Summary
Den beskrevne cellulære assay er designet til identifikation af CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenter, der hæmmer eller stimulere enten konkurrencedygtige eller allosterically, den intracellulære Ca2 + release initieret af CXCR4 aktivering.
Abstract
G protein koblede receptorer (GPCRs) er af stor betydning for den farmaceutiske industri, som de er involveret i mange menneskelige sygdomme og omfatter godt validerede mål for terapeutisk intervention. Opdagelsen af blyforbindelser, herunder små syntetiske molekyler, der specifikt hæmmer den receptor funktion, er et vigtigt første skridt i udvikling af lægemidler og er afhængig af følsomme, specifikke og robust cellebaserede assays. Her, vi beskriver en kinetisk cellulære assay med en fluorescerende udlæsning primært designet til at identificere receptor-specifikke antagonister, der hæmmer den intracellulære Ca2 + release fremkaldt ved aktivering af CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) af sin endogene ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). En vigtig fordel ved denne metode er, at det også gør screening af forbindelser udrustet med iboende agonistiske egenskaber (dvs., forbindelser fremkalde en stigning i intracellulære Ca2 + koncentration i mangel af CXCL12) eller forbindelser modulerende receptor's funktion via interaktion med allosteriske bindingssteder (dvs., positive og negative allosteriske modulatorer (PAMs og NAMs, henholdsvis)). På den negative side, kan autofluorescent forbindelser interferere med assayets udlæsning, dermed hæmmer pålidelige data fortolkning. Mest sandsynligt kan dette assay gennemføres med minimale tilpasninger, som et generisk lægemiddel discovery assay for mange andre GPCRs, hvoraf aktivering fører til en frigivelse af intracellulære Ca2 +.
Introduction
GPCRs er en vigtig superfamilien af celle overflade proteiner, der aktiverer signaltransduktion kaskader af ekstracellulære ligand bindende. De kan aktiveres af en lang række stimuli herunder peptider, protein hormoner, biogene aminer og lipider, hvilket resulterer i indledningen af diverse intracellulær signalering veje og i sidste ende biologiske svar1,2 . Derudover GPCRs er involveret i mange, hvis ikke alle, udviklingsmæssige og fysiologiske processer og mange menneskelige sygdomme er forbundet med dysfunktionelle GPCR signalering eller receptor overekspression. GPCRs er derfor blandt de mest validerede farmakologiske mål i medicin1,3.
Typisk, en GPCR drug discovery arbejdsprocessen starter med cellulære screening-assays muliggør identificering af forbindelser som små molekyler, monoklonale antistoffer og peptider, der kan modulere aktiviteten af et bestemt GPCR. I GPCR drug discovery mange forskellige typer af assays findes for at søge efter sådanne forbindelser, er hvoraf de fleste kompatibel med midten af til high throughput screening kampagner. De mest anvendte assays omfatter receptor binding eksperimenter, fluorescens eller luminescence baseret assays afsløre udsving i niveauet af såkaldte sekundære budbringere (fx, Ca2 +, cyklisk adenosin fra (AMP)), fænotypisk screening-assays og β-arrestin ansættelse-undersøgelser vedrørende4. Valg for en bestemt type af analysen kan afhænge af flere faktorer, men også afhænger af forudgående viden om signaling egenskaberne af en given GPCR. Agonist binding til en GPCR inducerer en konformationel ændring katalysere udveksling af guanidin ud (BNP) for guanidin trifosfat (GTP) på α-subunit af heterotrimeric G proteiner. Efterfølgende Gα-GTP subunit dissocieres fra Gβγ subunit og begge underenheder vil indlede yderligere signaling veje. Hydrolyse af GTP-molekyle og efterfølgende re sammenslutning af Gα- BNP og Gβγ subunits vil gendanne G protein i sin inaktive kropsbygning5,6. Baseret på sekvensen ligheden af Gα -underenhed forskellige typer af G proteiner er defineret (Gs, Gjeg, Gq, G12/13)7. Signalering via Gα subunit giver anledning til flere typiske reaktioner såsom stigningen (via Gs) eller formindske (via G,jeg) af cykliske AMP produktion og intracellulære Ca2 + mobilisering (via Gq)5 ,7. Gβγ underenheder er også i stand til at fremkalde intracellulære effektor veje. For eksempel, ved aktivering af G,jeg-koblede GPCRs, Gβγ kan direkte stimulerer fosfolipase C (PLC-β) til at producere inositol trifosfat (IP3) der udløser frigivelsen af Ca2 + fra intracellulære butikker7 . Efter receptor aktivering, GPCRs er fosforyleret af GPCR kinaser (GRKs), som fremmer interaktion med β-arrestins. Denne proces afsluttes G protein signalering og fører til receptoren desensibilisering og til sidst internalisering. Β-arrestins er også i stand til at danne multi molekylære komplekser, der kan udløse andre signaling veje uafhængigt af G protein signalering8.
Inden for underfamilie af chemokine receptorer, Gjeg-koblede CXCR4 er en GPCR, der har rejst meget interesse som en lovende mål for drug discovery. Givet sin etablerede rolle som en større Co receptor for human immundefekt virus 1 (HIV-1) blev viral entry og infektion, forbindelser målretning CXCR4 oprindeligt udviklet som anti-HIV medicin kandidater9. For nylig, en voksende mængde af beviser har henvist til en vigtig rolle for CXCR4 i tumordannelse og kræft metastaser gør det et godt valideret terapeutiske mål inden for onkologi samt10. CXCR4 er stærkt udtrykt i mere end 20 typer af menneskelige kræft og kontrol tumor celle overlevelse, spredning, og migration og tumor-relaterede angiogenese10. CXCR4 antagonister af forskellige kemiske klasser tidligere har beskrevet11,12, men kun den lille molekyle AMD3100 er nu godkendt til brug i klinikken som en stamcelle mobilisering agent bruges under behandling af lymfom og myelomatose patienter13,14. Kliniske forsøg er løbende at vurdere sikkerheden og virkningen af flere andre CXCR4 antagonister i forskellige menneskelige sygdomme, men med et stærkt fokus på onkologi12. I betragtning af de mange potentielle anvendelser for CXCR4 antagonister, er søgen efter nye forbindelser med forbedret farmakokinetiske egenskaber, forbedret biotilgængelighed eller potentielt mindre bivirkninger berettiget.
