 cellen gevolgd door een ~ 10 min incubatietijd tijdens welke de mogelijke agonistic effect van de verbindingen wordt continu gemeten in real-time. Vervolgens de endogene agonist (d.w.z.CXCL12) wordt toegevoegd aan de cellen om te roepen een CXCR4-gemedieerde voorbijgaande verhoging van het niveau van intracellulaire Ca2 +. Tijdens dit deel van de bepaling kan de potentiële antagonistische activiteit van de geteste stoffen worden geëvalueerd. Een schematisch overzicht van de bepaling in de algemene workflow wordt gepresenteerd in Figuur 1.
Hoewel deze Ca2 + mobilisatie test is vooral gebruikt voor het identificeren en bepalen de remmende potentie van concurrerende CXCR4 antagonisten (d.w.z., verbindingen, waardoor de endogene agonist om te binden en stimuleren de receptor), het ook receptor agonisten kan identificeren en, bovendien, verbindingen die oefenen hun functie door inbinden op allosteric sites (dat wil zeggen, websites die topografisch van de orthosteric binding site bezet door de endogene agonist afwijken). De laatstgenoemde categorie van verbindingen en voorbeelden van allosteric agonisten PAMs en NAMs19,20. Overwegende dat specifieke receptor antagonisten evenals NAMs de CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie remmen zou, PAMs dit antwoord zou verbeteren (Zie ook bespreking sectie). Hoewel de bepaling hierin specifiek CXCR4 doelen beschreven, wordt verwacht dat deze methode kan worden toegepast op andere GPCRs met minimale optimalisatie inspanning, tenminste als ze het signaal via de vrijlating van intracellulaire Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle stappen beschreven onder de punten 1 en 2 worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire flow kabinet.
1. onderhoud van U87. CD4.hCXCR4 cellen
- Het groeien van cellen in T75 cultuur kolven op 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
Opmerking: De in vitro cellijn gebruikt in dit protocol is een U87 glioblastoma cellijn stabiel uiten cluster van differentiatie 4 (CD4) en mens CXCR4 en is eerder beschreven17. Cel oppervlakte uitdrukking van CD4 en CXCR4 wordt voortdurend gecontroleerd door stroom cytometry en expressie niveaus constant blijven na verloop van tijd (~ 100% CD4+ en ~ 100% CXCR4+ cellen). Een gedetailleerde beschrijving van de generatie van de gebruikte cellijn en de stroom cytometry procedure te onderzoeken receptor expressie niveaus valt niet binnen het toepassingsgebied van dit protocol.- Subcultuur cellen bij 80-85% confluentie. Toestaan dat alle reagentia tot kamertemperatuur (RT) vóór het kweken van de cel.
- Verwijderen van de geconditioneerde cultuurmedium van de cellen en wassen van de cel enkelgelaagde eenmaal met 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 3 mL van 0,25% trypsine-EDTA en gelijkmatig verdelen over de cel enkelgelaagde. Verwijder de overmaat van trypsine-EDTA vervolgens en incubeer tot 5 min. bij 37 ° C tot cellen beginnen om los te maken.
- Voeg 10 mL verse volledige groeimedium (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) + 10% foetale boviene Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + gewenste agenten). Resuspendeer de cellen door pipetteren zachtjes op en neer. De celsuspensie overbrengen in een steriele 50 mL-buis.
- Het aantal levensvatbare cellen met behulp van een methode van keuze. In het geval van U87 glioblastoma cellen, levensvatbaarheid in het algemeen bereikt ~ 100%.
Opmerking: Cel nummers kan op verschillende manieren worden bepaald. Regelmatig gebruiken we een systeem voor de analyse van geautomatiseerde cel is gebaseerd op trypan blauw kleuring (Zie Tabel van materialen) volgens de norm hanteren van procedures, maar andere manieren moet even goed werken. - 2 x 106 of 3 x 106 (levensvatbare) cellen toevoegen aan een eindvolume van 25 mL vers groeimedium in een maatkolf van T75 cultuur en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: Als 3 x 106 cellen gebruikt de cellen zal 80-90% confluentie bereiken na 2 dagen. Als 2 x 106 cellen worden gebruikt, zal zij de dezelfde confluentie bereiken na 3 dagen. Het groeitempo op jaarbasis van de cellen moet eerst empirisch worden bepaald als andere cellijnen worden gebruikt.
2. het zaaien van de cellen voor de Ca2 + mobilisatie Assay
- Bottom (Zie Tabel van materialen) met een 0,1% gelatine oplossing te vergemakkelijken van cel bijlage op de dag van de cel passaging (dag 0), vacht zwart-ommuurde polystyreen 96-wells-platen met clear.
Opmerking: Coating van de 96-wells-platen met gelatine kan worden weggelaten als vooraf gecoate platen, die commercieel beschikbaar is (Zie Tabel of Materials), worden gebruikt. Het is raadzaam om het gebruik van vooraf gecoate platen in plaats van de handmatige coating voor elke regel van de cel onderzochte voordat u verdergaat met het protocol te evalueren.- Bereid gelatine oplossing door 1 gram gelatine toe te voegen tot 100 mL PBS te verkrijgen van een 1%-oplossing. Verdun door 10 x met PBS voor verder gebruik. Ter verbetering van de oplosbaarheid van gelatine, Verwarm de oplossing tot 37 ° C.
