Summary
Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.
Abstract
I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono di grande importanza per l'industria farmaceutica come sono implicati in molte malattie umane e includere obiettivi ben convalidati per intervento terapeutico. Scoperta di composti di piombo, tra cui piccole molecole sintetiche, che specificamente inibiscono la funzione del ricevitore, è un passo iniziale importante nello sviluppo di farmaci e si basa su analisi cell-based sensibili, specifiche e robuste. Qui, descriviamo un'analisi cinetica cellulare con una lettura fluorescente progettata principalmente per identificare gli antagonisti di recettori specifici che inibiscono il Ca2 + rilascio intracellulare evocato al momento dell'attivazione del recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4) dal suo ligando endogeno, il ligando di chemochine CXC 12 (CXCL12). Un vantaggio chiave di questo metodo è che permette anche lo screening di composti dotati di proprietà intrinseche agonistica (cioè, composti che provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2 + in assenza di CXCL12) o composti modulazione della funzione del recettore attraverso l'interazione con i siti di legame allosterico (cioè, modulatori allosterici positivi e negativi (PAMs e NAMs, rispettivamente)). Sul lato negativo, autofluorescent composti potrebbero interferire con indicazione del dosaggio, ostacolando quindi interpretazione dei dati affidabile. Molto probabilmente questo dosaggio può essere implementato, con adattamenti minimi, come un saggio di scoperta di farmaci generici per molti altri GPCR di cui l'attivazione conduce ad un rilascio di Ca intracellulare2 +.
Introduction
GPCR sono un'importante superfamiglia di proteine di superficie delle cellule che attivano cascate di trasduzione del segnale al ligando extracellulare. Possono essere attivati da una grande varietà di stimoli compreso peptidi, ormoni proteici, ammine biogene e lipidi, che provoca l'avvio di diverse vie di segnalazione intracellulare e risposte biologiche alla fine1,2 . Inoltre, GPCR sono coinvolti in molti, se non tutti, i processi fisiologici e di sviluppo e molte malattie umane sono associati con sovraespressione di segnalazione o recettori GPCR disfunzionale. GPCR rientrano pertanto tra i bersagli farmacologici più convalidati in medicina1,3.
In genere, un flusso di lavoro GPCR droga scoperta inizia con saggi di screening cellulare che consentano l'identificazione di composti quali piccole molecole, anticorpi monoclonali e peptidi che possono modulare l'attività di un GPCR particolare. Nella scoperta della droga GPCR esistono molti diversi tipi di analisi per la ricerca di tali composti, molti dei quali sono compatibili con le campagne di screening resa medio-alta. I saggi più utilizzati comprendono esperimenti di binding recettoriale, fluorescenza o luminescenza basato saggi rilevare le fluttuazioni nel livello del cosiddetti messaggeri secondari (per esempio, Ca2 +, monofosfato di adenosina ciclico (AMP)), fenotipiche analisi della selezione e reclutamento di β-arrestina dosaggi4. La scelta per un particolare tipo di analisi può dipendere da diversi fattori, ma è anche determinata dalla conoscenza preventiva riguardante le proprietà di segnalazione di un GPCR determinato. Agonista vincolante di un GPCR induce un cambio conformazionale che catalizza lo scambio di difosfato di guanidina (PIL) per trifosfato di guanidina (GTP) sulla α-subunità delle proteine G eterotrimeriche. Successivamente la subunità di Gα-GTP si dissocia dalla subunitàβγ G ed entrambe le subunità avvierà ulteriori vie di segnalazione. Idrolisi della molecola di GTP e successiva ri-associazione il Gα- PIL e subunitàβγ G ripristinerà la proteina di G nella sua conformazione inattiva5,6. Basato su somiglianza di sequenza della subunitàα G sono definiti diversi tipi di proteine G (Gs, Gi, G,q, G12/13)7. Segnalazione tramite il Gα subunità dà luogo a diverse risposte tipiche come l'aumento (via Gs) o diminuire (via Gio) di produzione di AMP ciclico e mobilizzazione intracellulare di Ca2 + (via Gq)5 ,7. Subunitàβγ G sono anche in grado di indurre vie effettrici intracellulari. Per esempio, al momento dell'attivazione di Gio-GPCR accoppiati, Gβγ può stimolare direttamente la fosfolipasi C (PLC-β) per la produzione di inositolo trifosfato (IP3) che innesca il rilascio di Ca2 + dai depositi intracellulari7 . Dopo l'attivazione dei recettori GPCR sono fosforilati da chinasi GPCR (GRK) che favorisce l'interazione con β-arrestins. Questo processo termina G proteina di segnalazione e conduce alla interiorizzazione e alla fine la desensibilizzazione del recettore. Β-arrestins sono anche in grado di formare complessi multi-molecolari che possono innescare altre vie di segnalazione indipendente di segnalazione8G di proteine.
All'interno della sottofamiglia dei recettori per le chemochine, Gio-CXCR4 accoppiato è un GPCR che ha suscitato molto interesse come un bersaglio promettente per la scoperta di nuovi farmaci. Dato il suo ruolo stabilito come un importante co-recettore per il virus di immunodeficenza umana 1 (HIV-1) entrata virale e infezione, composti CXCR4 di targeting sono stati inizialmente sviluppati come farmaco anti-HIV candidati9. Più recentemente, un corpo crescente di prova ha indicato un ruolo importante per CXCR4 nella tumorigenesi e cancro metastasi che lo rende un obiettivo terapeutico e validato in oncologia pure10. CXCR4 è altamente espresso in più di venti tipi di cancro umano e controlla la sopravvivenza delle cellule del tumore, proliferazione e migrazione, nonché l'angiogenesi tumore-relativi10. CXCR4 antagonisti di classi chimiche differenti precedentemente sono stati descritti11,12, ma solo la piccola molecola che AMD3100 è attualmente approvato per l'uso in clinica come un agente di mobilizzazione delle cellule staminali usato durante il trattamento di linfoma e mieloma pazienti13,14. Studi clinici sono in corso per valutare la sicurezza e l'efficacia di parecchi altri antagonisti di CXCR4 in diverse malattie umane, ma con un forte focus su oncologia12. Data le molte applicazioni potenziali per CXCR4 antagonisti, è opportuna la ricerca di nuovi composti con proprietà farmacocinetiche migliorata, migliorata biodisponibilità o potenzialmente meno effetti collaterali.
