Summary
Beskrivna cellulära analysen är utformad för identifiering av CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerande agenter som hämmar eller stimulera, antingen konkurrenskraftigt eller allosterically, intracellulära Ca2 + frisättning initierats av CXCR4 aktivering.
Abstract
G-proteinkopplade receptorer (varandra) är av stor betydelse för läkemedelsindustrin som de är involverade i många sjukdomar och inkluderar väl validerad mål för terapeutisk intervention. Upptäckten av blyföreningar, inklusive små syntetiska molekyler, som specifikt hämmar receptorns funktion, är ett viktigt inledande steg i läkemedelsutveckling och förlitar sig på känsliga, specifika och robust cellbaserade analyser. Här, vi beskriver en kinetic cellulära analysen med en fluorescerande avläsning som primärt syftar till att identifiera receptor-specifika antagonister som hämmar den intracellulära Ca2 + release frammanade vid aktivering av CXC chemokine receptorn 4 (CXCR4) genom dess endogena liganden, CXC chemokine liganden 12 (CXCL12). En viktig fördel med denna metod är att den också kan screening av föreningar som begåvats med inneboende agonistiska egenskaper (dvs., föreningar framkalla en ökning av intracellulära Ca2 + koncentrationen i avsaknad av CXCL12) eller föreningar modulerande receptorns funktion via interaktion med Alloster bindningsställen (dvs, positiva och negativa Allosteriska modulatorer (PAMs och NAMs, respektive)). På den negativa sidan, kan autofluorescent föreningar störa analysens avläsning, vilket försvårar tolkning av tillförlitliga data. Mest sannolikt kan denna analys genomföras, med minimal anpassning, som en generiska läkemedel upptäckt analys för många andra varandra varav aktiveringen leder till en frisättning av intracellulära Ca2 +.
Introduction
Varandra är en viktig superfamilj av cell ytproteiner som aktiverar signaltransduktion cascades vid extracellulära ligand bindning. De kan aktiveras av en stor mängd stimuli inklusive peptider, proteinhormoner, Biogeniska aminer och lipider, vilket resulterar i inledandet av olika intracellulära signalvägar och så småningom biologiska svar1,2 . Dessutom varandra är inblandade i många, om inte alla, utvecklingsmässiga och fysiologiska processer och många sjukdomar är associerade med dysfunktionella GPCR signalering eller receptor överuttryck. Varandra är därför bland de mest validerade farmakologiska mål i medicin1,3.
Vanligtvis startar en GPCR drug discovery arbetsflödet med cellulära screening-analyser som möjliggör identifiering av föreningar såsom små molekyler, monoklonala antikroppar och peptider som kan modulera aktiviteten av en viss GPCR. Av GPCR läkemedelsutveckling finns många olika typer av analyser för att söka efter sådana föreningar, är varav de flesta kompatibla med mitten av - till high-throughput screening kampanjer. De mest använda analyserna omfatta receptor bindande experiment, fluorescens eller luminiscens baserat analyser att upptäcka variationer i nivån av så kallade sekundära budbärare (t.ex., Ca2 +, cykliskt adenosinmonofosfat (AMP)), fenotypiska screening-analyser och β-arrestin rekrytering analyser4. Valet för en viss typ av analys kan bero på flera faktorer, men bestäms även förkunskaper om signalering egenskaperna hos en given GPCR. Agonist bindning till en GPCR inducerar en conformationaländring som katalysera utbyte av guanidin diphosphate (BNP) för guanidin adenosintrifosfat (GTP) på den α-subenheten av heterotrimeric G proteiner. Därefter den Gα-GTP subuniten dissocierar från den Gβγ -subenheten och båda subunits kommer att initiera ytterligare signalvägar. Hydrolys av GTP-molekyl och efterföljande re sammanslutning av de Gα- BNP och Gβγ subenheter kommer att återställa den G-proteinet i dess inaktiva konformation5,6. Baserat på sekvens likheten mellan den Gα -subenheten definieras olika typer av G proteiner (GsGjagGq, G12/13)7. Signalering via den Gα subenhet ger upphov till flera typiska reaktioner såsom ökningen (via Gs) eller minskning (via Gjag) av cykliskt AMP produktion och intracellulära Ca2 + mobilisering (via Gq)5 ,7. Gβγ subenheter kan också inducera intracellulära effektor vägar. Exempelvis vid aktivering av Gjag-kopplat varandra, Gβγ kan direkt stimulera fosfolipas C (PLC-β) för att producera inositol trifosfat (IP-3) som utlöser frisättning av Ca2 + från intracellulära butiker7 . Efter aktivering av receptorn är varandra fosforyleras av GPCR kinaser (GRKs) som främjar interaktion med β-arrestins. Denna process avslutas G protein signalering och leder till receptorn desensibilisering och så småningom internalisering. Β-arrestins är också kan bilda flera molekylära komplex som kan utlösa andra signalvägar som är oberoende av G protein signalering8.