- Voeg 100 µL van 0,1%-oplossing van de gelatine per putje van de 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet. Incubeer gedurende 2 uur op RT.
- In de tussentijd bereidt de cellen voor het zaaien in de gecoate 96-wells-plaat.
- Loskoppelen van de cellen uit de cultuur-kolf, resuspendeer hen in verse groeimedium, en ze tellen met behulp van trypan blauw kleuring methode.
- Spin down de cellen in een tube van 50 mL voor 5 min bij 400 x g bij RT.
- Resuspendeer de cellen in verse groeimedium (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, geen antibiotica) te verkrijgen van een celdichtheid van 0.1 x 106 (haalbaar) cellen/mL.
- Verwijder de gelatine oplossing aan de zwart-ommuurde platen met duidelijke bodem door flipping via de plaat en drogen op een weefsel. Voeg toe 200 µL per putje PBS flip-over de plaat weer te verwijderen overtollige gelatine.
- Afzien van de celsuspensie (overeenkomend met 0,2 x 105 cellen) 200 µL per putje in de gelatine beklede 96-wells-plaat (vanaf nu een deze plaat zal worden verder genoemd de "meting plaat").
- Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.
3. laden van de cellen met een fluorescerende Ca2 + -gevoelige kleurstof
- Uitvoeren op dag 1 de werkelijke Ca2 + mobilisatie assay, beginnend met het laden van de geplaatste cellen met de fluorescerende Ca2 +-bindende kleurstof fluo-2 AM.
- Assay buffer te bereiden door toevoeging van 40 mL HEPES (1 M) op 200 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS, 10 x, geen fenol rood, geen natriumbicarbonaat). Voeg ultrazuiver water voor het verkrijgen van een eindvolume van 2 L en 4 g bovien serumalbumine (BSA) toevoegen. Los van de BSA via magnetische roeren. Breng de pH op 7.4 (met NaOH) en filtreer de oplossing.
Opmerking: Tijdens alle volgende stappen de dezelfde buffer, hierna aangeduid als "assay buffer", wordt gebruikt. - Bereiden van een stamoplossing (4 mM in dimethylsulfoxide (DMSO)) van de fluorescerende Ca2 +-gevoelige kleurstof fluo-2 AM. Vermijd overmatige blootstelling aan licht. Los 1 mg fluo-2 AM (moleculair gewicht: 1,061 g/mol) in 235.6 µL DMSO.
- Bereid een werkende oplossing van fluo-2 AM. Voor een bepaling van de 96-wells-plaat Meng 12,5 µL van fluo-2 AM stockoplossing (4 mM) en 12,5 µL nonionic oppervlakteactieve stof polyol (bijvoorbeeld, pluronic f-127) oplossing (20% gewicht/volume in DMSO, Zie Tabel van materialen). 22 µL van dit mengsel aan 11 mL assay buffer in een tube van 15 mL toevoegen. De uiteindelijke concentratie van fluo-2 AM is 4 µM.
Opmerking: De nonionic oppervlakteactieve stof wordt gebruikt als een agent van de spreiding te verbeteren van de oplosbaarheid in water van fluo-2 AM en gevolg, ter verbetering van de cel laden. Als u wilt solubilize oppervlakteactieve stof in DMSO, verwarm het monster bij 37 ° C en meng regelmatig te verkrijgen van een homogene oplossing. - Verwijder het groeimedium uit de eerder geplaatste cellen in de meting van de 96-wells-plaat door flipping via de plaat en drogen op een keukenrol.
- Voeg 100 µL van het laden kleurstof oplossing per putje met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 45 min. op RT in het donker.
- Assay buffer te bereiden door toevoeging van 40 mL HEPES (1 M) op 200 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS, 10 x, geen fenol rood, geen natriumbicarbonaat). Voeg ultrazuiver water voor het verkrijgen van een eindvolume van 2 L en 4 g bovien serumalbumine (BSA) toevoegen. Los van de BSA via magnetische roeren. Breng de pH op 7.4 (met NaOH) en filtreer de oplossing.
4. voorbereiding van polypropyleen 96-wells-platen bevattende de Chemokine Ligand-CXCL12 of de verbindingen onderzochte
- Ronde bodem polypropyleen (PP) 96-wells-platen (Zie Tabel van materialen) te verkrijgen.
- Toestaan dat de stockoplossing van CXCL12 (1 mg/mL) en de stockoplossing van de verbindingen onderzochte aan equilibreer op RT.
Opmerking: De stockoplossing van CXCL12 wordt bereid in ultrazuiver water aangevuld met 0,01% Tween20 en als eenmalig gebruik aliquots bij-20 ° C is opgeslagen. - Bereiden van een 5 x geconcentreerde oplossing van CXCL12 in assay buffer (250 ng/mL die gelijk is aan 31,25 nM) en een 5 x geconcentreerd verdunning van elke verbinding (in assay buffer).