Heri, en kinetisk fluorescens-baserede cellulære assay primært bruges til at screene for forbindelser i stand til at hæmme CXCR4 er beskrevet. Fluorescerende måling af denne metode er baseret på den forbigående stigning i den intracellulære Ca2 + koncentration fremkaldt ved CXCR4 aktivering af sin endogene agonist, chemokine ligand CXCL12 (tidligere kendt som stromale celle afledte faktor 1α ( SDF1-α)), og den potentielle hæmning af denne CXCL12-induceret Ca2 + svar af særlige forbindelser. I denne analyse anvendes U87 menneskelige glioblastom celler stabilt at udtrykke den menneskelige CXCR4 receptor. På samme tid mangler disse celler endogene udtryk for CXCR7, en relaterede chemokine receptor, som binder også CXCL1215,16,17. CXCR7 har tidligere også vist sig at være i stand til at danne heterodimers med CXCR4, hvorved modulerende signaling egenskaberne for denne sidstnævnte receptor18. Udsving i niveauet af intracellulære Ca2 + medieret af CXCR4 overvåges ved at indlæse CXCR4+ celler med fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, en celle-gennemtrængelige høj affinitet fluorescerende Ca2 +-bindende farvestof. Fluo-2 AM er et enkelt bølgelængde fluorescerende molekyle, der kan være glade på 490 nm mens dens emission Fluorescens er målt ved 520 nm. Denne emission fluorescens øger ved Ca2 + bindende, med et stort dynamikområde mellem Ca2 +-bundne og ubundne stat. Stigningen i fluorescerende signal er forbigående, forekommer med et interval på et par minutter, og vil henfalde bagefter. Tophøjde af fluorescerende emissioner yderligere korrelerer med niveau af receptor aktivering. Selve analysen udføres ved hjælp af et fluorescens mikrotiterplade læser udstyret med en intensiveret CCD (ICCD) kamera, der besidder en integreret pipettering system, der giver mulighed for standardisering af pipettering trin i analysen (jf. Tabel af materialer) . Derudover er samtidig måling af de fluorescerende signal i alle brønde på en mikrotiterplade en anden vigtig fordel af fluorescens-læseren, der bruges. Under først del af analysen forbindelser under undersøgelsen (fx, et panel af små molekyler på en fast koncentration eller i en fortyndingsrække) er tilføjet til fluo-2 AM indlæst CXCR4+ U87 celler efterfulgt af en ~ 10 min inkubationstiden hvor den potentielle agonistisk effekt af forbindelser måles kontinuerligt i realtid. Derefter, den endogene agonist (dvs.CXCL12) er føjet til cellerne til at fremmane en CXCR4-medieret forbigående stigning i niveauet af intracellulære Ca2 +. Under denne del af analysen kan den potentielle antagonistiske aktivitet af de testede forbindelser evalueres. En skematisk oversigt over analysens generelle arbejdsgang er præsenteret i figur 1.
Selv om denne Ca2 + mobilisering assay er primært blevet brugt til at identificere og bestemme den hæmmende styrken af konkurrencedygtige CXCR4 antagonister (dvs., forbindelser, der forhindrer den endogene agonist for at binde og stimulere receptor), det også kan identificere receptor agonister og derudover forbindelser at udøve deres funktion ved at binde på allosteriske websteder (dvs., websteder, der topografisk afviger fra det orthosteric bindingssted besat af den endogene agonist). Eksempler på den sidstnævnte kategori af forbindelser allosteriske agonister og PAMs og NAMs19,20. Mens receptor-specifikke antagonister samt NAMs ville hæmme CXCL12-induceret Ca2 + reaktionen, PAMs ville styrke dette svar (Se også diskussion sektion). Selvom analysen beskrevet heri specifikt mål CXCR4, det forventes, at denne metode kan anvendes på andre GPCRs med minimal optimering indsats, i det mindste hvis de signal via frigivelse af intracellulære Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alle trin beskrevet under afsnit 1 og 2 udføres under sterile forhold i en laminar flow kabinet.
1. vedligeholdelse af U87. CD4.hCXCR4 celler
- Vokse celler i T75 kultur kolber på 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
Bemærk: Den i vitro cellelinje bruges i denne protokol er en U87 glioblastom cellelinie stabilt udtrykker klynge af differentiering 4 (CD4) og menneskelige CXCR4 og har været tidligere beskrevet17. Celle overflade udtryk af CD4 og CXCR4 er løbende overvåges ved flowcytometri og udtryk niveauer forbliver konstante over tid (~ 100% CD4+ og ~ 100% CXCR4+ celler). En detaljeret beskrivelse af generation af linjen brugte celle og flow flowcytometri procedure at undersøge receptor udtryk niveauer er ikke omfattet af denne protokol.- Subkultur celler på 80-85% confluency. Tillad alle reagenser til nå stuetemperatur (RT) før celle dyrkning.
