Summary
Beskrevet mobilnettet analysen er utformet for identifikasjon av CXC chemokine reseptor 4 (CXCR4)-samspill agenter som hemme eller stimulere, enten konkurransedyktig eller allosterically, intracellulær Ca2 + utgivelsen initiert av CXCR4 aktivisering.
Abstract
G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) er av stor betydning for den farmasøytiske industrien som de er involvert i mange menneskelige sykdommer og ta godt godkjente mål for terapeutisk intervensjon. Oppdagelsen av bly stoffer, inkludert små syntetiske molekyler, som spesielt hemme reseptorens funksjonen, er et viktig første skritt i utviklingen og avhengig av sensitive, spesifikk og robust cellebasert analyser. Her beskriver vi en kinetisk mobilnettet analysen med et fluorescerende avlesning hovedsakelig laget for å identifisere reseptor-spesifikke antagonister som hemmer intracellulær Ca2 + utgivelsen utløste ved aktivering av CXC chemokine reseptoren 4 (CXCR4) av sin endogene ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). En viktig fordel med denne metoden er at det gjør også screening av forbindelser med iboende agonistic egenskapene (dvs., forbindelser fremlokkende en økning i intracellulær Ca2 + konsentrasjon i fravær av CXCL12) eller forbindelser modulerende reseptorens funksjon via interaksjon med allosteric bindende (dvs, positive og negative allosteric modulatorer (PAMs og NAMs, henholdsvis)). På ned side, kan autofluorescent forbindelser forstyrre analysens avlesning, og dermed hindrer pålitelige data tolkning. Sannsynligvis kan denne analysen gjennomføres, med minimal tilpasninger, som en fellesbetegnelse stoffet funnet analysen for mange andre GPCRs hvorav aktivering fører til en utgivelse av intracellulær Ca2 +.
Introduction
GPCRs er en viktig gruppe av cellen overflaten proteiner som aktiverer signal signaltransduksjon cascades på ekstracellulære ligand binding. De kan aktiveres av et stort utvalg av stimuli inkludert peptider, protein hormoner, biogenic aminer og lipider, som resulterer i initiering av ulike intracellulær signalveier og til slutt biologiske svar1,2 . Videre GPCRs er involvert i mange, om ikke alle, utviklingsmessige og fysiologiske prosesser og mange menneskelige sykdommer er assosiert med dysfunksjonelle GPCR signalering eller reseptoren overuttrykte. GPCRs er derfor blant de mest validert farmakologiske målene i medisin1,3.
Vanligvis starter en GPCR drug discovery arbeidsflyten med cellular screening analyser aktivere identifikasjon av forbindelser som små molekyler, monoklonale antistoffer og peptider som kan modulerer aktiviteten til en bestemt GPCR. I GPCR stoffet funnet mange forskjellige typer analyser eksisterer for å søke etter slike forbindelser, er de fleste som kompatible med midt - til høy gjennomstrømming screening kampanjer. De mest brukte analyser inkluderer reseptor bindende eksperimenter, fluorescens eller luminescence basert analyser oppdage svingninger i nivået av såkalte sekundære messengers (f.eks, Ca2 +, syklisk adenosin monofosfat (AMP)), fenotypiske screening analyser og β-arrestin rekruttering søk4. Valget for en bestemt type analysen kan avhenge av flere faktorer, men bestemmes også av forutgående kunnskap om signalnettverk egenskapene til en gitt GPCR. Agonistiske binding til en GPCR induserer en conformational endring utløse utveksling av guanidine diphosphate (BNP) for guanidine trifosfat (GTP) på α-delenhet heterotrimeric G proteiner. Senere Gα-GTP delenhet dissociates fra Gβγ delenhet og begge underenheter vil starte videre signalveier. Hydrolyse GTP-molekylet og påfølgende re sammenslutning av Gα- BNP og Gβγ underenheter vil gjenopprette G protein i sine inaktive konformasjon5,6. Basert på sekvens likheten av Gα delenhet defineres forskjellige typer G proteiner (GsGjegGq, G12/13)7. Signalene via Gα delenhet gir opphav til flere typiske svar som økningen (via Gs) eller redusere (via Gjeg) av syklisk AMP produksjon og intracellulær Ca2 + mobilisering (via Gq)5 ,7. Gβγ tenkes kan også å indusere intracellulær effektor trasé. For eksempel ved aktivering av Gjeg-kombinert GPCRs, Gβγ kan direkte stimulerer fosfolipase C (PLC-β) å produsere inositol trifosfat (IP3) som utløser utgivelsen av Ca2 + fra intracellulær butikker7 . Etter reseptor aktivisering, GPCRs fosforylert av GPCR kinaser (GRKs) som fremmer interaksjon med β-arrestins. Denne prosessen avslutter G protein signalering og fører til reseptoren desensitization og til slutt internalisering. Β-arrestins kan også danne flere molekylær komplekser som kan utløse andre signalveier uavhengig av G protein signalering8.