- Afzien van de voorraadoplossingen in de passende 96-wells-plaat volgens een vooraf gedefinieerde plaat lay-out. Afzien van 75 µL per putje in de plaat met CXCL12 (de "chemokine plate"), afzien van 50 µL per putje in de plaat met de verbindingen (de "samengestelde plaat").
Opmerking: Beide verbindingen en CXCL12 zal uiteindelijk worden verdund 5 x op de verstrekking in de meting plaat. Het is ook belangrijk op te nemen van negatieve controleputjes met alleen assay buffer in zowel de samengestelde plaat evenals de chemokine plaat. Ook positieve controleputjes moeten worden opgenomen (dat wil zeggen, met CXCL12 in de chemokine plaat, maar met assay buffer in de overeenkomstige putjes van de samengestelde plaat wells).
- Toestaan dat de stockoplossing van CXCL12 (1 mg/mL) en de stockoplossing van de verbindingen onderzochte aan equilibreer op RT.
5. protocolinstellingen op de fluorescentie Microplate lezer
Opmerking: De fluorescentie microplate lezer gebruikt in dit protocol wordt aangeduid in de Tabel van materialen.
- Zet eerst de koeler unit van de fluorescentie-afleesapparaat, en schakel over op de fluorescentie-lezer zelf. Laat voor een paar minuten starten en openen van de systeemsoftware.
- Maken van de test-protocol met behulp van de drag-and-drop-menu dat bestaat uit de volgende stappen:
- Selecteer in het vak "Instellingen", 'Read_Mode' met excitatie golflengte: 470-495 nM; emissie golflengte: 515-575 nM.
Opmerking: De geselecteerde golflengten zijn geschikt voor gebruik met de Ca2 +-gevoelige kleurstof fluo2. - Het vak "Mix met TF" (overdracht vloeistof) automatische menging van de verbindingen in de samengestelde plaat, die zullen worden gebracht op de bron 2-positie van het apparaat omvatten (zie stap 6.4). Selecteer 15 µL van oplossing in elk putje te worden automatisch aanzuiging gemengd driemaal. De hoogte van de uiteinden van de pipet op 20 µL onder het vloeistofoppervlak aangepast. Stel de snelheid van aspiratie en verstrekking op 50 µL/s.
Opmerking: De hoogte van de pipet tips verwijst naar het volume dat is links onder de uiteinden van de pipet. Bijvoorbeeld, als de putjes van de plaat in een samengestelde 50 µL bevat, een hoogte van 30 µL komt overeen met 20 µL onder het vloeistofoppervlak. Het volume van samengestelde oplossing genomen te mengen, de snelheid van het mixen, de positie van de pipet tips tijdens het mengen, en het aantal cycli mengen kan alles worden aangepast met behulp van de software. - Definieer in het vak "Fluid Transfer" dat 20 µL van elk goed van de samengestelde plaat zal worden overgebracht in de meting plaat. Plaats de pipet tips op 20 µL oppervlak dat wil zeggen, op hoogte 30 µL tijdens aspiratie van de verbindingen en hoogte 60 µL tijdens de verstrekking in de meting plaat onder de vloeistof. Stel de snelheid van aspiratie bij 50 µL/s en de snelheid van de verstrekking van 25 µL/s.
Opmerking: De samengestelde plaat bevat 50 µL per putje oplossing (zie stap 4.1.3), dus een hoogte van 30 µL correspondeert met een positie 20 µL onder het vloeistofoppervlak. De meting plaat bevat 80 µL van assay buffer per putje (zie stap 6.3), dus een hoogte van 60 µL correspondeert met een vergelijkbare positie van de tips. - Selecteer de knop "Read met TF". Selecteer tijdens het eerste interval, 60 leest (fluorescerende metingen) met een lees intervaltijd van 1 s. definiëren die 10 leest worden opgenomen vóór de verstrekking van de verbindingen in de meting plaat, en 50 leest daarna. Definiëren van het tweede interval met een lees intervaltijd van 30 s en 18 leest.
Opmerking: Tijdens deze stap fluorescentie zal worden gemeten kinetisch (met tussenpozen de gedefinieerde tijd) voor ~ 10 min in totaal. - Drie keer de "Wash Tips" knop in het protocol opnemen. Binnen elke wassen stap, selecteer het vloeibaar type: vloeistof een (ultrazuiver water) of vloeistof B (70% ethanol), het aantal wassen cycli (1), de pomp snelheid (snel), en het aantal slagen (5) tijdens elk wassen stap.
Opmerking: Tijdens de eerste en laatste wassen stap vloeistof A wordt gebruikt, tijdens de tweede wassen stap vloeistof die b wordt gebruikt. - De functie "Pauze pipet" opnemen. Instellen van de pipet om te pauzeren voor 300 s.