Inom underfamiljen av chemokine receptorer, den Gjag-kopplat CXCR4 är en GPCR som har väckt mycket intresse som lovande mål för läkemedelsutveckling. Tanke på dess etablerade roll som en större Co-receptorn för humant immunbristvirus 1 (HIV-1) utvecklades viral inträde och infektion, föreningar inriktning CXCR4 initialt som anti-HIV läkemedel kandidater9. Mer nyligen, en växande mängd bevis har pekat på en viktig roll för CXCR4 i uppkomst och cancer metastaser vilket gör det till en väl validerad terapeutiska mål i onkologi samt10. CXCR4 uttrycks mycket i mer än tjugo typer av mänskliga cancer och kontroller tumör cellöverlevnad, spridning, och migration samt tumör-relaterade angiogenes10. CXCR4 antagonister av olika kemiska klasser tidigare har beskrivit11,12, men endast små molekylen AMD3100 är för närvarande godkända för användning i kliniken som en agent för mobilisering av stamceller som används vid behandling av lymfom och myelom patienter13,14. Kliniska prövningar pågår för att utvärdera säkerhet och effekt av flera andra CXCR4 antagonister i olika mänskliga sjukdomar, men med ett starkt fokus på onkologi12. Med tanke på de många potentiella tillämpningar för CXCR4 antagonister, är sökandet efter nya föreningar med förbättrade farmakokinetiska egenskaper, förbättrad biotillgänglighet eller potentiellt mindre biverkningar befogad.
Häri, en kinetic fluorescens-baserade cellulära analysen används främst till skärmen för föreningar kan hämma CXCR4 beskrivs. Fluorescerande mätning av denna metod är baserad på den övergående ökningen av intracellulära Ca2 + koncentrationen frammanade vid CXCR4 aktivering av dess endogen agonist, chemokine liganden CXCL12 (tidigare känd som stromal cellen härlett faktor 1α ( SDF1-α)), och potentiella hämningen av detta CXCL12-inducerad Ca2 + svar av särskilda föreningar. I denna analys används U87 mänskliga glioblastoma celler stabilt uttrycker de mänskliga CXCR4-receptorn. Samtidigt saknar dessa celler endogena uttryck för CXCR7, en relaterad chemokine receptor som binder också CXCL1215,16,17. CXCR7 har tidigare också visat sig kunna bilda heterodimerer med CXCR4, därmed modulerande signalering egenskaperna för denna sistnämnda receptor18. Variationer i nivån av intracellulära Ca2 + medieras av CXCR4 övervakas av lastning CXCR4+ celler med fluo-2 acetoximetyl (AM) ester, en cell-permeable hög affinitet fluorescerande Ca2 +-bindande färgämne. Fluo-2 AM är en enda våglängd fluorescerande molekyl som kan vara upphetsad på 490 nm medan dess utsläpp fluorescens mäts vid 520 nm. Detta utsläpp fluorescens ökar vid Ca2 + bindning, med ett stort dynamiskt omfång mellan den Ca2 +-bundet och obundet staten. Ökningen av fluorescerande signal är övergående, som inträffar inom ett tidsintervall på några minuter, och kommer att sönderfalla efteråt. Topphöjd de fluorescerande utsläpp ytterligare korrelerar med nivån av receptor aktiveringen. Analysen själv utförs med hjälp av en fluorescens microplate reader utrustad med en intensifierad CCD (ICCD) kameran som besitter ett integrerat pipettering system som tillåter standardisering av pipettering stegen i analysen (se Tabell för material) . Samtidig mätning av fluorescerande signalen i alla brunnar i en mikroplattan är dessutom en annan viktig fördel med fluorescens läsaren som används. Under första delen av analysen föreningar under utredning (t.ex., en panel av små molekyler med en fast koncentration eller i en utspädning serie) läggs till fluo-2 AM laddad CXCR4+ U87 celler följt av en ~ 10 min inkubationstid under vilken den potentiella agonistiska effekten av föreningarna som mäts kontinuerligt i realtid. Sedan en endogen agonist (dvsCXCL12) läggs till cellerna för att framkalla en CXCR4-medierad övergående ökning av intracellulära Ca2 +. Under denna del av analysen kan den potentiella antagonistisk aktiviteten av de testa föreningarna utvärderas. En schematisk översikt över analysenss allmänna arbetsflödet presenteras i figur 1.
Även om denna Ca2 + mobilisering analys har främst använts för att identifiera och bestämma den hämmande potensen av konkurrenskraftiga CXCR4-antagonister (dvs, föreningar som förhindrar en endogen agonist för att binda och stimulera receptorn), det också kan identifiera receptoragonister och, dessutom, föreningar som utöva sin funktion genom bindning på Alloster platser (dvs, platser som topographically skiljer sig från orthosteric bindningsstället upptas av en endogen agonist). Allosteriska agonister och PAMs och NAMs19,20är exempel på den senare kategorin av föreningar. Medan receptor-specifika antagonister samt NAMs skulle hämma CXCL12-inducerad Ca2 + svaret, PAMs skulle förbättra detta svar (se även diskussionen avsnitt). Även om analysen beskrivs häri specifikt mål CXCR4, det förväntas att denna metod kan tillämpas på andra varandra med minimal optimering ansträngning, åtminstone om de signal via frisläppandet av intracellulära Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Alla stegen som beskrivs i avsnitt 1 och 2 skall utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde skåp.
1. underhåll av U87. CD4.hCXCR4 celler
- Odla cellerna i T75 kultur kolvar på 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
Obs: In vitro- cell linjen används i detta protokoll är en U87 glioblastoma cell fodrar stabilt uttrycker kluster av differentiering 4 (CD4) och mänskliga CXCR4 och har varit tidigare beskrivna17. Cell surface uttryck för CD4 och CXCR4 övervakas kontinuerligt av flödescytometri och uttrycksnivåerna förblir konstant över tiden (~ 100% CD4+ och ~ 100% CXCR4+ celler). En detaljerad beskrivning av generationen av raden för cellen som används och det flöde flödescytometri förfarandet att undersöka receptor uttryck nivåer är inte omfattas av detta protokoll.- Subkultur celler på 80-85% konfluens. Låt samtliga reagenser nå rumstemperatur (RT) innan cellen odling.