Qui, un'analisi di cellulare cinetica fluorescenza-basata principalmente usato per schermo per composti capaci di inibire CXCR4 è descritto. Le misure in fluorescenza di questo metodo si basa sull'aumento transitorio della concentrazione intracellulare di Ca2 + evocata all'attivazione di CXCR4 dal suo agonista endogeno, il ligando di chemochina CXCL12 (precedentemente noto come fattore 1 α (derivati da cellule stromali SDF1-α)) e la potenziale inibizione di questa risposta2 + Ca CXCL12-indotta da particolari composti. In questa analisi, le cellule di glioblastoma umano U87 che esprimono il recettore CXCR4 umano sono utilizzate. Allo stesso tempo, queste cellule mancano dell'espressione endogena di CXCR7, un ricevitore di chemokine correlate che si lega anche CXCL1215,16,17. CXCR7 ha tradotto anche dimostrato di essere in grado di formare eterodimeri con CXCR4, quindi modulazione delle proprietà segnalazione di questo recettore quest'ultimo18. Fluttuazioni del livello di Ca intracellulare2 + mediata da CXCR4 sono monitorate caricando il CXCR4+ cellule con estere acetossimetil fluo-2 (AM), una cellula-permeabile ad alta affinità fluorescente Ca2 +-associazione tintura. Fluo-2 AM è una molecola fluorescente di singola lunghezza d'onda che possa essere eccitata a 490 nm, mentre la sua fluorescenza emissione viene misurata a 520 nm. Questa fluorescenza emissione aumenta legandosi Ca2 + , con un ampio range dinamico tra il Ca2 +-associati e non associati di stato. L'aumento del segnale fluorescente è transitoria, che si verificano entro un intervallo di tempo di pochi minuti e decadrà in seguito. L'altezza di picco dei correlati ulteriori emissione fluorescente con il livello di attivazione del recettore. Il dosaggio stesso viene eseguito utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenza dotato di una fotocamera CCD intensificato (ICCD) che possiede un sistema di pipettaggio integrato che permette la standardizzazione delle operazioni pipettaggio nell'analisi (Vedi Tabella materiali) . Inoltre, la misura simultanea del segnale fluorescente in tutti i pozzetti di una micropiastra è un altro vantaggio chiave del lettore di fluorescenza che viene utilizzato. Durante la prima parte del saggio i composti in esame (ad esempio, un pannello di piccole molecole ad una concentrazione fissa o in una serie di diluizioni) vengono aggiunti al fluo-2am caricato CXCR4+ U87 cellule seguirono da un ~ periodo di incubazione di 10 min durante il quale l'effetto potenziale agonistico dei composti è misurato continuamente in tempo reale. Quindi, l'agonista endogeno (cioè, CXCL12) viene aggiunto alle cellule per evocare un aumento transitorio CXCR4-mediata del livello di intracellulare di Ca2 +. Durante questa parte del test può essere valutato il potenziale attività antagonista dei composti testati. Una panoramica schematica del flusso di lavoro generale del dosaggio è presentata nella Figura 1.
Anche se questo test di mobilizzazione di Ca2 + è stato utilizzato principalmente per identificare e determinare la potenza inibitoria di antagonisti competitivi di CXCR4 (cioè, composti che impediscono l'agonista endogeno per legare e stimolare il recettore), esso anche agonisti del recettore in grado di identificare e, inoltre, i composti che esercitano la loro funzione legandosi a siti allosterici (cioè, siti che topograficamente differiscono dal sito di legame ortosterici occupato da agonista endogeno). Sono esempi di quest'ultima categoria di composti agonisti allosterici e PAMs e NAMs19,20. Considerando che gli antagonisti del recettore specifico, nonché NAMs sarebbe inibiscono la CXCL12-indotta di Ca2 + risposta, PAMs migliorerebbe questa risposta (veda inoltre la discussione sezione). Anche se il dosaggio descritto nel presente documento in particolare obiettivi CXCR4, si prevede che questo metodo può essere applicato a altri GPCR con sforzo minimo ottimizzazione, almeno se segnalano tramite il rilascio di Ca intracellulare2 +.
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Protocol
Nota: Tutti i passaggi descritti nelle sezioni 1 e 2 sono effettuati in condizioni di sterilità in un flusso laminare.
1. manutenzione di U87. Cellule CD4.hCXCR4
- Crescere le cellule in matracci di cultura T75 a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.
Nota: La varietà di cellula in vitro utilizzati in questo protocollo è una linea cellulare di glioblastoma U87 che esprimono stabilmente cluster di differenziazione 4 (CD4) e umani CXCR4 ed è stato descritto in precedenza17. Espressione di superficie delle cellule di CD4 e CXCR4 è continuamente monitorata tramite flusso cytometry e livelli di espressione restano costanti nel tempo (~ 100% CD4+ e ~ 100% CXCR4+ cellule). Una descrizione dettagliata della generazione della linea cellulare usato e la procedura di citometria a flusso per indagare i livelli di espressione del recettore non è nell'ambito del presente protocollo.- Cellule di sottocultura al confluency di 80-85%. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (RT) prima di coltura delle cellule.
- Rimuovere il medium di coltura condizionato dalle cellule e lavare il monostrato cellulare una volta con salino di 5 mL tamponato fosfato (PBS).
- Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA 0.25% e distribuirlo uniformemente sopra strato monomolecolare della cellula. Quindi rimuovere l'eccesso di tripsina-EDTA e incubare fino a 5 min a 37 ° C fino a quando le cellule cominciano a staccare.
- Aggiungere 10 mL di coltura fresca completa (di Dulbecco Medium (DMEM dell'Aquila per volta) + 10% siero bovino fetale (FBS) + 0,01 M HEPES + agenti di selezione appropriata). Risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 50 mL.