Opmerking: Door deze stap in het protocol, het hoofd van de pipet, die is geïntegreerd in de fluorescentie plaat lezersapparaat, zal pauzeren gedurende 5 minuten voordat u doorgaat het protocol. - Het vak "Mix met TF" zodat automatische mengen van de oplossing van de CXCL12 in de chemokine plaat, die zal worden geplaatst op de bron 3-positie van het apparaat omvatten (zie stap 6.4). Selecteer 15 µL van oplossing in elk putje te worden automatisch aanzuiging gemengd driemaal. Plaats de pipet tips 20 µL onder het vloeistofoppervlak tijdens aspiratie en mengen. De snelheid van aspiratie en verstrekking is vastgesteld op 50 µL/s.
Opmerking: Net wat stap 5.2.2, deze parameters kunnen worden aangepast. - In het volgende vak "Fluid Transfer" definiëren dat 25 µL van elk goed voor de chemokine plaat zal worden overgebracht in de meting plaat. Positie 20 µL tips hieronder de vloeistof oppervlak dat wil zeggen, op hoogte 55 µL tijdens aspiratie van de chemokine plaat waarin 75 µL per putje (zie stap 4.1.3), en op hoogte 80 µL tijdens de verstrekking in de meting plaat. Stel de snelheid van aspiratie bij 50 µL/s en de snelheid van de verstrekking van 25 µL/s.
- Voeg de "Lezen met TF" button. Selecteer tijdens het eerste interval, 145 leest met een lees intervaltijd van 1 s. definiëren die 5 leest worden opgenomen vóór de verstrekking van CXCL12 in de meting plaat, en 140 leest daarna. Definiëren van het tweede interval met een lees intervaltijd van 6 s en selecteer 20 leest.
Opmerking: Tezamen, gedurende het gehele protocol 243 leest (fluorescerende metingen) worden geregistreerd: 78 bij stap 5.2.4 en 165 tijdens stap 5.2.9. - Vergelijkbaar met de stap van 5.2.5, zijn voorzien van de knop "Wassen tips" driemaal in het protocol.
Opmerking: Met inbegrip van deze stap aan het eind van het protocol maakt het mogelijk dat de tips opnieuw kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van een andere bepaling zonder te wijzigen de tips.
- Selecteer in het vak "Instellingen", 'Read_Mode' met excitatie golflengte: 470-495 nM; emissie golflengte: 515-575 nM.
- De temperatuur van het apparaat bij 37 ° C instellen door op de "Set fase temperatuur" knop te klikken en te selecteren van de 37 ° C.
6. het uitvoeren van de bepaling van de fluorescentie
- Na de meting heeft de plaat geïncubeerd met het laden van de buffer voor 45 min (zie stap 3.1.5), verwijderen van de buffer door flipping via de plaat en het droog op een weefsel.
- Wassen van de geplaatste cellen door toevoeging van 150 µL per putje van assay buffer en incubeer gedurende 2 min.
- Verwijder de buffer weer door flipping via de plaat. Voeg 80 µL per putje van assay buffer met een meerkanaalspipet.
- Alle platen in het apparaat op hun juiste positie gebracht: de samengestelde plaat op de bron 2 positie, de chemokine plaat op de bron 3-positie, en de plaat van de meting op de Lees positie. Zetten een doos van zwarte tips bij de bron 1 tips positie. Deur van het apparaat en incubeer gedurende 5 min voordat u doorgaat het protocol.
- Selecteer de knop "Protocol signaal test" om de achtergrond relatief licht eenheden (RLUs) en fluorescentie variantie over de plaat. Een nieuw venster zal verschijnen. Selecteer "Test signaal".
Opmerking: Tijdens deze stap achtergrond RLUs worden bepaald door de ICCD camera, die is geïntegreerd in het compartiment van de optica van de fluorescentie lezersapparaat. Deze RLUs het gevolg zijn van de excitatie van de Ca2 +-gevoelige kleurstof (fluo-2) door lichtemitterende diodes (LEDs) (LED uitgang golflengte 470-495 nm). Waarden van 8.000-10.000 RLUs zijn geschikt voor deze toepassing. RLUs kan, indien nodig, worden aangepast door de excitatie-intensiteit (Selecteer excl. intensiteit), of de camera poort (Selecteer poort Open) te wijzigen. De afwijking over de plaat moet idealiter minder dan 7,5%. - Kies "Update" als achtergrondwaarden van 8.000-10.000 RLUs worden verkregen. Het belangrijkste protocol opslaan door op Opslaan te klikken.
Opmerking: Door dit te doen, de instellingen van de protocol signaal test zal worden overgedragen naar het belangrijkste protocol. - Uitvoeren van de bepaling door de "RUN"-knop te drukken.
7. de gegevensanalyse en kwaliteit
- Nadat de test is voltooid, opent u het "Analyse" in software van het systeem.
- Ga naar "correcties configureren" en kies "reactie over base line". Define base line 1 om te starten bij meting 1 en eind meting 5; de gemiddelde fluorescentie worden berekend in elk putje tussen meting 1 en 5.
Opmerking: Alle verdere metingen uit een bijzonder goed zijn gedeeld door deze goed-specifieke basislijn 1.- Define base line 2 om te beginnen bij meting 78 tot meting 83 (CXCL12 wordt aangeboden na meting 83; opnieuw de gemiddelde fluorescentie is berekend in elk goed tussen meting 78 en 83 en deze correctiefactor wordt toegepast op alle metingen na meting 83).