- Ta bort luftkonditionerade odlingssubstratet från cellerna och tvätta den cell enskiktslager en gång med 5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 3 mL 0,25% trypsin-EDTA och fördela det jämnt över den cell enskiktslager. Sedan bort överskottet av trypsin-EDTA och ruva upp till 5 min vid 37 ° C tills celler börjar lossna.
- Tillsätt 10 mL av färska komplett odlingsmedium (Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) + 10% fetalt bovint Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + lämpligt urval agenter). Att resuspendera cellerna genom pipettering försiktigt upp och ner. Överföra cellsuspensionen till en steril 50 mL tub.
- Räkna antalet livskraftiga celler med hjälp av en metod för val. När det gäller U87 glioblastoma celler, livskraft allmänhet når ~ 100%.
Obs: Cell nummer kan bestämmas på flera sätt. Vi använder rutinmässigt en automatiserad cell analyssystem utifrån trypan blå färgning (se Tabell för material) enligt dess standard hantering rutiner, men andra seder bör fungera lika bra. - Lägg till 2 x 106 eller 3 x 106 (viabla) celler till en slutlig volym av 25 mL färsk odlingsmedium i en T75 kultur kolv och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Om 3 x 106 celler används cellerna kommer att nå 80-90% konfluens efter 2 dagar. Om 2 x 106 celler används, kommer att de nå den samma konfluens efter 3 dagar. Tillväxttakten i cellerna fastställas först empiriskt om andra cellinjer används.
2. sådd av cellerna för Ca2 + mobilisering analysen
- På dagen av cell passaging (dag 0), kappa svart-walled 96 brunnar polystyrenplattor med tydlig botten (se Tabell för material) med en 0,1% gelatin lösning för att underlätta cell fastsättning.
Obs: Beläggning av 96 brunnar plattorna med gelatin kan utelämnas om pre belagda plattor, som är kommersiellt tillgängliga (se Tabell för material), används. Det rekommenderas att utvärdera användningen av pre plattorna istället för manuell beläggning för varje cellinje under utredning innan du fortsätter med protokollet.- Förbereda gelatin lösningen genom att lägga till 1 g gelatin till 100 mL PBS att få en 1% lösning. Späd 10 x med PBS innan fortsatt användning. För att förbättra lösligheten hos gelatin, värm lösningen på 37 ° C.
- Tillsätt 100 µL av 0,1% gelatin lösning per väl av den plattan med 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera i 2 h på RT.
- Under tiden förbereda cellerna för sådd i den belagda plattan med 96 brunnar.
- Lossa cellerna från kultur kolven, Återsuspendera dem i färska odlingsmedium och räkna dem med trypan blå färgning metod.
- Snurra ner cellerna i en 50 mL tub för 5 min vid 400 x g vid RT.
- Att resuspendera cellerna i färska odlingsmedium (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, inga antibiotika) att få en cell densiteten av 0,1 x 106 (lönsamt) celler/mL.
- Ta bort gelatin lösningen från svart-walled plattorna med tydlig botten genom att vända över plattan och torka på en vävnad. Tillsätt 200 µL per brunn PBS ta bort överflödig gelatin och vänd plattan igen.
- Dispensera 200 µL cellsuspension (motsvarande 0,2 x 105 celler) per brunn i gelatin-belagd 96 brunnar plattan (från och med nu en denna platta kommer ytterligare betecknas som ”mätning plattan”).
- Inkubera plattan över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
3. lastning av cellerna med en fluorescerande Ca2 + -känsliga Dye
- Dag 1 utföra faktiska Ca2 + mobilisering analysen, börjar med lastning av de seedade cellerna med fluorescerande Ca2 +-bindande färga fluo-2 AM.
- Förbereda analysbuffert genom tillsats av 40 mL HEPES (1 M) till 200 mL Hanks balanserad saltlösning (HBSS, 10 x, ingen fenolrött, ingen natriumbikarbonat). Tillsätt ultrarent vatten för att få en slutlig volym av 2 L och lägga till 4 g bovint serumalbumin (BSA). Lös upp BSA via magnetisk omrörning. Justera pH till 7,4 (med NaOH) och filtrera lösningen.
Obs: Under alla följande steg används samma bufferten, kallad ”analysbuffert”. - Förbereda en stamlösning (4 mM i dimetyl sulfoxid (DMSO)) av den fluorescerande Ca2 +-känsliga färga fluo-2 AM. Undvika överdriven exponering för ljus. Lös upp 1 mg fluo-2 AM (molekylvikt: 1 061 g/mol) i 235,6 µL DMSO.
- Förbereda en fungerande lösning för fluo-2 AM. För en 96 brunnar assay tallrik Blanda 12,5 µL fluo-2 AM stamlösning (4 mM) och 12,5 µL icke-jonaktivt ytaktivt ämne polyol (t.ex., pluronic f-127) lösning (20% vikt/volym i DMSO, se Tabell för material). Tillsätt 22 µL av denna blandning till 11 mL analysbuffert i en 15 mL tub. Den slutliga koncentrationen av fluo-2 AM är 4 µM.
Obs: Den icke-jonaktivt ytaktivt ämnen används som en spridning agent för att förbättra vattenlöslighet fluo-2 AM och i följden, att förbättra cell lastning. För att solubilize tensid i DMSO, värm provet vid 37 ° C och blanda regelbundet för att erhålla en homogen lösning. - Ta bort odlingsmedium från tidigare seedade cellerna i 96 brunnar mätning plattan genom att vända över plåten och torka på hushållspapper.
- Tillsätt 100 µL av färgämne buffertlösning per brunn med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera i 45 min på RT i mörkret.