- Fjerne konditioneret næringssubstratet fra cellerne og vaske den celle éncellelag én gang med 5 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Tilføj 3 mL 0,25% trypsin-EDTA og distribuere det jævnt over celle éncellelag. Derefter fjerne overskydende af trypsin-EDTA og inkuberes op til 5 min ved 37 ° C, indtil cellerne begynde at frigøre.
- Der tilsættes 10 mL af frisk komplet vækstmediet (Dulbeccos modificerede Eagle's Medium (DMEM) + 10% føtal bovin Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + passende udvalg agenter). Resuspend cellerne af pipettering forsigtigt op og ned. Overføre cellesuspension til en steril 50 mL tube.
- Tæl antallet af levedygtige celler ved hjælp af en metode til valg. I tilfælde af U87 glioblastom celler, rentabilitet generelt når ~ 100%.
Bemærk: Celle tal kan beregnes på flere måder. Vi bruger rutinemæssigt en automatiseret celle analysesystem baseret på trypan blå farvning (Se Tabel af materialer) Ifølge dens standard håndtering procedurerne, men andre manerer bør arbejde lige så godt. - Tilføje 2 x 106 eller 3 x 106 (levedygtige) celler til en endelige mængden af 25 mL frisk vækstmedium i en T75 kultur kolbe og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Hvis 3 x 106 celler, der bruges af celler vil nå 80-90% confluency efter 2 dage. 2 x 106 celler anvendes, vil de nå de samme confluency efter 3 dage. Vækst af celler bør først fastlægges empirisk, hvis andre cellelinjer bruges.
2. såning af celler for Ca2 + mobilisering Assay
- På dagen for celle passaging (dag 0), frakke sort-walled polystyren 96-brønd plader med klart i bunden (Se Tabel af materialer) med en 0,1% gelatine løsning at lette celle vedhæftet fil.
Bemærk: Belægning af 96-brønd plader med gelatine kan udelades, hvis forhånd belagte plader, som er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer), der bruges. Det anbefales at evaluere brugen af præ-coatede plader i stedet for manuel belægning til hver cellelinje under undersøgelsen før du fortsætter med protokollen.- Forbered gelatine løsning ved at tilføje 1 g af gelatine til 100 mL PBS til at opnå en 1% opløsning. Fortyndes med 10 x med PBS før yderligere brug. For at forbedre opløseligheden af gelatine, varme løsning til 37 ° C.
- Tilsæt 100 µL af 0,1% gelatine løsning pr. brønd af 96-brønd plade ved hjælp af en multikanalpipette. Der inkuberes i 2 timer ved RT.
- I mellemtiden Forbered cellerne for såning i coated 96-brønd plade.
- Frigør cellerne fra kultur kolben, resuspend dem i frisk vækstmedium og tælle dem benytter trypan blå farvning metode.
- Spin ned celler i en 50 mL tube for 5 min på 400 x g på RT.
- Resuspend celler i frisk vækstmedium (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, ingen antibiotika) at opnå en celle tæthed af 0,1 x 106 (levedygtige) celler/mL.
- Fjerne gelatine løsning fra sort-walled plader med klare bund af flipping over pladen og tørre det på en væv. Tilføje 200 µL/brønd PBS til at fjerne overskydende gelatine og flip over pladen igen.
- Dispensere 200 µL af cellesuspension (svarende til 0,2 x 105 celler) pr. brønd i gelatine-belagt 96-brønd plade (fra nu man denne plade vil blive yderligere omtalt som "måling plade").
- Inkuber plade natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
3. ladning af celler med en fluorescerende Ca2 + -følsomme farvestof
- På dag 1 udføre den faktiske Ca2 + mobilisering assay, begyndende med indlæsning af de seedede celler med den fluorescerende Ca2 +-binding farvestof fluo-2 AM.
- Forbered analysebuffer ved at tilføje 40 mL HEPES (1 M) til 200 mL Hank afbalanceret saltopløsning (HBSS, 10 x, ingen phenol rød, ingen natriumbicarbonat). Der tilsættes ultrarent vand for at opnå en endelige mængden af 2 L og tilføje 4 g bovint serumalbumin (BSA). Opløse BSA via magnetiske omrøring. PH indstilles til 7.4 (med NaOH) og opløsningen filtreres.
Bemærk: Under alle følgende trin den samme buffer, omtales som "analysebuffer", der bruges. - Forberede en stamopløsning (4 mM i dimethylsulfoxid (DMSO)) af de fluorescerende Ca2 +-følsomme farvestof fluo-2 AM. Undgå overdreven udsættelse for lys. Opløs 1 mg fluo-2 AM (molekylvægt: 1,061 g/mol) i 235.6 µL DMSO.
- Forberede en brugsopløsning af fluo-2 AM. For en 96-brønd assay plade mix 12,5 µL af fluo-2 AM stamopløsning (4 mM) og 12,5 µL nonionisk overfladeaktivt polyol (f.eks., pluronic f-127) løsning (20% vægt/volumen i DMSO, se Tabel af materialer). Tilføje 22 µL af denne blanding til 11 mL analysebuffer i en 15 mL tube. Den endelige koncentration af fluo-2 AM er 4 µM.
Bemærk: Nonionisk overfladeaktivt stof bruges som en dispersion agent til at forbedre den vandig Opløselighed af fluo-2 AM og konsekvens, at øge celle lastning. For at solubilize overfladeaktive stof i DMSO, opvarmes prøven ved 37 ° C og mix regelmæssigt for at opnå en homogen opløsning. - Fjerne vækstmediet fra de tidligere seedede celler i 96-brønd måling plade af flipping over pladen og tørre det på et stykke køkkenrulle.
- Tilsæt 100 µL af lastning farvestof løsning pr. brønd ved hjælp af en multikanalpipette og Inkuber i 45 min. ved RT i mørke.