- Contare il numero di cellule vitali utilizzando un metodo di scelta. Nel caso di cellule di glioblastoma U87, redditività generalmente raggiunge ~ 100%.
Nota: I numeri delle cellule possono essere determinati in diversi modi. Utilizziamo abitualmente un sistema di analisi delle cellule automatizzato basato su trypan blu colorazione (Vedi Tabella materiali) secondo lo standard di gestione delle procedure, ma altre maniere dovrebbe funzionare altrettanto bene. - Aggiungere 2 x 106 o 3 x 106 cellule (vitali) ad un volume finale di 25 mL di terreno di crescita fresco in un matraccio di cultura T75 e incubare a 37 ° C e 5% CO2.
Nota: Se vengono utilizzate 3 x 106 cellule le cellule raggiungerà confluency di 80-90% dopo 2 giorni. Se vengono utilizzate 2 x 106 cellule, raggiungeranno la confluenza stessa dopo 3 giorni. Il tasso di crescita delle cellule in primo luogo dovrebbe essere determinato empiricamente se vengono utilizzate altre linee cellulari.
2. semina delle cellule per il dosaggio di mobilizzazione di Ca2 +
- Al giorno del passaggio (giorno 0), cappotto nero-murato polistirolo piastre da 96 pozzetti con clear cella inferiore (Vedi Tabella materiali) con una soluzione di gelatina di 0,1% per facilitare il collegamento delle cellule.
Nota: Rivestimento delle piastre a 96 pozzetti con gelatina potrebbe essere omessa se vengono utilizzate piastre prepatinati, che sono disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali). Si consiglia di valutare l'uso di piastre prepatinati invece di rivestimento manuale per ogni linea cellulare sotto inchiesta prima di continuare con il protocollo.- Preparare la soluzione di gelatina aggiungendo 1 g di gelatina per 100 mL di PBS per ottenere una soluzione di 1%. Diluire 10 volte con PBS prima dell'ulteriore uso. Per migliorare la solubilità di gelatina, riscaldare la soluzione a 37 ° C.
- Aggiungere 100 µ l di soluzione di gelatina di 0,1% per pozzetto della piastra 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare per 2 ore a RT.
- Nel frattempo, preparare le celle per la semina della piastra 96 pozzetti rivestiti.
- Staccare le cellule nel matraccio di cultura, li risospendere in terreno di coltura fresco e contarli utilizzando il metodo di colorazione blu di trypan.
- Rotazione verso il basso le cellule in una provetta da 50 mL per 5 min a 400 x g a TA.
- Risospendere le cellule in terreno di coltura fresco (DMEM 10% FBS + 1% HEPES, senza antibiotici) per ottenere una densità cellulare di 0.1 x 106 (vitali) cellule/mL.
- Rimuovere la soluzione di gelatina delle placche con pareti nero con fondo chiaro da lanciare sopra la piastra e asciugarlo su un tessuto. Aggiungere 200 µ l/pozzetto PBS per rimuovere l'eccesso gelatina e capovolgere nuovamente la piastra.
- Dispensare 200 µ l di sospensione cellulare (corrispondente a 0.2 x 105 celle) per pozzetto della piastra 96 pozzetti rivestite con gelatina (da ora uno questa piastra verrà essere denominato la "piastra di misurazione").
- Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.
3. caricamento delle cellule con una fluorescente Ca2 + -colorante sensibile
- Al giorno 1 eseguire l'effettivo Ca2 + mobilizzazione analisi, a partire con caricamento delle cellule seminate con il fluorescente Ca2 +-associazione tintura fluo-2 AM.
- Preparare il tampone aggiungendo 40 mL HEPES (1 M) di soluzione salina bilanciata di Hank 200ml (HBSS, 10x, nessun rosso di fenolo, non bicarbonato di sodio). Aggiungere acqua ultrapura per ottenere un volume finale di 2 L e aggiungere 4G albumina di siero bovino (BSA). Sciogliere la BSA tramite agitazione magnetica. Regolare il pH a 7.4 (con NaOH) e filtrare la soluzione.
Nota: Durante tutti i passaggi seguenti viene utilizzato lo stesso buffer, indicato come "tampone". - Preparare una soluzione stock (4 mM di solfossido dimetilico (DMSO)) di fluorescente Ca2 +-sensibile tingere fluo-2 AM. Evitare un'eccessiva esposizione alla luce. Sciogliere 1 mg fluo-2 AM (peso molecolare: 1.061 g/mol) in 235.6 µ l DMSO.
- Preparare una soluzione di lavoro di fluo-2 AM. Per una piastra a 96 pozzetti saggio mescolare 12,5 µ l della soluzione di riserva di fluo-2 AM (4 mM) e 12,5 µ l tensioattivo non ionico poliolo (ad es., f-127 pluronic) soluzione (20% peso/volume in DMSO, Vedi Tabella materiali). Aggiungere 22 µ l di questa miscela al tampone del saggio di 11 mL in una provetta da 15 mL. La concentrazione finale di fluo-2 AM è 4 µM.
Nota: Il tensioattivo non ionico è usato come agente di dispersione per migliorare la solubilità acquosa di fluo-2 AM e, di conseguenza, per migliorare il caricamento delle cellule. Per solubilizzare tensioattivo in DMSO, riscaldare il campione a 37 ° C e mescolare regolarmente fino a ottenere una soluzione omogenea. - Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule precedentemente seminate nella piastra 96 pozzetti misura da lanciare sopra la piastra e asciugare su carta assorbente.
- Aggiungere 100 µ l di soluzione colorante per pozzetto usando una pipetta multicanale di caricamento e incubare per 45 min a RT nel buio.
- Preparare il tampone aggiungendo 40 mL HEPES (1 M) di soluzione salina bilanciata di Hank 200ml (HBSS, 10x, nessun rosso di fenolo, non bicarbonato di sodio). Aggiungere acqua ultrapura per ottenere un volume finale di 2 L e aggiungere 4G albumina di siero bovino (BSA). Sciogliere la BSA tramite agitazione magnetica. Regolare il pH a 7.4 (con NaOH) e filtrare la soluzione.