I gruppe av chemokine reseptorer, den Gjeg-kombinert CXCR4 er en GPCR som har reist mye interesse som en lovende mål for medisiner. Gitt sin etablerte rolle som en stor co reseptor for humant immunsviktvirus 1 (HIV-1) ble viral oppføringen og infeksjon, forbindelser målretting CXCR4 opprinnelig utviklet som anti-HIV narkotika kandidater9. Flere nylig, en voksende mengde bevis har pekt på en viktig rolle for CXCR4 i tumorigenesis og kreft metastasering og et godt validert terapeutisk mål i onkologi samt10. CXCR4 er svært uttrykt i mer enn 20 typer menneskelig kreft og kontroller svulst celle overlevelse, spredning, og overføring samt svulst-relaterte angiogenese10. CXCR4 antagonister forskjellige kjemiske klasser har tidligere blitt beskrevet11,12, men bare i små molekyl AMD3100 er godkjent for bruk i klinikken som stilk cellen mobilisering agent brukt under behandling av lymphoma og myelom pasienter13,14. Kliniske studier er pågående evaluere effekten av flere andre CXCR4 antagonister i ulike menneskelige sykdommer, men med et sterkt fokus på onkologi12og sikkerhet. Gitt de mange mulige programmene for CXCR4 antagonister, er søk for romanen forbindelser med forbedret farmakokinetiske egenskapene, forbedret biotilgjengelighet eller potensielt mindre bivirkninger garantert.
Her, en kinetisk fluorescens-baserte mobilnettet analysen primært brukes til skjermen for forbindelser kan hemme CXCR4 er beskrevet. Fluorescerende måling av denne metoden er basert på forbigående økningen av intracellulær Ca2 + konsentrasjonen fremkalt ved CXCR4 aktivering av sin endogene Agonistiske, chemokine ligand CXCL12 (tidligere kjent som stromal cell avledet faktor 1α ( SDF1-α)), og potensielle hemming av dette CXCL12-indusert Ca2 + svaret av bestemt forbindelser. I denne analysen brukes U87 menneskelige glioblastom celler stabilt uttrykke menneskelige CXCR4 reseptoren. Samtidig mangler disse cellene endogene uttrykk for CXCR7, en relaterte chemokine reseptor som også binder CXCL1215,16,17. CXCR7 har tidligere også vist å være stand til å danne heterodimerer med CXCR4, og dermed modulerende signalnettverk egenskapene for denne siste reseptor18. Svingninger i nivået av intracellulær Ca2 + formidlet av CXCR4 overvåkes av lasting av CXCR4+ celler med fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, en celle-permeable høy affinitet fluorescerende Ca2 +-bindende fargestoff. Fluo-2 AM er et enkelt bølgelengde fluorescerende molekyl som kan være spent på 490 nm mens dens utslipp fluorescens måles på 520 nm. Denne utslipp fluorescens øker på Ca2 + bindende, med et stort dynamisk område mellom Ca2 +-bundet og ubundet tilstand. Økningen i fluorescerende signalet er forbigående, innenfor et tidsintervall på noen minutter, og vil forfalle etterpå. Topp høyden av fluorescerende utslipp ytterligere korrelerer med nivået på reseptor aktivisering. Analysen selv utføres ved hjelp av en fluorescens microplate leser utstyrt med en forsterket CCD (ICCD) kamera som har et integrert pipettering system som gir standardisering av pipettering trinnene i analysen (se Tabell for materiale) . I tillegg er samtidig måling av fluorescerende signalet i alle brønnene av en microplate en annen viktig fordel av fluorescens leseren som brukes. Under først del av analysen forbindelser under etterforskning (f.eks, et panel av små molekyler på en fast konsentrasjon eller en fortynning serie) legges til fluo-2 AM lastet CXCR4+ U87 celler etterfulgt av en ~ 10 min incubation periode Når måles kontinuerlig potensielle agonistic effekten av forbindelser i sanntid. Deretter den endogene Agonistiske (dvs.CXCL12) legges til cellene til å fremkalle et CXCR4-mediert forbigående økning i nivået av intracellulær Ca2 +. Under denne delen av analysen kan potensielle antagonistiske aktiviteten av testet forbindelser evalueres. En skjematisk oversikt over analysens generelle arbeidsflyt vises i figur 1.