- Activeren van de aankruisen "weergeven als percentage" en "aftrekken achtergrond".
- Ga naar "Configure kinetische vermindering". Kies om te beoordelen het remmende effect van verbindingen op de CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie, Max-Min vanaf meting 84 (dat wil zeggen, de eerste meting na die CXCL12 wordt aangeboden) tot 243 (dat wil zeggen, de laatste meting).
Opmerking: Door te kiezen voor Max-Min het verschil tussen de minimale en maximale respons over basislijn tussen meten 84 en meting 243 wordt gemeld. Als de Max-Min is gekozen starten tussen 11 meting en meting 78, wordt het verschil tussen de minimale en maximale respons over basislijn ten opzichte van de basislijn 1 gemeld. Deze waarde kan worden gebruikt voor het analyseren van de potentiële agonistic activiteit van de verbindingen, Zie discussie). - De gegevens zullen worden gevisualiseerd in de software van het systeem. Indien nodig, de ruwe gegevens exporteren voor aanvullende analyse en visualisatie in andere gemeenschappelijke analyse softwarepakketten.
- Ga naar "correcties configureren" en kies "reactie over base line". Define base line 1 om te starten bij meting 1 en eind meting 5; de gemiddelde fluorescentie worden berekend in elk putje tussen meting 1 en 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het effect van CXCL12 stimulatie op de intracellulaire Ca2 + mobilisatie in U87. CD4.CXCR4+ en U87. CD4-cellen werd geëvalueerd met de Ca2 + mobilisatie test. In plaats van 20 µL van teststof die normaal zou worden toegevoegd tijdens de eerste pipetting stap van het protocol (Figuur 1), assay buffer is toegevoegd aan de fluo-2 AM geladen U87. CD4.CXCR4+ cellen in de meting plaat. Tijdens de tweede stap van de verstrekking, verschillende concentraties van CXCL12 (0.2-102,4 nM, eindconcentratie) werden afgeleverd in de meting plaat. Een dosis-afhankelijke verhoging van fluorescentie, correleren met een verhoging van de dosis-afhankelijke van de release van Ca2 +, is aangetoond (figuur 2A). Hier, de negatieve controlemonster vertegenwoordigt die putjes waarin op beide toevoegingen alleen assay buffer is toegevoegd aan de meting plaat (d.w.z., 0 nM CXCL12), resulterend in het uitblijven van een antwoord (figuur 2A). Stijgende hoeveelheden CXCL12 veroorzaken verhoogde niveaus van fluorescentie die verval na verloop van tijd (figuur 2A). Deze gegevens een dosis-responscurve was gegenereerd op basis van het "Max-Min reactie over basislijn" tussen meten 84 (dat wil zeggen, de eerste meting na toevoeging van de CXCL12) en meting 243 (dwz., de laatste meting in het protocol ). Met behulp van niet-lineaire regressie, de EC-50 -waarde (dat wil zeggen, de concentratie die nodig zijn voor de helft van de maximale reactie oproepen) was vastbesloten en komt overeen met 1.14 nM (figuur 2B). Geen fluorescerende Ca2 +-gerelateerde reactie was opgeroepen door CXCL12, zelfs in hoge concentraties (102,4 nM), als U87. CD4-cellen ontbreken van functionele CXCR4 expressie werden gebruikt. Dit toont aan de receptor-specificiteit van de meting opgeroepen door CXCL12 (figuur 2C).
Een sleutel application voor deze cel-gebaseerde test is de identificatie van kleine molecules die specifiek gericht zijn op CXCR4 en geschikt voor de remming van de CXCL12-geïnduceerde Ca2 + mobilisatie. Als er actieve verbindingen ("hits") worden vermeld, kunnen ze verder worden gekenmerkt door seriële verdunningen van de samengestelde testen en analyseren van de remmende potentie in meer detail. Als voorbeeld, wordt het effect van de bicyclam AMD3100, een gevestigde kleine molecuul CXCR4-specifieke receptor antagonist met krachtige anti-HIV-1 activiteit21,22, geïllustreerd in Figuur 3. Een reeks van de concentratie van AMD3100 (n = 4, 3 µM tot 1.37 nM eindconcentratie in een verdunningsreeks van 1/3) op U87 werd afgeleverd. CD4.CXCR4+ cellen tijdens de eerste stap van het protocol. De compound mocht vervolgens met de cellen voor Incubeer ~ 10 min gedurende welke het signaal van de fluorescentie voortdurend werd opgenomen. Dan 6,4 nM van CXCL12 (50 ng/mL, eindconcentratie) werd toegevoegd aan alle putjes van de plaat van de cel gelijktijdig voor het opwekken van de CXCR4-gemedieerde Ca2 + mobilisatie. Dosis-afhankelijke remming van deze reactie door de verschillende verdunningen van het AMD3100 wordt weergegeven in figuur 3A. In dit geval wordt alleen het gedeelte van de grafiek na toevoeging van de CXCL12 weergegeven. Aangezien een negatieve controle (blauwe lijn) enige buffer werd toegepast in de assay (geen pre-incubatie met AMD3100, geen CXCL12 toegevoegd aan de putjes), resulterend in de verwachte gebrek aan respons. De positieve controle (rode lijn) komt overeen met de monsters in welke 6.4 nM CXCL12 toevoegde aan wells zonder voorafgaande incubatie van AMD3100 (figuur 3A). Op basis van deze definitie negatieve en positieve controles de Z' waarde in deze test is meestal tussen 0,5 en 1. Om te bepalen van de remmende potentie van AMD3100 een dosis-responscurve werd gegenereerd door niet-lineaire regressie, resulterend in een berekende IC50 waarde van 770.8 nM (figuur 3B). Ter verdere illustratie van het gedrag van een niet-actieve verbinding, werd maraviroc opgenomen in dit experiment. Maraviroc is een klein molecuul specifiek remming van de CC chemokine receptor 5 (CCR5) waardoor het blokkeren (CCR5)-tropic HIV-1 infectie23 . Zelfs in hoge concentraties (eindconcentratie is 10 µM) werd geen enkel remmende effect van dit samengestelde waargenomen op de CXCR4-gemedieerde Ca2 + reactie (figuur 3A).