- Forbered analysebuffer ved at tilføje 40 mL HEPES (1 M) til 200 mL Hank afbalanceret saltopløsning (HBSS, 10 x, ingen phenol rød, ingen natriumbicarbonat). Der tilsættes ultrarent vand for at opnå en endelige mængden af 2 L og tilføje 4 g bovint serumalbumin (BSA). Opløse BSA via magnetiske omrøring. PH indstilles til 7.4 (med NaOH) og opløsningen filtreres.
4. forberedelse af 96-brønd polypropylen plader der indeholder Chemokine Ligand CXCL12 eller forbindelser under efterforskning
- Få rund bund polypropylen (PP) 96-brønd plader (Se Tabel af materialer).
- Tillad stamopløsningen af CXCL12 (1 mg/mL) og stamopløsningen af forbindelser under undersøgelsen til Reagensglasset på RT.
Bemærk: Stamopløsningen af CXCL12 er udarbejdet i ultrarent vand suppleret med 0,01% Tween20 og opbevares ved-20 ° C som engangsbrug delprøver. - Forbered en 5 x koncentreret opløsning af CXCL12 i analysebuffer (250 ng/mL, hvilket er lig med 31,25 nM) og en 5 x koncentreret fortynding af hvert stof (i analysebuffer).
- Undvære de stamopløsninger i passende 96-brønd pladen efter et foruddefineret plade layout. Dispensere 75 µL/hul i pladen som indeholder CXCL12 ("chemokine-plade"), dispensere 50 µL/hul i pladen som indeholder forbindelser ("sammensatte pladen").
Bemærk: Begge forbindelser og CXCL12 vil endelig blive fortyndet 5 x ved udlevering i måling plade. Det er også vigtigt at medtage negative kontrolhullerne indeholder kun analysebuffer i både den sammensatte plade samt chemokine plade. Positiv kontrol brønde skal også medtages (dvs., brønde med CXCL12 i chemokine plade, men med analysebuffer i de tilsvarende huller i den sammensatte pladen).
- Tillad stamopløsningen af CXCL12 (1 mg/mL) og stamopløsningen af forbindelser under undersøgelsen til Reagensglasset på RT.
5. protokollen indstillinger på fluorescens mikrotiterplade læser
Bemærk: Fluorescens mikrotiterplade læseren bruges i denne protokol er nævnt i Tabel af materialer.
- Tænd for sejere enheden af fluorescens-Pladelæser først, og derefter tænde fluorescens-læseren selv. Lad indlede i et par minutter og åbne systemets software.
- Oprette den assay protokollen ved hjælp af træk og slip menu, der omfatter følgende trin:
- I feltet "Indstillinger", Vælg 'Read_Mode' med excitation bølgelængde: 470-495 nM; emission bølgelængde: 515-575 nM.
Bemærk: De valgte bølgelængder er passende til brug med Ca2 +-følsomme farvestoffet fluo2. - Omfatter boksen "Mix med TF" (overførsel væske) for automatisk blanding af forbindelser i den sammensatte plade, der vil blive lagt på kilde 2 placeringen af enheden (Se trin 6.4). Vælg 15 µL af løsning i hvert hul til indsugning og blandet tre gange automatisk. Justere højden på pipette tips på 20 µL under flydende overfladen. Indstille hastigheden for aspiration og udlevering på 50 µL/s.
Bemærk: Højden af pipette tips refererer til den diskenhed, der er efterladt nedenunder pipette tips. For eksempel, hvis wells af en sammensat plade indeholde 50 µL, svarer en højde på 30 µL til 20 µL under flydende overfladen. Volumen af sammensatte løsning taget til at blande, hastigheden af blanding, placeringen af pipetten tips under blanding, og antallet af blande cykler kan alle justeres ved hjælp af softwaren. - I boksen "Overføre væske" definere den 20 µL af hver godt fra den sammensatte plade vil blive overført til måling plade. Placer pipette tips på 20 µL nedenfor væskens overflade dvs, på højden 30 µL under aspiration af forbindelser og højde 60 µL under udlevering i måling plade. Indstillet af aspiration på 50 µL/s hastighed og hastigheden af udlevering på 25 µL/s.
Bemærk: Sammensatte pladen indeholder 50 µL opløsning pr. brønd (Se trin 4.1.3), dermed en højde på 30 µL svarer til en position 20 µL under flydende overfladen. Måling plade vil indeholde 80 µL af analysebuffer pr. brønd (Se trin 6.3), dermed en højde på 60 µL svarer til en tilsvarende stilling af tips. - Vælg knappen "Læs med TF". Under det første interval, skal du vælge 60 læser (fluorescerende målinger) med et Læs tidsinterval af 1 s. Definer, der 10 lyder registreres før udlevering af forbindelser til måling plade, og 50 lyder bagefter. Definere den anden interval med en Læs tidsinterval på 30 s og 18 læser.
Bemærk: Under dette trin fluorescens måles kinetically (på de fastlagte tidsintervaller) for ~ 10 min i alt. - Omfatte "Vask Tips"-knappen i protokollen tre gange. Inden for hver vask trin, skal du vælge typen væske: væske en (ultrarent vand) eller væske B (70% ethanol), antallet af vaske cykler (1), pumpen speed (hurtigt), og antallet af slag (5) under hver vaske trin.
Bemærk: I løbet af først og sidste vask trin væske A er brugt, under den anden wash skridt væske B anvendes. - Omfatte funktionen "Pause pipette". Indstille pipette til pause for 300 s.