4. preparazione del polipropilene di 96 pozzetti piastre contenenti il ligando chemochina CXCL12 o i composti sotto inchiesta
- Ottenere le piastre da 96 pozzetti fondo tondo in polipropilene (PP) (Vedi Tabella materiali).
- Consentire la soluzione di riserva di CXCL12 (1 mg/mL) e la soluzione di riserva dei composti in esame per equilibrare a TA.
Nota: La soluzione madre di CXCL12 è preparata in acqua ultrapura completati con 0,01% Tween20 e conservati a-20 ° C come le aliquote monouso. - Preparare una soluzione concentrata di CXCL12 nel tampone di 5x (250 ng/mL che è uguale a 31,25 nM) e un 5 x diluizione concentrato di ogni composto (in tampone del saggio).
- Dispensare le soluzioni stock nella piastra a 96 pozzetti appropriata secondo un layout predefiniti piastra. Pipettare 75 µ l/pozzetto nella piastra che contiene CXCL12 (la "piastra di chemokine"), dispensare 50 µ l/pozzetto nella piastra che contiene i composti (il "piatto composto").
Nota: Entrambi composti e CXCL12 diventerà finalmente diluito 5 x al momento di erogazione nella piastra di misurazione. Inoltre è importante includere i pozzetti di controllo negativo contenente solo tampone del saggio in entrambi il piatto composto come pure la piastra di chemokine. Anche pozzetti di controllo positivo devono essere inclusi (cioè, pozzetti con CXCL12 nella piastra di chemokine, ma con tampone in rispettivi pozzetti della piastra composto).
- Consentire la soluzione di riserva di CXCL12 (1 mg/mL) e la soluzione di riserva dei composti in esame per equilibrare a TA.
5. protocollo impostazioni il lettore di micropiastre di fluorescenza
Nota: Il lettore di micropiastre fluorescenza utilizzato nel presente protocollo viene definito nella Tabella materiali.
- Accendere il refrigeratore del lettore della piastra di fluorescenza e poi accendere il lettore di fluorescenza stesso. Lasciate avviare per pochi minuti e aprire il software del sistema.
- Creare il protocollo del dosaggio usando il menu di drag-and-drop che include i seguenti passaggi:
- Nella finestra "Impostazioni", selezionare 'Read_Mode' con lunghezza d'onda di eccitazione: 470-495 nM; lunghezza d'onda di emissione: 515-575 nM.
Nota: Le lunghezze d'onda selezionate sono idonee all'uso con il Ca2 +-sensibili colorante fluo2. - Includere la casella "Mix con TF" (fluido termovettore) per miscelazione automatica dei composti nel piatto composto, che sarà messo nella posizione di origine 2 del dispositivo (Vedi punto 6.4). Selezionare 15 µ l di soluzione in ciascun pozzetto automaticamente essere aspirato e misto tre volte. Regolare l'altezza delle punte di pipetta a 20 µ l sotto la superficie del liquido. Impostare la velocità di aspirazione e di erogazione a 50 µ l/s.
Nota: L'altezza delle punte di pipetta si riferisce al volume che è rimasto sotto le punte di pipetta. Per esempio, se i pozzetti di una piastra composto contengono 50 µ l, un'altezza di 30 µ l corrisponde a 20 µ l sotto la superficie del liquido. Il volume del composto soluzione adottate per mescolare, la velocità di miscelazione, la posizione della pipetta consigli durante la miscelazione, e il numero di cicli di miscelazione possa essere registrato utilizzando il software. - Nella finestra di "Trasferimento fluido", definire quel 20 µ l di ogni bene dal piatto composto sarà trasferito nella piastra di misurazione. Posizionare i puntali a 20 µ l sotto il liquido in superficie cioè, presso altezza 30 µ l durante l'aspirazione dei composti e altezza 60 µ l durante l'erogazione della piastra di misurazione. Impostare la velocità di aspirazione a 50 µ l/s e la velocità di erogazione 25 µ l/s.
Nota: La piastra composta contiene 50 µ l di soluzione per pozzetto (Vedi punto 4.1.3), così un'altezza di 30 µ l corrisponde a una posizione 20 µ l sotto la superficie del liquido. La piastra di misurazione conterrà 80 µ l di tampone di dosaggio per pozzetto (Vedi punto 6.3), un'altezza di 60 µ l corrisponde dunque ad una simile posizione delle punte. - Selezionare il pulsante "Lettura con TF". Durante il primo intervallo, selezionare 60 letture (fluorescente misure) con un tempo di intervallo di lettura di 1 s. Definisci che 10 letture vengono registrate prima dell'erogazione dei composti nella piastra di misurazione e 50 legge in seguito. Definire l'intervallo di secondi con una lettura intervallo di tempo di 30 s e 18 letture.
Nota: Durante questa fase fluorescenza si misurerà cineticamente (a intervalli di tempo definiti) per ~ 10 min in totale. - Includere il pulsante "Wash consigli" nel protocollo tre volte. All'interno di ogni fase di lavaggio, selezionare il tipo di fluido: fluido (acqua ultrapura) o fluido B (70% di etanolo), il numero di cicli di lavaggio (1), la pompa di velocità (veloce), e lavare il numero dei colpi (5) durante ogni passaggio.
Nota: Durante il primo e l'ultimo lavaggio passaggio fluido è utilizzato A, durante il secondo fluido di passaggio lavaggio che b viene utilizzato. - Includono la funzione "Pausa pipettatore". Impostare il pipettatore per mettere in pausa per 300 s.
Nota: Inserendo questo passaggio nel protocollo, la testa del pipettatore, che è integrata nel dispositivo di lettore di piastra di fluorescenza, verrà sospesa per 5 min prima di continuare il protocollo. - Includere la casella "Mix con TF" per consentire la miscelazione automatica della soluzione CXCL12 nella piastra di chemochine, che verrà posizionata nella posizione di origine 3 del dispositivo (Vedi punto 6.4). Selezionare 15 µ l di soluzione in ciascun pozzetto automaticamente essere aspirato e misto tre volte. Durante l'aspirazione e la miscelazione, posizionare i puntali di pipetta 20 µ l sotto la superficie del liquido. La velocità di aspirazione e di erogazione è impostata a 50 µ l/s.