Tot slot, om aan te tonen dat deze Ca2 + mobilisatie test kan ook worden toegepast om te bestuderen van andere GPCRs, een seriële verdunning van de CC chemokine ligand 5 (CCL5), de endogene ligand voor CCR5, toevoegde aan cellen uiten CCR5 (U87. CD4.CCR5+) met behulp van precies dezelfde proefomstandigheden en hardware-instellingen. Een dosis-afhankelijke fluorescerende Ca2 + reactie blijkt na toevoeging van een seriële verdunning CCL5 (Figuur 3 c). Bovendien, en in tegenstelling tot het effect op de CXCR4, pre-incubatie met 100 nM (eindconcentratie) van maraviroc sterk geremd deze reactie (figuur 3D).
Figuur 1: Schematisch overzicht van de bepaling van workflow. Op 0 dagcellen uitspreken van de GPCR van belang (in dit geval CXCR4) worden overgeënt in 96-wells-platen zwart-ommuurde met duidelijke bodem en 's nachts worden gekweekt bij 37 ° C en 5% CO2. Op dag 1 wordt de fluorescentie gebaseerde Ca2 + bepaling uitgevoerd. Cellen zijn voor het eerst geladen met een fluorescerende Ca2 +-gevoelige kleurstof (fluo-2 AM) en 45 min op RT in het donker ge¨ uncubeerd. Een "chemokine plaat" en "samengestelde plaat" zijn bereid (PP = polypropyleen). Na incubatie met laden kleurstof, zijn geplaatste cellen keer gewassen met assay buffer (150 µL per putje) waarna 80 µL per putje van assay buffer wordt toegevoegd. Alle platen worden vervolgens gedurende 5 min. in het apparaat bij 37 ° C geïncubeerd voordat de bepaling. Vervolgens verbindingen van belang (b.v., kleine moleculen) worden afgeleverd op de gewenste concentratie in de putjes van de plaat van de meting en toegestaan om te broeden voor ~ 10 min terwijl fluorescentie wordt continu gemeten. Vervolgens een vaste concentratie van de endogene agonist van de GPCR (hier CXCL12) wordt toegevoegd aan de oproepen van Ca2 + release en fluorescentie is verder opgenomen na verloop van tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Agonist activiteit van CXCL12 op CXCR4+ cellen en de specificiteit van de gedetecteerde reactie. (A) het effect van de dosis-afhankelijk van de CXCL12 op de Ca2 + mobilisatie in U87. CD4.CXCR4+ cellen. (B) op basis van de reactie van de Max-Min over basislijn tussen meten 84 en 243 een dosis-responscurve is gegenereerd en de berekende waarde van de EG-50 (n = 4, betekenen ± SD). (C) geen antwoord was geïnduceerd door CXCL12 wanneer het was afgeleverd op U87. CD4-cellen CXCR4 ontbreekt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Illustratie van het effect van een CXCR4 antagonist (AMD3100) en een niet-actieve stof (maraviroc) op CXCR4+ cellen en activering van CCR5 door de endogene agonist, CCL5. (A) dosisafhankelijk remmende effect van AMD3100 op de Ca2 + mobilisatie opgeroepen door het toevoegen van 6.4 nM CXCL12 tot U87. CD4.CXCR4+ cellen. De Maraviroc (op 10 µM eindconcentratie) toonden geen remmende effect op de CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie. (B) op basis van de reactie van de Max-Min over basislijn tussen meting 84 en 243, een remmende dosis-responscurve is gegenereerd en de IC50 waarde werd berekend op 770.8 nM (n = 4, betekenen ± SD). (C) dosisafhankelijk activering van CCR5 door de endogene agonist, CCL5. (D) remming van de CCR5-gemedieerde Ca2 + reactie van pre-incubatie van de cellen met 100 nM maraviroc. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Ca2 +-mobilisatie assay hierin beschreven eerder blijkt te zijn een waardevol instrument te identificeren en te karakteriseren receptorantagonisten targeting CXCR417. Verwacht wordt, echter dat deze methode worden meer in het algemeen op een grote groep van andere GPCRs die leiden een cytosolische Ca2 + release op hun activering, toegepast kan tot zoals geïllustreerd voor de verwante chemokine receptor CCR5. Overwegende dat bij CCR5 precies dezelfde experimentele omstandigheden worden toegepast, zal verschillende stappen in het protocol (bijvoorbeeldcel nummer op beplating, laden van de cellen met een fluorescente kleurstof) moeten opnieuw geoptimaliseerde vóór de overbrenging van de bepaling te andere GPCRs om het verkrijgen van een gunstige signal-to-noise verhouding. Een belangrijk punt hier