Bemærk: Ved at medtage dette trin i protokollen, pipette hoved, som er integreret i fluorescens plade reader enhed, vil pause for 5 min før du fortsætter til protokollen. - Omfatter boksen "Mix med TF" for at give mulighed for automatisk blanding af CXCL12 opløsning i chemokine plade, der vil blive placeret på kilde 3 placeringen af enheden (Se trin 6.4). Vælg 15 µL af løsning i hvert hul til indsugning og blandet tre gange automatisk. Under aspiration og blande, Placer pipette tips 20 µL under flydende overfladen. Hastigheden af aspiration og udlevering er fastsat til 50 µL/s.
Bemærk: Samme som for trin 5.2.2, disse parametre kan justeres. - I boksen efterfølgende "Overføre væske" definere den 25 µL fra hver godt af chemokine plade vil blive overført til måling plade. Position tips 20 µL nedenfor væskens overflade dvs, på højde 55 µL under aspiration fra chemokine pladen, der indeholder 75 µL/brønd (Se trin 4.1.3), og på højde 80 µL under udlevering i måling plade. Indstillet af aspiration på 50 µL/s hastighed og hastigheden af udlevering på 25 µL/s.
- Indeholde knappen "Læs med TF". Under det første interval, skal du vælge 145 læser med et Læs tidsinterval af 1 s. Definer, der 5 læser registreres før udlevering CXCL12 i måling pladen, og 140 lyder bagefter. Definere den anden interval med en Læs tidsinterval 6 s og vælg 20 læser.
Bemærk: Taget sammen, i hele den hele protokol 243 læser (fluorescerende målinger) registreres: 78 på trin 5.2.4 og 165 under trin 5.2.9. - Svarende til trin 5.2.5, indeholde knappen "Vaske tips" tre gange i protokollen.
Bemærk: Herunder denne skridt i slutningen af protokollen giver mulighed for, at tips kan genanvendes til at udføre en anden assay uden at behøve at ændre tips.
- I feltet "Indstillinger", Vælg 'Read_Mode' med excitation bølgelængde: 470-495 nM; emission bølgelængde: 515-575 nM.
- Indstil temperaturen af enheden ved 37 ° C ved at klikke på knappen "Angiv fase temperatur" og vælge 37 ° C.
6. løb fluorescens Assay
- Efter måling har pladen inkuberes med loading bufferen for 45 min (Se trin 3.1.5), fjerne bufferen ved at vende over pladen og tørre det på en væv.
- Seedede cellerne vaskes ved at tilføje 150 µL/brønd af analysebuffer og inkuberes i 2 min.
- Fjerne bufferen igen ved at vende over pladen. Tilsættes 80 µL/brønd af analysebuffer med en multikanalpipette.
- Sætte alle plader i enhed på deres passende stilling: sammensatte pladen på positionen kilde 2, chemokine pladen på den kilde 3 holdning og måling pladen på Læs position. Sætte en kasse med sort spids på kilde 1 tips holdning. Luk enhedens dør og Inkuber i 5 min før du fortsætter til protokollen.
- Vælg knappen "Protokol signal test" til at bestemme baggrunden relativ lys enheder (RLUs) og fluorescens varians over pladen. Et nyt vindue vil poppe op. Vælg "Test signal".
Bemærk: Under dette trin baggrund RLUs bestemmes af ICCD kamera, som er integreret i optik rum af fluorescens læser indretning. Disse RLUs skyldes excitation af Ca2 +-følsomme farvestof (fluo-2) af lysemitterende dioder (lysdioder) (LED output bølgelængde 470-495 nm). Værdier af 8.000-10.000 RLUs er velegnede til dette program. RLUs kan, om nødvendigt tilpasses ved at ændre excitation intensitet (Vælg Exc. intensitet) eller kamera gate (Vælg Gate åben). Varians over pladen bør ideelt set være mindre end 7,5%. - Vælg "Update", hvis baggrund værdier af 8.000-10.000 RLUs er opnået. Gem den vigtigste protokol ved at klikke på knappen Gem.
Bemærk: Ved at gøre dette indstillinger fra protokollen signal test vil overføres til de vigtigste protokol. - Køre analysen ved at trykke på knappen "RUN".
7. dataanalyse og kvalitet
- Når analysen er færdig, skal du åbne boksen "Analyse" i systemets software.
- Gå til "konfigurere korrektioner" og vælg "svar over base line". Definere base line 1 for at starte ved 1 og slutter ved måling 5; den gennemsnitlige fluorescens vil blive beregnet i hver brønd mellem måling 1 og 5.
Bemærk: Alle yderligere målinger fra en bestemt godt er divideret med denne brønd-specifikke base line 1.- Definere base linje 2 til at starte på måling 78 indtil måling 83 (CXCL12 er udleveret efter måling 83; igen den gennemsnitlige fluorescens beregnes i hvert godt mellem måling 78 og 83 og denne korrektionsfaktor påføres alle målinger efter måling 83).
- Aktivér afkrydsningsfeltet "Vis som procent" og "fratræk baggrund".
- Gå til "Konfigurere Kinetic reduktion". For at evaluere den hæmmende effekt af forbindelser på CXCL12-induceret Ca2 + respons, Vælg Max-Min fra måling 84 (dvs, den første måling, hvorefter CXCL12 er udleveret) til 243 (dvs, den sidste måling).
Bemærk: Ved at vælge Max-Min forskellen mellem den minimale og maksimale svar over baseline mellem måling 84 og måling 243 er rapporteret. Hvis Max-Min er valgt start mellem måling 11 og måling 78, er forskellen mellem den minimale og maksimale svar over grundlinjen i forhold til baseline 1 rapporteret. Denne værdi kan bruges til at analysere den potentielle agonistisk aktivitet af forbindelser, se diskussion). - Data vil være visualiseret i systemets software. Hvis det er nødvendigt, eksportere de rå data for yderligere analyse og visualisering i andre fælles analyse softwarepakker.