Nota: Simile per quanto riguarda il punto 5.2.2, questi parametri possono essere regolati. - Nella finestra di dialogo successiva "Trasferimento fluido", definire quel 25 µ l di ogni bene di chemochina piastra sarà trasferito nella piastra di misurazione. Posizione suggerimenti 20 µ l sotto il liquido in superficie cioèa altezza 55 µ l durante l'aspirazione dalla piastra di chemokine che contiene 75 µ l/pozzetto (Vedi punto 4.1.3) e all'altezza 80 µ l durante l'erogazione della piastra di misurazione. Impostare la velocità di aspirazione a 50 µ l/s e la velocità di erogazione 25 µ l/s.
- Includere il pulsante "Lettura con TF". Durante il primo intervallo, selezionare 145 letture con un tempo di intervallo di lettura di 1 s. Definisci che 5 letture vengono registrate prima di erogare CXCL12 nella piastra di misurazione e 140 legge in seguito. Definire l'intervallo di secondi con una lettura intervallo di tempo di 6 secondi e poi selezionare 20 letture.
Nota: Presi insieme, in tutta l'intero protocollo 243 letture (fluorescente misure) vengono registrate: 78 al punto 5.2.4 e 165 durante passaggio 5.2.9. - Simile al punto 5.2.5, includere il pulsante "Lavare suggerimenti" tre volte nel protocollo.
Nota: Tra cui questo passaggio alla fine del protocollo permette che le punte sono ri-utilizzabili per eseguire un altro test senza dover modificare i suggerimenti.
- Nella finestra "Impostazioni", selezionare 'Read_Mode' con lunghezza d'onda di eccitazione: 470-495 nM; lunghezza d'onda di emissione: 515-575 nM.
- Impostare la temperatura del dispositivo a 37 ° C facendo clic sul pulsante "Set temperatura fase" e selezionando il 37 ° C.
6. eseguire l'analisi di fluorescenza
- Dopo la misurazione piastra ha incubato con buffer per 45 min di carico (Vedi punto 3.1.5), rimuovere il buffer da lanciare sopra la piastra e asciugarlo su un tessuto.
- Lavare le cellule seminate con l'aggiunta di 150 µ l/pozzetto di tampone del saggio e incubare per 2 min.
- Rimuovere di nuovo il buffer da lanciare sopra la piastra. Aggiungere 80 µ l/pozzetto di tampone con una pipetta multicanale.
- Inserirlo nel dispositivo al loro posizione appropriata di tutti i piatti: il piatto composto dalla posizione di origine 2, la piastra di chemokine dalla posizione di origine 3 e la piastra di misurazione presso la posizione di lettura. Mettere una scatola di punte nere nella posizione di suggerimenti di origine 1. Chiudi porta del dispositivo e incubare per 5 minuti prima di continuare il protocollo.
- Selezionare il pulsante "Protocollo segnale test" per determinare l'unità di luce relativa (RLU) di sfondo e la varianza di fluorescenza sopra la piastra. Una nuova finestra pop-up. Selezionare "Segnale di prova".
Nota: Durante questa fase, sfondo RLU sono determinati dalla telecamera ICCD, che è integrata nel comparto del dispositivo lettore fluorescenza ottica. Questi RLU derivare dall'eccitazione del Ca2 +-sensibili dye (fluo-2) da diodi luminosi (LED) (LED lunghezza d'onda di uscita 470-495 nm). Valori di 8.000-10.000 RLU sono adatti per questa applicazione. RLU può, se necessario, essere adattato modificando l'intensità di eccitazione (selezionare escl. intensità), o il cancello di fotocamera (selezionare cancello aperto). La varianza sopra la piastra dovrebbe idealmente essere inferiore al 7,5%. - Selezionare "Aggiorna" Se si ottengono valori di fondo di 8.000-10.000 RLU. Salvare il protocollo principale facendo clic sul pulsante Salva.
Nota: In questo modo, le impostazioni del test di segnale di protocollo si svolgerà al protocollo principale. - Eseguire il test premendo il pulsante "Esegui".
7. dati analisi e qualità
- Una volta terminata l'analisi, è possibile aprire la casella di "Analisi" nel software del sistema.
- Vai a "configurare le correzioni" e scegli "risposta sulla linea di base". Definire la linea di base 1 per iniziare a misura 1 e fine alle misura 5; verrà calcolata la media di fluorescenza in ciascun pozzetto tra misura 1 e 5.
Nota: Tutte le misurazioni da un particolare bene sono divisi da questa linea di base ben specifiche 1.- Definire la linea di base 2 per iniziare a misura 78 fino alla misura 83 (CXCL12 viene erogata dopo misura 83; nuovamente la media di fluorescenza è calcolata in ogni bene tra fattore di correzione della misura 78 e 83 e questo viene applicato a tutte le misurazioni seguendo misura 83).
- Attivare la casella di spunta "Mostra come percentuale" e "sottrarre sfondo".
- Vai a "Configurare la riduzione del cinetica". Per valutare l'effetto inibitorio dei composti sulla risposta indotta da CXCL12 Ca2 + , scegliere Max-Min a partire dalla misura 84 (vale a dire, la prima misura dopo il quale viene erogata CXCL12) a 243 (cioè, la misura finale).
Nota: Scegliendo Max-Min la differenza tra la risposta minima e massima rispetto al basale tra misura 84 e misura 243 è segnalato. Se il Max-Min è scelto a partire tra misura 11 e misura 78, la differenza tra la risposta minima e massima rispetto al basale rispetto al basale 1 è segnalata. Questo valore può essere utilizzato per analizzare il potenziale attività agonistica dei composti, Vedi discussione). - I dati verranno visualizzati nel software del sistema. Se necessario, è possibile esportare i dati grezzi per ulteriore analisi e la visualizzazione in altri comuni pacchetti software di analisi.
- Vai a "configurare le correzioni" e scegli "risposta sulla linea di base". Definire la linea di base 1 per iniziare a misura 1 e fine alle misura 5; verrà calcolata la media di fluorescenza in ciascun pozzetto tra misura 1 e 5.