is ook de selectie van een geschikte in vitro cellulaire host waardoor op hoog niveau uitdrukking van de GPCR van belang en functionele koppeling aan de Ca2 + traject. In het geval van CXCR4, menselijke glioblastoma U87 cellen werden gekozen omwille van: (1) het ontbreken van endogene uitdrukking van CXCR7 (een verwante chemokine receptor die de dezelfde agonist als CXCR4 in beslag neemt), (2) hun vermogen te koppelen CXCR4 activering naar de Ca2 +-signalering traject, (3) het gunstige dynamisch bereik van de fluorescerende reactie na het laden van de cellen met de Ca2 verkregen +-gevoelige kleurstof, en (4) hun uitstekende naleving van de bepaling platen minimaliseren cel verstoring tijdens de gehele procedure. Al deze parameters mogelijk moet experimenteel worden bepaald voor elke roman GPCR van belang en elke cellulaire expressie systeem.
Bij het opzetten van een soortgelijke test voor een ander GPCR, kunnen verschillende alternatieve stappen of reagentia in het protocol worden beschouwd. Bijvoorbeeld, andere Ca2 +-gevoelige fluorophores (b.v., fluo-4, fluo-3) kan worden gebruikt als alternatief voor de fluorophore (fluo-2) in dit protocol gebruikt. In geval van losjes daaraan vastzittende cellen, wassen van de cellen kunnen achterwege blijven, door de invoering van neen-wash kleurstoffen om te minimaliseren van cel loskomen van24. Bovendien, zou met uitzondering van het wassen stap uit het protocol verder verhogen van de bepaling doorvoer. Hoewel deze bepaling kan ook worden uitgevoerd met cellen weergegeven: endogene uitdrukking van CXCR4, bijvoorbeeld met inbegrip van verschillende soorten menselijke kanker cel lijnen10,25, moet hierbij worden opgemerkt dat met stabiel transfected cel hoge GPCR lijnen expressie-niveaus die stabiel na verloop van tijd blijven kunnen worden verkregen. Dit zal resulteren in meer uitgesproken assay metingen, een groter venster voor betrouwbare data interpretatie, en consistente assay prestaties over langere perioden. Wanneer cuvetten endogeen zullen CXCR4 uiten het veel moeilijker om dit resultaat te bereiken.
Een groot nadeel van de bepaling is dat het zich op een fluorescentie-meting baseert. Vandaar, autofluorescent verbindingen kunnen interfereren met de bepaling van de meting, dat hen van analyse als gevolg van onbetrouwbare data interpretatie uitsluit. Ook wordt deze Ca2 + mobilisatie test idealiter uitgevoerd met behulp van een mobiele screening systeem uitgerust met een geïntegreerde pipetting systeem waarmee gestandaardiseerde mengen en dispension van verbindingen en receptor agonist in de plaat van de meting in alle gelijktijdig Wells. De bepaling kan echter worden aangepast voor gebruik met andere, minder dure fluorescentie microplate lezers met kinetische meting mogelijkheden. De toevoeging van verbindingen en agonist zou dan moeten worden uitgevoerd handmatig met behulp van meerkanaals pipetten, die praktische-op-tijd zal toenemen en verlaagt de assay van doorvoer. Bovendien, het verkrijgen van een vergelijkbaar aantal fluorescentie metingen binnen een bepaald tijdsinterval van een kinetische test zou moeilijk te bereiken als veel microplate lezers signalen goed-door-well meten overwegende dat high-end screening systemen alle putjes meten tegelijkertijd.
Receptorantagonisten voorkomen van binding aan de receptor en de daaropvolgende activering door de endogene agonist (CXCL12) momenteel vormen de belangrijkste categorie van verbindingen die specifiek gericht zijn op CXCR411,12. AMD3100, het kleine molecuul dat werd gebruikt ter illustratie van de prestaties van de Ca2 + mobilisatie assay, is een van de meest prominente voorbeelden van CXCR4 antagonisten26. Naast receptorantagonisten verhogen moleculen die regelen GPCR signalering anders algemeen belang zo goed. Deze moleculen zijn inverse agonisten, evenals GPCR PAMs en NAMs19,20,27. Een interessant aspect van de bepaling in dit manuscript beschreven is dat het niet alleen receptorantagonisten, maar ook agonisten en allosteric modulatoren identificeren kan. Enkele kleine aanpassingen aan de bepaling en de beperkingen moeten echter rekening worden gehouden.