- Gå til "konfigurere korrektioner" og vælg "svar over base line". Definere base line 1 for at starte ved 1 og slutter ved måling 5; den gennemsnitlige fluorescens vil blive beregnet i hver brønd mellem måling 1 og 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten af CXCL12 stimulation på den intracellulære Ca2 + mobilisering i U87. CD4.CXCR4+ og U87. CD4-celler blev evalueret med Ca2 + mobilisering assay. I stedet for 20 µL af prøven stof, der normalt ville blive tilføjet under den første pipettering trin i protokollen (figur 1), analysebuffer blev føjet til fluo-2 AM indlæst U87. CD4.CXCR4+ celler i måling plade. Under det andet udlevering skridt, forskellige koncentrationer af CXCL12 (0,2-102.4 nM, endelige koncentration) blev udleveret i måling plade. En dosisafhængig stigning i fluorescens, korrelerede med en dosisafhængig stigning i frigivelse af Ca2 +, er vist (figur 2A). Her, en negativ kontrolprøve repræsenterer disse brønde, på begge tilføjelser kun analysebuffer blev tilføjet til måling pladen (dvs., 0 nM CXCL12), resulterende i mangel af et svar (figur 2A). Stigende mængder af CXCL12 fremkalde øget niveauer af fluorescens, henfald over tid (figur 2A). Fra disse data, en dosis responskurve blev genereret baseret på "Max-Min reaktion over baseline" mellem måling 84 (dvs, den første måling efter CXCL12 tilsætning) og måling 243 (dvs., den sidste måling i protokollen ). Ved hjælp af ikke-lineær regression, EF50 værdi (dvs., den koncentration, der er nødvendig for at fremkalde de halv maksimal reaktion) blev der fastsat og svarer til 1,14 nM (figur 2B). Ingen fluorescerende Ca2 +-relaterede svar var fremkaldt af CXCL12, selv ved høj koncentration (102.4 nM), når U87. CD4 celler mangler funktionelle CXCR4 udtryk blev brugt. Dette viser receptor-specificitet for måling fremkaldt af CXCL12 (figur 2 c).
En nøgle, om denne cellebaserede assay er identifikation af små molekyler, der specifikt er rettet mod CXCR4 og i stand til at hæmme CXCL12-induceret Ca2 + mobilisering. Hvis aktive forbindelser ("hits") er identificeret, kan de yderligere karakteriseres ved test serielle fortyndinger af sammensat og analysere den hæmmende styrken i flere detaljer. Som et eksempel, er effekten af bicyclam AMD3100, en veletableret lille molekyle CXCR4-specifikke receptor antagonist med potente anti-HIV-1 aktivitet21,22, illustreret i figur 3. En koncentration serie af AMD3100 (n = 4, 3 µM ned til 1,37 nM endelige koncentration i en 1/3 fortyndingsrække) blev udleveret på U87. CD4.CXCR4+ celler under det første trin i protokollen. Sammensat måtte derefter inkuberes med cellerne for ~ 10 min under som fluorescens signal blev optaget kontinuerligt. Derefter 6,4 nM i CXCL12 (50 ng/mL, endelige koncentration) blev tilføjet til alle pladens huller, celle samtidigt for at fremkalde CXCR4-medieret Ca2 + mobilisering. Dosisafhængig hæmning af dette svar fra de forskellige fortyndinger af AMD3100 er vist i figur 3A. Kun del af grafen efter tilsætning af CXCL12 vist i denne sag. Som en negativ kontrol (blå linje) kun buffer blev anvendt i analysen (ingen præ-inkubation med AMD3100, ingen CXCL12, tilsættes brøndene), hvilket resulterer i den forventede mangel på svar. Den positive kontrol (rød linje) svarer til prøver i hvilke 6.4 nM CXCL12 blev tilføjet til brønde uden forudgående inkubation af AMD3100 (figur 3A). Baseret på disse defineret negative og positive styrer Z' værdi i denne analyse er typisk mellem 0,5 og 1. For at bestemme den hæmmende styrken af AMD3100 en dosis-respons kurve blev genereret af ikke-lineær regression resulterer i en beregnet IC50 værdi af 770.8 nM (figur 3B). Illustrer yderligere adfærd af en ikke-aktiv stof, var maraviroc inkluderet i dette eksperiment. Maraviroc er et lille molekyle specifikt hæmme CC chemokine receptor 5 (CCR5), hvilket blokerer (CCR5)-tropic HIV-1 infektion23 . Selv ved høj koncentration (10 µM slutkoncentration) blev ingen hæmmende effekt af dette stof observeret på CXCR4-medieret Ca2 + svar (figur 3A).
Endelig, for at påvise, at denne Ca2 + mobilisering assay også kan anvendes til at studere andre GPCRs, en seriel fortynding af CC chemokine ligand 5 (CCL5), den endogene ligand for CCR5, blev føjet til celler, der udtrykker CCR5 (U87. CD4.CCR5+) ved hjælp af præcis de samme forsøgsbetingelser og hardwareindstillinger. En dosisafhængig fluorescerende Ca2 + svar er vist efter tilsætning af en seriel fortynding af CCL5 (figur 3 c). Hertil, og i modsætning til sin virkning på CXCR4, præ-inkubation med 100 hæmmet nM (endelig koncentration) af maraviroc stærkt dette svar (figur 3D).