- Förbereda analysbuffert genom tillsats av 40 mL HEPES (1 M) till 200 mL Hanks balanserad saltlösning (HBSS, 10 x, ingen fenolrött, ingen natriumbikarbonat). Tillsätt ultrarent vatten för att få en slutlig volym av 2 L och lägga till 4 g bovint serumalbumin (BSA). Lös upp BSA via magnetisk omrörning. Justera pH till 7,4 (med NaOH) och filtrera lösningen.
4. beredning av 96 brunnar polypropylen plattor som innehåller den Chemokine Ligand CXCL12 eller föreningarna under utredning
- Erhålla rund botten polypropen (PP) 96 brunnar (se Tabell för material).
- Tillåta stamlösning av CXCL12 (1 mg/mL) och stamlösning av föreningar under utredning temperera på RT.
Obs: Stamlösning av CXCL12 är beredd i ultrarent vatten kompletteras med 0,01% Tween20 och lagras vid-20 ° C som engångsbruk alikvoter. - Förbereda en 5 x koncentrerad lösning av CXCL12 i analysbuffert (250 ng/mL vilket motsvarar 31.25 nM) och en 5 x koncentrerad utspädning av varje förening (i analysbuffert).
- Fördela de Lagerföra lösningarna i den lämpliga plattan med 96 brunnar enligt en fördefinierad plattan layout. Fördela 75 µL per brunn i plattan som innehåller CXCL12 (”chemokine plate”), fördela 50 µL per brunn i plattan som innehåller föreningarna (”sammansatta plate”).
Både föreningar och CXCL12 kommer slutligen att bli utspädd 5 x vid utlämning i mätning plattan. Det är också viktigt att inkludera negativa kontrollbrunnar innehållande endast analysbuffert i såväl förening plattan som chemokine plattan. Också positiva kontrollbrunnar behöver inkluderas (dvsbrunnar med CXCL12 i chemokine plattan, men med Analysbuffert i motsvarande brunnarna av sammansatta plattan).
- Tillåta stamlösning av CXCL12 (1 mg/mL) och stamlösning av föreningar under utredning temperera på RT.
5. protokollinställningarna på fluorescens mikroplattan läsaren
Obs: Fluorescens mikroplattmetoden används i detta protokoll hänvisas till i Tabellen för material.
- Växla på svalare enheten av fluorescens plattan läsaren först, och sedan växla på fluorescens läsaren själv. Låt inleda ett par minuter och öppna systemets programvara.
- Skapa analysens protokoll med hjälp av dra-och-släpp-menyn som innehåller följande steg:
- ”Inställningar” i rutan Välj 'Read_Mode' med excitation våglängd: 470-495 nM. utsläpp våglängd: 515-575 nM.
Obs: De valda våglängderna är lämpliga för användning med Ca2 +-känsliga dye fluo2. - Inkluderar rutan ”Mix med TF” (överföring vätska) för automatisk blandning av föreningar i sammansatta plattan, som kommer att införas vid källan 2 position av enheten (se steg 6,4). Välj 15 µL lösning i varje brunn automatiskt aspirerade och blandas tre gånger. Justera höjden på pipettspetsarna på 20 µL under vätskeytan. Ange hastigheten för aspiration och dispensering vid 50 µL/s.
Obs: Höjden på pipettspetsarna refererar till den volym som finns kvar under pipettspetsarna. Exempelvis om brunnarna sammansatta platta innehåller 50 µL, motsvarar en höjd av 30 µL 20 µL under vätskeytan. Volymen av sammansatta lösningen att blanda, hastigheten på blandning, positionen för pipetten tips under blandning, och antalet blandning cykler kan alla justeras med hjälp av programvaran. - ”Överföra vätska” i rutan definiera det 20 µL av varje brunn från sammansatta plattan kommer att överföras till mätning plattan. Placera pipettspetsarna på 20 µL under vätsketillförselns yta dvshöjd 30 µL under aspiration av föreningar och höjd 60 µL under dispensering i mätning plattan. Ställa in hastigheten på aspiration vid 50 µL/s och hastigheten på dispensering på 25 µL/s.
Obs: Sammansatta plattan innehåller 50 µL lösning per brunn (se steg 4.1.3), således en höjd av 30 µL motsvarar en position 20 µL under vätskeytan. Mätning plattan kommer att innehålla 80 µL analysbuffert per brunn (se steg 6.3), således en höjd av 60 µL motsvarar en liknande position tips. - Välj knappen ”Läs med TF”. I första pausen, Välj 60 läsningar (fluorescerande mätningar) med en Läs intervalltiden för 1 s. definiera som 10 läser registreras före dispensering av föreningar i mätning plattan, och 50 läser efteråt. Ange det andra intervallet med en Läs intervalltiden för 30 s och 18 läsningar.
Obs: Detta steg fluorescens kommer mätas kinetiskt (vid definierade tidsintervall) för ~ 10 min totalt. - Inkludera knappen ”tvätta Tips” i protokollet tre gånger. Inom varje tvätt steg, Välj vilken vätska: vätska en (ultrarent vatten) eller vätska B (70% etanol), antalet tvätta cykler (1), pumpen speed (snabb), och antalet simtag (5) under varje tvätta steg.
Obs: Under först och sista tvätt steg vätska A används, under det andra steget tvättvätskan B används. - Inkludera funktionen ”paus vi rekommenderar”. Ange den vi rekommenderar att pausa för 300 s.