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Representative Results
L'effetto della stimolazione CXCL12 con la mobilizzazione intracellulare di Ca2 + nel U87. CD4.CXCR4+ e U87. Cellule CD4 è stata valutata con il test di mobilizzazione di Ca2 + . Invece di 20 µ l del composto in esame che normalmente verrebbero aggiunti durante il primo passaggio di pipettaggio del protocollo (Figura 1), il tampone del saggio è stato aggiunto al fluo-2am caricato U87. CD4.CXCR4+ cellule nella piastra di misurazione. Durante la seconda fase di erogazione, le concentrazioni differenti di CXCL12 (0.2-102.4 nM, concentrazione finale) erano dispensati nella piastra di misurazione. È dimostrato un aumento dose-dipendente in fluorescenza, che correla con un aumento dose-dipendente del rilascio di Ca2 +, (Figura 2A). Qui, il campione di controllo negativo rappresenta quei pozzi in cui alle entrambe aggiunte solo tampone del saggio è stato aggiunto alla piastra di misurazione (vale a dire, 0 nM CXCL12), con conseguente assenza di una risposta (Figura 2A). Gli importi aumentanti di CXCL12 inducono aumento dei livelli di fluorescenza che decadono nel corso del tempo (Figura 2A). Da questi dati, una curva dose-risposta è stata generata sulla base della "risposta Max-Min rispetto al basale" tra misura 84 (vale a dire, la prima misura dopo l'aggiunta di CXCL12) e misura 243 (cioè., la misura finale nel protocollo ). Facendo uso di regressione non lineare, il valore di50 CE (cioè, la concentrazione necessaria per evocare la risposta massima mezza) è stato determinato e corrisponde alla 1.14 nM (Figura 2B). No fluorescente Ca2 +-relative di risposta è stato evocato da CXCL12, anche ad alta concentrazione (102.4 nM), quando U87. Le cellule CD4 che mancano di espressione di CXCR4 funzionale sono state usate. Questo dimostra la specificità del recettore della misurazione evocata da CXCL12 (Figura 2).
Una chiave di applicazione per questo test basati su cellule è l'identificazione di piccole molecole specificamente destinati CXCR4 e in grado di inibire la mobilizzazione indotta da CXCL12 Ca2 + . Se vengono identificati composti attivi ("hits"), può essere ulteriormente caratterizzati test diluizioni seriali del composto e analizzando la potenza inibitoria più dettagliatamente. Ad esempio, l'effetto di bicyclam AMD3100, un antagonista del recettore CXCR4-specifiche di consolidata piccola molecola con potente attività anti-HIV-121,22, è illustrato nella Figura 3. Una serie di concentrazioni di AMD3100 (n = 4, 3 µM fino a concentrazione finale di 1,37 nM in una serie di diluizione di 1/3) è stato erogato il U87. CD4.CXCR4+ cellule durante la prima fase del protocollo. Il composto è stato poi permesso di incubare con le cellule per ~ 10 minuti durante il quale il segnale di fluorescenza è stato registrato continuamente. Quindi 6,4 nM di CXCL12 (50 ng/mL, concentrazione finale) è stato aggiunto a tutti i pozzetti della piastra cellulare simultaneamente per indurre la mobilizzazione di CXCR4-mediated Ca2 + . Inibizione dose-dipendente di questa risposta per le diluizioni diverse di AMD3100 è mostrato in Figura 3A. In questo caso, solo la parte del grafico dopo aggiunta di CXCL12 è mostrata. Come un unico buffer di controllo negativo (linea blu) è stato applicato nell'analisi (nessun pre-incubazione con AMD3100, nessun CXCL12 aggiunti ai pozzetti), con conseguente mancanza di risposta prevista. Il controllo positivo (linea rossa) corrisponde ai campioni nella quale 6.4 nM CXCL12 è stato aggiunto ai pozzi senza previa incubazione di AMD3100 (Figura 3A). Sulla base di questi definita positiva e negativa controlla la Z' valore in questo dosaggio è in genere compreso tra 0,5 e 1. Al fine di determinare la potenza inibitoria di AMD3100 una curva dose-risposta è stata generata da regressione non lineare risultante in un valore di50 IC calcolato di 770.8 nM (Figura 3B). Per illustrare ulteriormente il comportamento di un composto non attivi, maraviroc è stato incluso in questo esperimento. Maraviroc è una piccola molecola specificamente inibendo il recettore di chemochine CC 5 (CCR5) bloccando così (CCR5)-tropic HIV-1 infezione23 . Anche ad alta concentrazione (concentrazione finale di 10 µM) è stato osservato nessun effetto inibitorio di questo composto sulla risposta CXCR4-mediated Ca2 + (Figura 3A).
Infine, per dimostrare che questo test di mobilizzazione di Ca2 + può essere applicato anche per studiare altri GPCR, diluizioni seriali del ligando chemochine CC 5 (CCL5), il ligando endogeno per CCR5, è stata aggiunta alle cellule che esprimono CCR5 (U87. CD4.CCR5+) usando esattamente le stesse condizioni sperimentali e le impostazioni hardware. Una dose-dipendente fluorescente Ca2 + risposta è dimostrata dopo l'aggiunta di una diluizione seriale di CCL5 (Figura 3). In aggiunta e in contrasto con il suo effetto su CXCR4, pre-incubazione con 100 nM (concentrazione finale) di maraviroc fortemente inibito questa risposta (Figura 3D).