Figur 1: skematisk oversigt over de assay arbejdsproces. På dag 0 celler udtrykker GPCR af interesse (i dette tilfælde CXCR4) udsås i sort-walled 96-brønd plader med klare bund og dyrkes natten over ved 37 ° C og 5% CO2. På dag 1 er fluorescens-baserede Ca2 + analysen udført. Celler er først anbringes med en fluorescerende Ca2 +-følsomme farvestof (fluo-2 AM) og inkuberes i 45 min. ved RT i mørke. En "chemokine plade" og "sammensatte plade" er udarbejdet (PP = polypropylen). Efter inkubering med indlæsning af farvestof, vaskes seedede celler en gang med analysebuffer (150 µL/brønd) efter der tilsættes 80 µL/brønd af analysebuffer. Alle plader er derefter inkuberes i 5 min i enheden ved 37 ° C før analysen. Derefter forbindelser af interesse (f.eks., små molekyler) er udleveret på den ønskede koncentration i brøndene måling plade og tilladt at udruge ~ 10 min. mens fluorescens måles kontinuerligt. Næste, en fast koncentration af endogene agonist af GPCR (her CXCL12) er føjet til fremmane Ca2 + release og fluorescens registreres yderligere over tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Agonist aktivitet af CXCL12 på CXCR4+ celler og specificitet af de fundne svar. (A) dosisafhængig effekt af CXCL12 på Ca2 + mobilisering i U87. CD4.CXCR4+ celler. (B) baseret på Max-Min reaktion over baseline mellem måling 84 og 243 en dosis-respons kurve blev genereret og EF50 værdi beregnes (n = 4, mener ± SD). (C) ingen svar er fremkaldt ved CXCL12, når det blev udleveret på U87. CD4 celler mangler CXCR4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Illustration af effekten af en CXCR4 antagonist (AMD3100) og en ikke-aktiv stof (maraviroc) på CXCR4+ celler og aktivering af CCR5 af dens endogene agonist, CCL5. (A) dosisafhængig hæmmende effekt af AMD3100 på Ca2 + mobilisering fremkaldt ved at tilføje 6.4 nM CXCL12 til U87. CD4.CXCR4+ celler. Maraviroc (ved 10 µM endelige koncentration) viste ingen hæmmende effekt på CXCL12-induceret Ca2 + svar. (B) baseret på Max-Min reaktion over baseline mellem måling 84 og 243, en hæmmende dosis-respons kurve blev genereret og IC50 værdi blev beregnet til 770.8 nM (n = 4, mener ± SD). (C) dosisafhængig aktivering af CCR5 af dens endogene agonist, CCL5. (D) hæmning af CCR5-medieret Ca2 + svar af præ-inkubation af celler med 100 nM af maraviroc. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ca2 +-mobilisering assay beskrevet heri har tidligere vist sig at være et værdifuldt redskab til at identificere og karakterisere receptor antagonister målretning CXCR417. Det forventes dog, at denne metode kan være mere generelt anvendes til en stor gruppe af andre GPCRs, der udløser en cytosole Ca2 + release ved deres aktivering, som illustreret til relaterede chemokine receptor CCR5. For CCR5 præcis de samme forsøgsbetingelser kunne anvendes, skal flere trin i protokollen (f.eks.celle nummer på plating, indlæsning af celler med et fluorescerende farvestof) være re optimeret inden flytningen assay til andre GPCRs for at opnå en gunstig signal / støj-forhold. Et vigtigt emne her er også valget af en passende i vitro cellulære værten giver på højt plan udtryk for GPCR interesse og funktionelle kobling til Ca2 + pathway. I tilfælde af CXCR4, menneskelige glioblastom U87 celler blev valgt på grund af: (1) mangel på endogene udtryk for CXCR7 (en beslægtet chemokine receptor, der indtager den samme agonist som CXCR4), (2) deres evne til at par CXCR4 aktivering til Ca2 +-signalering pathway, (3) den gunstige dynamikområde fluorescerende svar opnås efter indlæsning af celler med Ca2 +-følsomme farvestof, og (4) deres fremragende tilslutning til analysen plader minimere celle forstyrrelser under hele proceduren. Alle disse parametre skal bestemmes eksperimentelt for hver roman GPCR af interesse og hver cellulære ekspressionssystem.
Når du opretter en lignende analyse for en anden GPCR, kan flere alternative trin eller reagenser i protokollen betragtes. For eksempel, andre Ca2 +-følsomme fluorophores (f.eks., fluo-4, fluo-3) kan anvendes som et alternativ til fluorophore (fluo-2) anvendes i denne protokol. I tilfælde af løst vedhængende celler, vask af cellerne kan udelades ved at indføre no-vask farvestoffer for at minimere celle løs24. Derudover vil undtagen vask skridt fra protokollen yderligere øge gennemløbet af den assay. Selv om dette assay kan også udføres med celler viser endogene udtryk for CXCR4, for eksempel herunder flere typer af menneskelige kræft celle linjer10,25, skal det bemærkes, at med stabilt transfekteret celle linjer høj GPCR udtrykket niveauer, der forbliver stabile over tid kan rekvireres. Dette vil resultere i mere udtalt assay målinger, et større vindue for pålidelige data fortolkning, og konsekvent assay præstationer over længere perioder. Når du bruger celler endogent vil udtrykker CXCR4 det være langt vanskeligere at opnå dette resultat.
En stor ulempe af analysen er, at det bygger på et fluorescens målingen. Derfor kan autofluorescent forbindelser interferere med assayets måling, hvilket udelukker dem fra analyse på grund af upålidelige data fortolkning. Også er denne Ca2 + mobilisering assay ideelt udføres ved hjælp af en cellulær screening system udstyret med en integreret pipettering system, der giver standardiseret blanding og dispension af forbindelser og receptor agonist i måling pladen i alle Wells samtidigt. Analysen kunne imidlertid være tilpasset til brug med andre, mindre dyre fluorescens mikrotiterplade læsere med kinetic måling kapaciteter. Tilføjelse af forbindelser og agonist ønsker derefter skal udføres manuelt ved hjælp af multikanals pipetter, hvilket vil øge hands-on på tid og sænker den assay overførselshastighed. Derudover ville at opnå et tilsvarende antal fluorescens målinger inden for et givet tidsinterval af en kinetisk analyse være vanskeligt at opnå som mange mikrotiterplade læsere måle signaler godt af godt mens high-end screening systemer måle alle brønde samtidigt.