Obs: Genom detta steg i protokollet, vi rekommenderar att huvudet, som är integrerad i fluorescens plattan läsenhet, pausar för 5 min innan du fortsätter protokollet. - Inkluderar ”Mix med TF” rutan för att tillåta automatisk blandning av CXCL12 lösningen i chemokine plattan, som kommer att vara placerad vid enheten källa 3 position (se steg 6,4). Välj 15 µL lösning i varje brunn automatiskt aspirerade och blandas tre gånger. Under aspiration och mixning, placera den pipett tips 20 µL under vätskeytan. Hastigheten på aspiration och dispensering är satt till 50 µL/s.
Obs: Liknande när det gäller steg 5.2.2, dessa parametrar kan justeras. - Efterföljande ”överföra vätska” i rutan definiera det 25 µL från varje väl av chemokine plattan kommer att överföras till mätning plattan. Position tips 20 µL under vätsketillförselns yta dvspå höjd 55 µL under aspiration från chemokine plattan som innehåller 75 µL per brunn (se steg 4.1.3), och på höjden 80 µL under dispensering i mätning plattan. Ställa in hastigheten på aspiration vid 50 µL/s och hastigheten på dispensering på 25 µL/s.
- Inkludera knappen ”Läs med TF”. I första pausen, Välj 145 läsningar med en Läs intervalltiden för 1 s. definiera som 5 läser registreras före dispensering CXCL12 i mätning plattan, och 140 läser efteråt. Ange det andra intervallet med en Läs tidsintervall av 6 s och välj 20 läsningar.
Obs: Sammantaget i hela hela protokollet 243 läsningar (fluorescerande mätningar) registreras: 78 vid steg 5.2.4 och 165 under steg 5.2.9. - Liknar steg 5.2.5, inkludera knappen ”tvätta tips” tre gånger i protokollet.
Obs: Inklusive detta steg i slutet av protokollet tillåter att tipsen kan återanvändas till utföra en annan analys utan att behöva ändra tips.
- ”Inställningar” i rutan Välj 'Read_Mode' med excitation våglängd: 470-495 nM. utsläpp våglängd: 515-575 nM.
- Ställa in temperaturen i enheten vid 37 ° C genom att klicka på knappen ”Ställ in scenen temperatur” och välja 37 ° C.
6. kör fluorescens analysen
- Efter mätningen har plattan inkuberas med lastning buffert för 45 min (se steg 3.1.5), avlägsna bufferten genom att vända över plattan och torka den på en vävnad.
- Tvätta seedade cellerna genom att lägga till 150 µL per brunn av analysbuffert och inkubera i 2 min.
- Avlägsna bufferten igen genom att vända över plattan. Lägga till 80 µL per brunn av analysbuffert med en flerkanalspipett.
- Sätta alla plattorna i enheten vid deras lämplig position: sammansatta plattan vid källan 2 position, chemokine plattan vid källa 3 position och mätning plattan vid Läs position. Sätt en låda med svarta toppar på källa 1 tips position. Stänga av enheten har dörr och inkubera i 5 min innan du fortsätter protokollet.
- Välj knappen ”protokoll signal test” att fastställa bakgrunden relativa ljus enheter (RLUs) och fluorescens varians över plattan. Ett nytt fönster kommer att dyka. Välj ”Testa signalen”.
Obs: Under detta steg, bakgrunden RLUs bestäms av den ICCD kamera, som är integrerad i optik facket av fluorescens läsare enheten. Dessa RLUs resultera från excitation av de Ca2 +-känsliga färgämne (fluo-2) av lysdioder (LEDs) (LED utgång våglängd 470-495 nm). Värden av 8,000-10,000 RLUs är väl lämpad för denna applikation. RLUs kan, om nödvändigt, anpassas genom att ändra magnetiseringen intensiteten (Välj Exc. intensitet) eller kamera grinden (Välj Gate öppen). Avvikelsen under plattan bör helst vara mindre än 7,5%. - Välj ”Uppdatera” om bakgrundsnivåer av 8,000-10,000 RLUs erhålls. Spara huvudsakliga protokollet genom att klicka på knappen Spara.
Obs: På så sätt inställningarna från protokollet signal testet kommer att föras över till huvudsakliga protokollet. - Köra analysen genom att trycka på ”Kör” knappen.
7. dataanalys och kvalitet
- När analysen är klar, öppna rutan ”analys” i systemets programvara.
- Gå till ”konfigurera korrigeringar” och välja ”svar över base line”. Definiera base line 1 Starta när mätning 1 och slutet vid mätning 5; den genomsnittliga fluorescensen kommer att beräknas i varje brunn mellan mätning 1 och 5.
Obs: Alla ytterligare mätningar från en viss väl delas av denna väl-specifika base line 1.- Definiera bas linje 2 att starta vid mätningen 78 förrän mätning 83 (CXCL12 dispenserats efter mätning 83; igen den genomsnittliga fluorescensen beräknas i varje väl mellan mätning 78 och 83 och denna korrektionsfaktor används för alla mätningar efter mått 83).
- Aktivera kryssrutan ”Visa som procent” och ”subtrahera bakgrunden”.
- Gå till ”konfigurera kinetiska minskning”. Utvärdera den hämmande effekten av föreningar på CXCL12-inducerad Ca2 + svaret, välja Max-Min start från mätning 84 (dvs, den första mätningen efter vilken CXCL12 dispenserats) 243 (dvs, den slutliga mätningen).
Obs: Genom att välja Max-Min skillnaden mellan den lägsta och högsta Svaren över baslinjen mellan mätning 84 och mätning redovisas 243. Om Max-Min är valt börjar mellan mätning 11 och mätning 78, redovisas skillnaden mellan den lägsta och högsta Svaren över baslinjen i förhållande till utgångsvärdet 1. Detta värde kan användas för att analysera potentiella agonistiska aktiviteten av föreningar, se diskussion). - Data kommer att visualiseras i systemets programvara. Om det behövs, exportera rådata för ytterligare analys och visualisering i andra gemensamma analys programvarupaket.