PAMs en NAMs bindt aan de receptor sites topografisch onderscheiden van de orthosteric binding site bezet door de receptor van endogene ligand. Overwegende dat PAMs de sterkte en/of de werkzaamheid van de receptor van endogene ligand(s) verbeteren, remmen NAMs de potentie en/of de werkzaamheid van de endogene ligand(s)19,20. PAMs hebt geen intrinsieke agonist-activiteiten. Ze zijn alleen actief in aanwezigheid van de endogene agonist, in tegenstelling tot zogenaamde allosteric agonisten. Omdat allosteric GPCR modulatoren minder bijwerkingen dan de klassieke receptorantagonisten roepen zou wanneer toegepast in klinische instellingen28,29, zijn ze waardevolle farmacologische hulpmiddelen. In onze assay, allosteric agonisten zou roepen een voorbijgaande verhoging van het signaal van de fluorescentie onmiddellijk na toevoeging aan de CXCR4+ cellen. Receptor specificiteit van dit signaal moet vervolgens worden bepaald door het testen van de dezelfde compound met de dezelfde test, maar op cellen CXCR4 ontbreekt. Wanneer specifiek screening voor PAMs, moet een lagere concentratie van endogene agonist in de bepaling worden gebruikt voor het opwekken van een fluorescerende Ca2 + reactie. Hoewel deze lagere hoeveelheid agonist een kleinere fluorescent signaal genereert zal, laat een groter venster voor het detecteren van extra receptor stimulatie. Meestal wordt een concentratie van de agonist overeenstemt met de EG10- EG30 waarde van receptor stimulatie30,31gekozen. Toevoeging van een PAM tijdens het eerste deel van de test niet zou leiden tot een verhoogde fluorescerende meting. Echter zou de fluorescerende Ca2 + signaal na verdere stimulatie van de receptoren met de endogene agonist toenemen. Ook een NAM verandert niets aan de fluorescerende meting vóór toevoeging van de agonist, maar van de receptor reactie remmen na toevoeging van de agonist. Vandaar, het profiel van de activiteit van een receptor antagonist en een NAM zal lijken. Beiden zal resulteren in de remming van het fluorescerende antwoord na toevoeging van de agonist. Daarom zijn verdere experimentele studies nodig om te discrimineren tussen een antagonist en een NAM. Hier, receptor bindende studies waarbij labelloze verbindingen met een vaste hoeveelheid concurreren label CXCL12 voor inbinden op CXCR417,32 kan een waardevolle strategie te discrimineren tussen een antagonist, die zou voorkomen dat de Label agonist van binding aan de receptor en een NAM dat niet zoals het niet dezelfde receptor bindende site delen zou.
Ligand onafhankelijke (of basale of constitutieve) activiteit van GPCRs heeft waargenomen voor talrijke GPCRs33 , hoewel het niveau van de basale activiteit over het algemeen vrij laag is wanneer GPCRs recombinantly worden uitgedrukt27. Basale GPCR activiteit kan worden verbeterd door natuurlijk voorkomende mutaties33 en een punt mutatie leidt tot verhoogde basale CXCR4 activiteit geweest beschreven eerdere34. Door het koppelen van deze constitutively actieve CXCR4 mutant aan het feromoon reactie traject in gist en [35S] GTPγS bindende experimenten, werd aangetoond dat T140, een peptide gebaseerde CXCR4 antagonist met krachtige anti-HIV activiteit17,35 aanzienlijk daalde deze basale activiteit en aldus te gedragen als een omgekeerde agonist34werd uitgezonden. In een Fura-2 fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie assay waargenomen dezelfde auteurs van de nota, een kleine voorbijgaande daling van Ca2 +-verwante fluorescentie na toevoeging van T140 naar cellen uiten van mutant CXCR4, hetgeen wijst op een daling van basale receptor activiteit34. Echter toen vanaf T140 analyseren een extra paneel van cyclische pentapeptide gebaseerde CXCR4 inverse agonisten ontworpen, detectie van verminderde basale activiteiten met een Ca2 + mobilisatie test minder eenvoudig36. Wanneer het effect van T140 op cellen uitspreken wild type CXCR4 werd geanalyseerd met behulp van de Ca2 + mobilisatie test zoals beschreven in dit manuscript, was geen verandering in basale fluorescentie signaal17geconstateerd. Bovendien, fluorescentie schommelingen zijn snel en voorbijgaande en stijgingen van de basale Ca2 + , bijvoorbeeld, niet worden nageleefd in cellen uiten constitutively actieve Gαq-receptoren4gekoppeld. Samen genomen, zou het effect van inverse agonisten zeer moeilijk, zo niet onmogelijk om te identificeren en te evalueren op een betrouwbare manier met onze test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Eric Fonteyn en Geert Schoofs voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de KU Leuven (verlenen neen. PF/10/018), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, neen verlenen. G.485.08), en de Fondation chalets Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).