Figura 1: schema di flusso di lavoro del dosaggio. Giorno 0 cellule esprimendo i GPCR di interesse (in questo caso CXCR4) sono seminati in parete nero piastre da 96 pozzetti con fondo chiaro e sono cresciuto durante la notte a 37 ° C e 5% CO2. Giorno 1 il Ca2 + test di fluorescenza-basata viene fatto. Le cellule vengono prima caricate con fluorescente Ca2 +-sensibili colorante (fluo-2am) e incubate per 45 min a RT nel buio. "Un chemokine piastra" e "composti" sono preparati (PP = polipropilene). Dopo incubazione con tintura di caricamento, seminate cellule vengono lavate una volta con tampone del saggio (150 µ l/pozzetto) dopo il quale viene aggiunto 80 µ l/pozzetto di tampone del saggio. Tutte le piastre vengono incubate per 5 min nel dispositivo a 37 ° C prima di iniziare l'analisi. Quindi, composti di interesse (ad esempio, piccole molecole) sono dispensati alla concentrazione desiderata nei pozzetti della piastra di misurazione e lasciate Incubare per ~ 10 min mentre la fluorescenza è misurata continuamente. Successivamente, una concentrazione fissa di agonista endogeno dei GPCR (qui CXCL12) viene aggiunto per evocare il rilascio di Ca2 + e fluorescenza ulteriormente è registrato nel corso del tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Attività dell'agonista di CXCL12 il CXCR4+ le cellule e la specificità della risposta rilevata. (A) l'effetto dose-dipendente di CXCL12 sulla mobilizzazione di Ca2 + nel U87. Cellule CD4.CXCR4+ . (B) basato sulla risposta Max-Min rispetto al basale tra misura 84 e 243 una curva dose-risposta è stata generata e il valore di50 CE calcolato (n = 4, media ± DS). (C) nessuna risposta è stata indotta da CXCL12, quando esso è stato erogato il U87. Cellule CD4 che mancano di CXCR4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Illustrazione dell'effetto di un antagonista CXCR4 (AMD3100) e un composto non attivi (maraviroc) il CXCR4+ cellule e l'attivazione di CCR5 di suo agonista endogeno, CCL5. (A) Dose-dipendente effetto inibitorio di AMD3100 sulla mobilizzazione di Ca2 + evocata aggiungendo 6.4 nM CXCL12 a U87. Cellule CD4.CXCR4+ . Maraviroc (alla concentrazione finale di 10 µM) ha mostrato alcun effetto inibitorio sulla risposta indotta da CXCL12 Ca2 + . (B) basato sulla risposta Max-Min rispetto al basale tra misura 84 e 243, una curva dose-risposta inibitoria è stata generata e il valore di IC50 è stato calcolato per essere 770.8 nM (n = 4, media ± DS). (C) Dose-dipendente l'attivazione del CCR5 di suo agonista endogeno, CCL5. (D) l'inibizione della risposta2 + Ca CCR5-mediata di pre-incubazione delle cellule con 100 nM di maraviroc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il Ca2 +-saggio di mobilitazione qui descritto precedentemente è stato indicato per essere un valido strumento per identificare e caratterizzare antagonisti del recettore CXCR417di targeting. Si prevede, tuttavia, che questo metodo può essere applicato più generalmente a un folto gruppo di altri GPCR che innescano un Ca2 + rilascio citosolico al momento della loro attivazione, come illustrato per il ricevitore di chemokine correlate CCR5. Considerando che nel caso di CCR5 potrebbero essere applicate esattamente le stesse condizioni sperimentali, diversi passaggi nel protocollo (ad esempio, il numero di cellulare alla placcatura, caricamento delle cellule con una tintura fluorescente) dovrà essere ri-ottimizzato prima di trasferire il saggio a altri GPCR al fine di ottenere un favorevole rapporto segnale-rumore. Un tema importante qui è anche la selezione di un adatto in vitro cellular host permettendo ad alto livello espressione dei GPCR di interesse e accoppiamento funzionale per la via di Ca2 + . In caso di CXCR4, cellule di glioblastoma umano U87 furono scelti a causa di: (1) la mancanza di espressione endogena di CXCR7 (un recettore di chemochine correlate che occupa la stessa agonista come CXCR4), (2) la loro capacità di coppia CXCR4 attivazione per il Ca2 +-segnalazione percorso, (3) la gamma dinamica favorevole della risposta fluorescente ottenuta dopo il caricamento delle cellule con il Ca2 +-colorante sensibile e (4) loro adesione eccellente a dosaggio piastre riducendo al minimo disturbo durante tutta la procedura della cellula. Tutti questi parametri potrebbe essere necessario essere determinati sperimentalmente per ogni romanzo GPCR di interesse e ogni sistema di espressione cellulare.
Quando si configura un dosaggio simile per un altro GPCR, diversi passaggi alternativi o reagenti nel protocollo possono essere considerati. Per esempio, altri Ca2 +-fluorofori sensibili (ad es., fluo-4, fluo-3) potrebbero essere usato come alternativa per il fluoroforo (fluo-2) utilizzata nel presente protocollo. In caso di cellule senza bloccare aderente, lavaggio delle cellule potrebbero essere omesso introducendo coloranti no-lavaggio per ridurre al minimo cella sloggiare24. Inoltre, escludendo la fase di lavaggio dal protocollo sarebbe aumentare ulteriormente la velocità effettiva del dosaggio. Anche se questo test potrebbe essere eseguito anche con cellule che mostrano espressione endogena di CXCR4, inclusi ad esempio diversi tipi di cancro umano delle cellule linee10,25, si deve osservare che con cellulari stabilmente trasfettate linee alto GPCR livelli di espressione che rimangono stabili nel tempo possono essere ottenuti. Questo si tradurrà in più pronunciato dosaggio misure, prestazioni su periodi più lunghi del test una finestra più grande per l'interpretazione di dati affidabili e coerente. Quando si utilizzano celle in modo endogeno esprimendo CXCR4 sarà molto più difficile raggiungere questo risultato.
Un grave inconveniente del test è che si basa su una misurazione della fluorescenza. Quindi, autofluorescent composti possono interferire con la misurazione del dosaggio, che li esclude dall'analisi a causa di interpretazione dei dati inaffidabili. Inoltre, questo test di mobilizzazione di Ca2 + idealmente viene eseguito utilizzando un cellulare sistema dotato di un sistema di pipettaggio integrato che consente la miscelazione standardizzato e la dispensazione dei composti e agonista del recettore nella piastra di misurazione in tutto di screening pozzetti contemporaneamente. L'analisi potrebbe, tuttavia, essere adattato per l'uso con altri, meno lettori di micropiastre costoso fluorescenza con capacità di misurazione cinetica. L'aggiunta di composti e agonista dovranno allora essere eseguite manualmente mediante pipette multicanale, che aumenteranno hands-on-time e abbassa la velocità effettiva del dosaggio. Inoltre, ottenere un numero simile di misure di fluorescenza all'interno di un determinato intervallo di tempo di un'analisi cinetica sarebbe difficile da realizzare come molti lettori di micropiastre misurano segnali ben-di-bene considerando che sistemi di screening high-end misurano tutti i pozzetti contemporaneamente.