- Gå till ”konfigurera korrigeringar” och välja ”svar över base line”. Definiera base line 1 Starta när mätning 1 och slutet vid mätning 5; den genomsnittliga fluorescensen kommer att beräknas i varje brunn mellan mätning 1 och 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av CXCL12 stimulering med intracellulära Ca2 + mobilisering i U87. CD4.CXCR4+ och U87. CD4-celler utvärderades med Ca2 + mobilisering analys. I stället för 20 µL av test förening som normalt skulle läggas under första pipettering steg av protokollet (figur 1), analysbuffert lades till fluo-2 AM laddad U87. CD4.CXCR4+ celler i mätning plattan. Under munstycket steg olika koncentrationer av CXCL12 (0,2-102,4 nM, slutlig koncentration) var förpackat i mätning plattan. En dosberoende ökning av fluorescens, korrelera med en dosberoende ökning av frisättningen av Ca2 +, påvisas (figur 2A). Här, det negativa kontrollprovet representerar dessa brunnar där på båda tillägg endast analysbuffert lades till mätning plattan (dvs0 nM CXCL12), vilket resulterar i avsaknad av ett svar (figur 2A). Ökande mängder CXCL12 inducera ökade nivåer av fluorescens som förfalla över tiden (figur 2A). Från dessa data, var en dos-responskurva genereras baserat på ”Max-Min svar över baslinjen” mellan mätning 84 (dvs, den första mätningen efter CXCL12 tillägg) och mätning 243 (dvs., den slutliga mätningen i protokollet ). Använda icke-linjär regression, EG50 värdet (dvs, den koncentration som behövs för att framkalla den halva maximalt Svaren) bestämdes och motsvarar 1,14 nM (figur 2B). Ingen fluorescerande Ca2 +-relaterade svar var framkallat av CXCL12, även vid hög koncentration (102,4 nM), när U87. CD4-celler saknar funktionell CXCR4 uttryck användes. Detta visar mätningen frammanade av CXCL12 receptor-specificitet (figur 2 c).
En nyckel ansökan om denna cell-baserad analys är identifiering av små molekyler specifikt inriktade CXCR4 och kan hämma CXCL12-inducerad Ca2 + mobilisering. Om aktiva föreningar (”hits”) har identifierats, kan de ytterligare kännetecknas av testning seriespädningar av föreningen och analysera hämmande potens mer i detalj. Som ett exempel illustreras effekten av bicyclam AMD3100, en väletablerad liten molekyl CXCR4-specifik receptorantagonist med potenta anti-HIV-1-aktiviteten21,22, i figur 3. En koncentration serie AMD3100 (n = 4, 3 µM ner till 1,37 nM slutlig koncentration i en 1/3 spädningsserien) var expedieras på U87. CD4.CXCR4+ celler under det första steget i protokollet. Föreningen fick sedan ruva med cellerna för ~ 10 min under vilken fluorescens signalen spelades kontinuerligt. Sedan 6,4 nM CXCL12 (50 ng/mL, slutlig koncentration) lades till alla brunnar i plattan cellen samtidigt för att inducera CXCR4-medierad Ca2 + mobilisering. Dosberoende hämning av detta svar från de olika spädningarna av AMD3100 visas i figur 3A. I detta fall visas endast del av grafen efter tillägg av CXCL12. Som en negativ kontroll (blå linje) enda buffert användes i analysen (ingen före inkubering med AMD3100, ingen CXCL12 till brunnarna), vilket resulterade i den förväntade bristen på svar. Den positiva kontrollen (röda linjen) motsvarar proverna i vilken 6,4 nM CXCL12 lades till brunnar utan föregående inkubering av AMD3100 (figur 3A). Baserat på dessa definierade negativa och positiva kontroller Z' värde i denna analys är vanligtvis mellan 0,5 och 1. För att avgöra den hämmande potensen av AMD3100 en dos-respons kurva genererades av icke-linjär regression leder till ett beräknat IC50 värde av 770,8 nM (figur 3B). För att ytterligare illustrera beteendet hos en icke aktiv förening, ingick maravirok i detta experiment. Maravirok är en liten molekyl som specifikt hämmar CC chemokine receptorn 5 (CCR5) vilket förhindrar (CCR5)-tropic HIV-1 infektion23 . Även vid hög koncentration (10 µM slutlig koncentration) observerades ingen hämmande effekt av denna förening CXCR4-medierad Ca2 + svaret (figur 3A).
Slutligen, för att påvisa att denna Ca2 + mobilisering analys också kan användas för att studera andra varandra, en seriell utspädning av CC chemokine liganden 5 (CCL5), endogena liganden för CCR5, lades till celler som uttrycker CCR5 (U87. CD4.CCR5+) använder exakt samma experimentella förhållanden och maskinvaruinställningar. En dosberoende fluorescerande Ca2 + svar framgår efter tillägg av en seriell utspädning av CCL5 (figur 3 c). Dessutom, och i motsats till dess effekt på CXCR4, före inkubering med 100 hämmade nM (slutlig koncentration) av maravirok starkt detta svar (figur 3D).