Receptor antagonister forhindre binding til receptoren og efterfølgende aktivering af den endogene agonist (CXCL12) i øjeblikket udgør den vigtigste kategori af forbindelser specifikt er rettet mod CXCR411,12. AMD3100, den lille molekyle, der blev brugt til at illustrere udførelsen af Ca2 + mobilisering assay, er en af de mest fremtrædende eksempler på CXCR4 antagonister26. Udover receptor antagonister rejse molekyler, der regulerer GPCR signalering anderledes generelle interesse. Disse molekyler omfatter inverse agonister, samt GPCR PAMs og NAMs19,20,27. Et interessant træk af analysen beskrives i dette håndskrift er, at det ikke kun kan identificere receptor antagonister, men også agonister og allosteriske modulatorer. Visse mindre tilpasninger af analysen og begrænsninger skal dog tages i betragtning.
PAMs og NAMs binder sig til receptoren websteder topografisk adskiller sig fra det orthosteric bindingssted besat af den receptor endogene ligand. Der henviser til, at PAMs øge styrken og/eller effekt af den receptor endogene ligand(s), hæmme NAMs potens og/eller effekt af endogene ligand(s)19,20. PAMs har ingen iboende agonist aktivitet. De er kun aktive i nærværelse af den endogene agonist, i modsætning til såkaldte allosteriske agonister. Fordi allosteriske GPCR modulatorer ville fremkalde mindre bivirkninger end klassisk receptor antagonister når de anvendes i kliniske indstillinger28,29, er de værdifulde farmakologiske værktøjer. I vores analyse, allosteriske agonister vil fremkalde en forbigående stigning af fluorescens signalet straks efter tilsætning til CXCR4+ celler. Receptor, der kendetegner dette signal bør derefter bestemmes ved at teste den samme sammensatte med den samme analyse, men på celler mangler CXCR4. Når specielt screening for PAMs, bør en lavere koncentration af endogene agonist anvendes i analysen til at fremkalde en fluorescerende Ca2 + svar. Selv om denne lavere mængde af agonist vil generere et mindre fluorescerende signal, efterlader det et større vindue for at registrere ekstra receptor stimulation. Typisk, en agonist, hvis koncentration svarer til EF10- EF30 værdi af receptor stimulation er valgt30,31. Tilføjelse af en PAM under den første del af analysen vil ikke resultere i en øget fluorescerende måling. Men den fluorescerende Ca2 + signal efter efterfølgende stimulering af receptoren med sin endogene agonist ville øge. Ligeledes en NAM ændrer ikke fluorescerende målingen før agonist tilsætning, men hæmmer den receptor reaktion efter tilsætning af agonist. Derfor, aktivitet profilen af en receptor antagonist og en NAM vil ligne. De begge vil resultere i hæmning af det fluorescerende svar efter agonist tilsætning. Derfor, yderligere eksperimentelle undersøgelser er forpligtet til at forskelsbehandle en antagonist og en NAM. Her, receptor binding undersøgelser hvorved umærkede forbindelser konkurrere med et fast beløb af mærket CXCL12 til bindende på CXCR417,32 kan være en værdifuld strategi at diskriminere mellem en antagonist, der forhindrer de mærket agonist fra binding til receptoren, og en NAM, der ville ikke som det ikke ville dele den samme receptor bindingssted.
Ligand uafhængig (eller basal eller konstitutiv) aktivitet af GPCRs er blevet observeret talrige GPCRs33 selv om basal aktivitetsniveau er generelt temmelig lavt, når GPCRs udtrykkes recombinantly27. Basal GPCR aktivitet kan blive forstærket af naturligt forekommende mutationer33 og et punkt mutationen fører til øget basal CXCR4 aktivitet har været beskrevet tidligere34. Ved at koble dette constitutively aktive CXCR4 mutant til pheromone svar pathway i gær og [35S] GTPγS bindende eksperimenter, det var vist at T140, et peptid-baserede CXCR4 antagonist med potente anti-HIV aktivitet17,35 faldt betydeligt denne basale aktivitet og dermed viste sig at opføre sig som en invers agonist34. Bemærk, i en Fura-2 fluorescens-baserede Ca2 + mobilisering assay de samme forfattere observeret en lille forbigående fald i Ca2 +-relaterede fluorescens efter tilsætning af T140 til celler, der udtrykker mutant CXCR4, tyder på et fald i basal receptor aktivitet34. Men da analysere en yderligere panel af cyklisk pentapeptide-baserede CXCR4 inverse agonister designet fra T140, påvisning af nedsat basal aktivitet med en Ca2 + mobilisering assay var mindre ligetil36. Når effekten af T140 på celler, der udtrykker vildtype CXCR4 blev analyseret ved hjælp af Ca2 + mobilisering assay, som beskrevet i dette manuskript, blev ingen ændring i basal fluorescens signal observeret17. Derudover fluorescens udsving er hurtig og forbigående og observeres for eksempel ikke i celler, der udtrykker constitutively aktive Gαqstigninger i basal Ca2 + -koblede receptorer4. Tilsammen, ville effekten af inverse agonister være meget vanskeligt, hvis ikke umuligt at identificere og vurdere pålideligt med vores analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Eric Fonteyn og Geert Schoofs for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde er blevet støttet af KU Leuven (give nr. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, give nr. G.485.08), og Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).