Antagonisti dei recettori impedendo legame per il recettore e la successiva attivazione di agonista endogeno (CXCL12) attualmente formano la principale categoria di composti specificamente destinati CXCR411,12. AMD3100, la piccola molecola che è stata utilizzata per illustrare le prestazioni del Ca2 + mobilizzazione dosaggio, è uno dei più importanti esempi di CXCR4 antagonisti26. Oltre ad antagonisti dei recettori, molecole che regolano GPCR segnalazione diversamente sollevano interesse generale pure. Queste molecole sono agonisti inversi, come pure dei GPCR PAMs e NAMs19,20,27. Una caratteristica interessante del test descritto in questo manoscritto è che non solo può identificare antagonisti del recettore, ma anche agonisti e modulatori allosterici. Tuttavia, alcuni piccoli adattamenti per le analisi e le limitazioni devono essere presi in considerazione.
PAMs e NAMs si legano ai recettori topograficamente distinti da ortosterici associazione sito occupato dal ligando endogeno del recettore. Considerando che PAMs che permettono di migliorare la potenza e/o efficacia di ligandi endogeni del recettore, NAMs inibiscono la potenza e/o efficacia dei ligandi endogeni19,20. PAMs non hanno alcuna attività agonista intrinseca. Sono solo attivi in presenza dell'agonista endogeno, a differenza dei cosiddetti agonisti allosterici. Perché modulatori allosterici GPCR evocasse meno effetti collaterali rispetto classici antagonisti quando applicato in contesti clinici28,29, sono preziosi strumenti farmacologici. Nella nostra analisi, agonisti allosterici evocasse un aumento transitorio del segnale di fluorescenza immediatamente dopo l'aggiunta per il CXCR4+ cellule. Specificità del recettore di questo segnale quindi dovrebbe essere determinata testando lo stesso composto con la stessa analisi, ma le cellule che mancano di CXCR4. Quando in particolare screening per PAMs, una minore concentrazione di agonista endogeno dovrebbe utilizzabile nell'analisi per indurre una Ca2 + risposta fluorescente. Anche se questo importo inferiore di agonista genererà un segnale fluorescente inferiore, lascia una finestra più grande per rilevare la stimolazione del recettore aggiuntive. In genere, una concentrazione di agonista corrispondente al valore di30 CE10- CE di stimolazione del recettore è scelto30,31. Aggiunta di un PAM durante la prima parte del saggio non comporterebbe un'aumentata misure in fluorescenza. Tuttavia, il segnale fluorescente Ca2 + dopo stimolazione successiva del recettore con l'agonista endogeno aumenterebbe. Allo stesso modo, un NAM non altera la misura fluorescente prima dell'aggiunta di agonista, ma inibiscono la risposta del ricevitore dopo l'aggiunta dell'agonista. Quindi, il profilo di attività di un antagonista del recettore e un NAM sarà simile. Entrambi si tradurrà nell'inibizione della risposta fluorescente dopo aggiunta di agonista. Pertanto, sono necessari ulteriori studi sperimentali di discriminare tra un antagonista e un NAM. Qui, gli studi di associazione del ricevitore per cui senza etichetta composti competono con un importo fisso pari a etichettato CXCL12 per associazione a CXCR417,32 può essere una strategia importante per discriminare tra un antagonista, che impedirebbe la con l'etichetta agonista di legarsi al recettore e un NAM che sarebbe non come esso non condividere il sito di legame del recettore stesso.
Attività autonoma (o basale o costitutiva) ligando dei GPCR è stato osservato per numerosi GPCR33 anche se il livello di attività basale è generalmente piuttosto basso quando i GPCR sono espressi recombinantly27. Attività GPCR basale può essere migliorata da naturali mutazioni33 e una mutazione di punto che conduce a CXCR4 basale aumentata attività è stato descritto precedenti34. Da questo mutante costitutivamente attivo di CXCR4 di accoppiamento per la via di risposta di feromone in lievito e da esperimenti di binding GTPγS [35S], è stato dimostrato che T140, un antagonista di CXCR4 peptidici con potenti anti-HIV attività17,35 ha fatto diminuire significativamente questa attività basale e quindi è stata indicata a comportarsi come un agonista inverso34. Di nota, in una Fura-2 fluorescenza-Ca2 + mobilizzazione analisi basata gli stessi autori hanno osservato una piccola diminuzione transitoria in Ca2 +-correlata fluorescenza dopo aggiunta di T140 alle cellule che esprimono il mutante CXCR4, suggerendo una diminuzione di basale recettore attività34. Tuttavia, quando l'analisi di un ulteriore pannello di agonisti inversi CXCR4 ciclici pentapeptide-basato progettato da T140, rilevazione di ridotta attività basale con un'analisi di mobilizzazione di Ca2 + era meno semplice36. Quando l'effetto di T140 su cellule che esprimono il tipo selvaggio CXCR4 è stata analizzata utilizzando il test di mobilizzazione di Ca2 + , come descritto in questo manoscritto, nessun cambiamento nel segnale di fluorescenza basale è stato osservato17. Inoltre, le fluttuazioni di fluorescenza sono veloci e transitoria e aumenti in basale Ca2 + , per esempio, non si osservano in cellule che esprimono costitutivamente attiva Gαq-accoppiato i ricevitori4. Presi insieme, l'effetto degli agonisti inversi sarebbe molto difficile, se non impossibile identificare e valutare in modo affidabile con i nostri test.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Eric Fonteyn e Geert Schoofs per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da KU Leuven (grant no. PF/10/018), il Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, concedere no. G.485.08) e la Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
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