Figur 1: Schematisk översikt över analysenss arbetsflöden. På dag 0 celler uttrycker GPCR sevärdheter (i detta fall CXCR4) är seedade i svart-walled 96 brunnar med tydlig botten och odlas över natten vid 37 ° C och 5% CO2. Dag 1 utförs fluorescens-baserade Ca2 + analysen. Celler är först laddade med en fluorescerande Ca2 +-känsliga färgämne (fluo-2 AM) och inkuberas i 45 min på RT i mörkret. En ”chemokine” och ”sammansatta plåt” tillagas (PP = polypropylen). Efter inkubation med lastning färgämne, tvättas seedade cellerna en gång med Analysbuffert (150 µL per brunn) varefter 80 µL per brunn av analysbuffert läggs. Alla plattor inkuberas därefter 5 min i enheten vid 37 ° C innan analysen. Då kommer föreningar av intresse (t.ex., små molekyler) expedieras på önskad koncentration i brunnar Skyltens mätning och tillåtet att Inkubera i ~ 10 min medan fluorescens mäts kontinuerligt. Nästa, en fast koncentration av en endogen agonist av GPCR (här CXCL12) läggs till framkalla Ca2 + release och fluorescens registreras ytterligare med tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Agonistisk verkan av CXCL12 på CXCR4+ celler och specificitet av upptäckta svar. (A) dosberoende effekt CXCL12 på Ca2 + mobilisering i U87. CD4.CXCR4+ celler. (B) utifrån Max-Min respons över baslinjen mellan mätning 84 och 243 en dos-respons kurva genererades och EG50 värdet beräknas (n = 4, genomsnitt ± SD). (C) inget svar var induceras av CXCL12 när det var ut på U87. CD4-celler saknar CXCR4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Illustration av effekten av en CXCR4-antagonist (AMD3100) och en icke-aktiva förening (maravirok) på CXCR4+ celler och aktivering av CCR5 av dess endogen agonist, CCL5. (A) dosberoende hämmande effekt av AMD3100 med Ca2 + mobilisering frammanas genom att lägga till 6,4 nM CXCL12 till U87. CD4.CXCR4+ celler. Maravirok (på 10 µM slutlig koncentration) visade ingen hämmande effekt på CXCL12-inducerad Ca2 + svar. (B) baserat på Max-Min respons över baslinjen mellan mätningen 84 och 243, en hämmande dos-respons kurva genererades och IC50 värdet beräknades till 770,8 nM (n = 4, genomsnitt ± SD). (C) dosberoende aktivering av CCR5 av dess endogen agonist, CCL5. (D) hämning av CCR5-medierad Ca2 + svar före inkubering av cellerna med 100 nM för maravirok. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Ca2 +-mobilisering-analysen som beskrivs häri har tidigare visats vara ett värdefullt verktyg för att identifiera och karaktärisera-receptorantagonister inriktning CXCR417. Det förväntas dock att denna metod kan tillämpas mer allmänt till en stor grupp andra varandra som utlöser en cytosoliska Ca2 + release vid deras aktivering, som illustreras för relaterade chemokine receptorn CCR5. När det gäller CCR5 exakt samma experimentella villkor kunde tillämpas, kommer att flera steg i protokollet (e.g.cell nummer på plätering, lastning av cellerna med ett fluorescerande färgämne) behöva vara åter optimerad innan du överför analysen att andra varandra för att erhålla en gynnsam signal-brus-förhållande. En viktig fråga här är också valet av lämpliga in vitro- cellulära värd möjliggör hög nivå uttryck för GPCR av intresse och funktionell koppling till Ca2 + vägen. Vid CXCR4, mänskliga glioblastoma U87 celler valdes på grund av: (1) brist på endogent uttryck för CXCR7 (en relaterade chemokine receptor som upptar den samma agonist som CXCR4), (2) deras förmåga att par CXCR4 aktiveringen till de Ca2 +-signalering väg, (3) det gynnsamma dynamiska omfånget av fluorescerande svar erhålls efter lastning av cellerna med Ca2 +-känsliga färgämne, och (4) deras utmärkta adherencen till analysens plattor minimerar cell störningar under hela förfarandet. Alla dessa parametrar kan behöva bestämmas experimentellt för varje roman GPCR sevärdheter och varje cellulära uttryck systemet.
När du ställer in en liknande test för en annan GPCR, kan flera alternativa steg eller reagenser i protokollet betraktas. Exempelvis andra Ca2 +-känsliga fluorophores (e.g., fluo-4, fluo-3) kan användas som ett alternativ för fluorophore (fluo-2) används i detta protokoll. I löst vidhäftande celler, tvättning av cellerna kan utelämnas genom att införa nr-tvätta färgämnen för att minimera cell lossnar24. Dessutom skulle exklusive steget tvätt från protokollet ytterligare öka analysenss genomströmning. Även om denna analys kan också utföras med celler visar endogena uttryck för CXCR4, till exempel inklusive olika typer av mänskliga cancer cell linjer10,25, bör det noteras att med stabilt transfekterade cell linjer hög GPCR uttrycksnivåerna som förblir stabila över tid kan erhållas. Detta kommer att resultera i mer uttalad assay mätningar, ett större fönster för tillförlitliga uppgifter tolkning, och konsekvent assay prestanda över längre perioder. När du använder celler endogenously kommer uttrycker CXCR4 det vara mycket svårare att uppnå detta resultat.
En stor nackdel med analysen är att det bygger på en fluorescens-mätning. Autofluorescent föreningar kan därför störa analysens mätning, som utesluter dem från analys på grund av tolkning av opålitliga data. Denna Ca2 + mobilisering analys utförs också, helst med en cellulär screening system utrustade med integrerade pipettering system som tillåter standardiserade blandning och dispension av föreningar och receptoragonist i mätning plattan i alla brunnar samtidigt. Analysen kan dock vara anpassade för användning med andra, mindre dyra fluorescens mikroplattan läsare med kinetic mätning kapacitet. Tillägg av föreningar och agonist skulle då behöva utföras manuellt med multikanal pipetter, som ökar hands-on-på-gång och sänker analysens genomströmning. Dessutom skulle erhålla ett liknande antal fluorescens mätningar inom ett visst tidsintervall på en kinetisk test vara svårt att uppnå så många mikroplattan läsare mäta signaler väl-av-väl medan high-end screening system mäta alla brunnar samtidigt.
-Receptorantagonister förhindra bindning till receptorn och efterföljande aktivering av en endogen agonist (CXCL12) för närvarande bildar den största kategorin av föreningar som är särskilt inriktad på CXCR411,12. AMD3100, den liten molekyl som användes för att illustrera prestanda för Ca2 + mobilisering analysen, är en av de mest framstående exemplen CXCR4 antagonister26. Förutom-receptorantagonister höja molekyler som reglerar GPCR signalering annorlunda allmänt intresse också. Dessa molekyler är inversa agonister, samt GPCR PAMs och NAMs19,20,27. Ett intressant inslag i den analysmetod som beskrivs i detta manuskript är att det inte bara kan identifiera-receptorantagonister, men också agonister och Allosteriska modulatorer. Vissa mindre anpassningar till de analys och begränsningar måste dock beaktas.
PAMs och NAMs binder till receptorer topographically skild från webbplatsen orthosteric bindande upptas av receptorns endogen ligand. PAMs stärka den styrka och/eller effekten av receptorns endogena ligand(s), hämmar NAMs den styrka och/eller effekt av endogena ligand(s)19,20. PAMs har ingen inneboende agonistisk effekt. De är bara aktiva i närvaro av en endogen agonist, till skillnad från så kallade Alloster agonister. Eftersom Alloster GPCR modulatorer skulle framkalla mindre biverkningar än klassiskt-receptorantagonister när tillämpas i kliniska inställningar28,29, är de värdefulla farmakologiska verktyg. I vår analys, alloster agonister skulle framkalla en övergående förhöjning av fluorescens signalen omedelbart vid tillägg till CXCR4+ celler. Receptorn specificitet denna signal bör sedan bestämmas genom provning samma förening med samma analys, men på celler saknar CXCR4. När specifikt screening för PAMs, bör en lägre koncentration av endogen agonist användas i analysen för att inducera en fluorescerande Ca2 + svar. Även om denna lägre mängd agonist kommer att generera en mindre fluorescerande signal, lämnar det ett större fönster för att upptäcka ytterligare receptorn stimulering. Vanligtvis är en agonist koncentration motsvarar EG10- EG30 värdet av receptorn stimulering valt30,31. Tillägg av en PAM under den första delen av analysen skulle inte resultera i en ökad fluorescerande mätning. Men skulle den fluorescerande Ca2 + signalen efter efterföljande stimulering av receptorn med dess endogen agonist öka. Likaså en NAM förändrar inte fluorescerande mätningen innan agonist tillägg, men hämmar receptorns svar efter tillägg av en agonist. Därför kommer aktivitetsprofilen en receptorantagonist och en NAM likna. De båda medför hämning av fluorescerande svaret efter agonist tillägg. Därför ytterligare krävs experimentella studier för att diskriminera mellan en antagonist och en NAM. Här, receptor bindningsstudier whereby omärkt föreningar konkurrera med ett fast belopp på märkt CXCL12 för bindande vid CXCR417,32 kan vara en värdefull strategi för att diskriminera en antagonist, som skulle förhindra den märkt agonist från att binda till receptorn och en NAM som skulle inte som det inte skulle dela samma receptor bindande plats.
Ligand oberoende (eller basal eller konstituerande) aktiviteten av varandra har observerats för många varandra33 även basala aktivitetsnivån är generellt ganska låg när varandra uttrycks recombinantly27. Basala GPCR verksamhet kan förbättras genom naturligt förekommande mutationer33 och en punktmutation som leder till ökad basal CXCR4 aktivitet har varit beskrivs tidigare34. Genom koppling denna konstitutivt aktiv CXCR4-mutant till feromon svar vägen i jäst och [35S] GTPγS bindande experiment, det visades att T140, en peptid-baserad CXCR4 antagonist med potenta anti-HIV aktivitet17,35 minskade signifikant denna basala verksamhet och således visades att bete sig som en invers agonist34. Att notera, i en Fura-2 fluorescens-baserade Ca2 + mobilisering test samma författare observerade en liten övergående minskning Ca2 +-relaterade fluorescens efter tillägg av T140 till celler som uttrycker mutant CXCR4, vilket tyder på en minskning av basala receptor aktivitet34. Men när analysera en extra panel av cykliska pentapeptid-baserade CXCR4 inversa agonister designad från T140, var upptäckt av minskad basal aktivitet med en Ca2 + mobilisering test mindre okomplicerad36. När effekten av T140 på celler som uttrycker vildtyp CXCR4 analyserades med Ca2 + mobilisering analys som beskrivs i detta manuskript, observerades ingen förändring i basal fluorescens signal17. Dessutom fluorescens fluktuationer är snabb och övergående och ökningar av basala Ca2 + , exempelvis inte observeras i celler som uttrycker en konstitutivt aktiv Gαq-kopplade receptorer4. Sammantagna skulle effekten av inversa agonister vara mycket svårt, om inte omöjligt att identifiera och utvärdera tillförlitligt med vår analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Eric Fonteyn och Geert Schoofs för utmärkt teknisk assistans. Detta arbete har stötts av den KU Leuven (bevilja nr. PF/10/018), den Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, bevilja nr. G.485.08), och den Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).