Selv om denne Ca2 + mobilisering analysen er primært brukt til å identifisere og fastsette hemmende styrken på konkurrerende CXCR4 antagonister (dvs., forbindelser som hindrer den endogene Agonistiske å binde og stimulere reseptoren) det også kan identifisere reseptor agonister, og i tillegg forbindelser som utøve sin funksjon av bindingen på allosteric nettsteder (dvs., nettsteder som topografisk avviker fra webområdet for orthosteric-binding av endogene Agonistiske). Allosteric agonister og PAMs og NAMs19,20er eksempler på sistnevnte kategori av forbindelser. Mens reseptor-spesifikke antagonister samt NAMs ville hemme CXCL12-indusert Ca2 + svaret, PAMs vil øke dette svaret (se også diskusjon delen). Selv om analysen beskrevet her spesielt mål CXCR4, det er forventet at denne metoden kan brukes på andre GPCRs med minimal optimalisering innsats, minst hvis de signal via utgivelsen av intracellulær Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Alle trinnene som er beskrevet under delene 1 og 2 er utført under sterile forhold i en laminær strømning kabinett.
1. vedlikehold av U87. CD4.hCXCR4 celler
- Vokse cellene i MT75 kultur flasker på 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet inkubator.
Merk: I vitro celle linjen brukes i denne protokollen er en U87 glioblastom celle linje stabilt uttrykke cluster for differensiering 4 (CD4) og menneskelige CXCR4 og har vært beskrevet tidligere17. Cellen overflaten uttrykk for CD4 og CXCR4 er kontinuerlig overvåket av flowcytometri og uttrykk nivåer forblir konstante over tid (~ 100% CD4+ og ~ 100% CXCR4+ celler). En detaljert beskrivelse av generasjonen av brukte cellen linjen og flyt cytometri prosedyren for å undersøke reseptor uttrykk nivåer er ikke innenfor denne protokollen.- Subkultur celler på 80-85% confluency. La reagenser til romtemperatur (RT) før cellen dyrking.
- Fjerne betinget kultur medium fra cellene og vask celle monolayer gang med 5 mL fosfat bufret saltvann (PBS).
- Legg 3 mL 0,25% trypsin-EDTA og fordele det jevnt over celle monolayer. Deretter fjerne overflødig av trypsin-EDTA og Inkuber opptil 5 min på 37 ° C til celler begynner å koble.
- Legge til 10 mL av fersk komplett oppblomstringen medium (Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) + 10% fosterets Bovine Serum (FBS) 0,01 M HEPES ++ riktig valg agenter). Resuspend cellene av pipettering forsiktig opp og ned. Overføre celle suspensjon slik sterilt 50 mL.
- Telle antall levedyktige cellers bruke en valg. Ved U87 glioblastom celler, levedyktighet generelt når ~ 100%.
Merk: Cellen tallene kan fastslås på flere måter. Vi rutinemessig bruker en automatisert celle analysesystem basert på trypan blå flekker (se Tabell for materiale) ifølge sin standard håndtering prosedyrer, men andre oppførsel skal fungere like bra. - Legge til 2 x 106 eller 3 x 106 (levedyktig) celler i et endelig antall 25 mL frisk vekstmediet i en MT75 kultur kolbe og ruge på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Hvis 3 x 106 celler brukes cellene kommer 80-90% confluency etter 2 dager. Hvis 2 x 106 celler, vil de nå den samme confluency etter 3 dager. Veksten av cellene bør først fastsettes empirisk hvis andre linjer brukes.
2. seeding cellene for Ca2 + mobilisering analysen
- I dag i celle passaging (dag 0), pelsen svart vegger polystyren 96-brønns plater med klar bunnen (se Tabell for materiale) med en 0,1% gelatin løsning å lette celle vedlegg.
Merk: Av 96-brønns platene med gelatin kan utelates hvis pre belagt plater som er kommersielt tilgjengelig (se Tabell for materiale), brukes. Det anbefales å vurdere bruk av pre belagt plater i stedet for manuell belegg for hver celle linje under etterforskning før du fortsetter med protokollen.- Forberede gelatin løsning ved å legge 1 g av 100 mL PBS å få en 1% løsning. Fortynn med 10 x med PBS før videre bruk. For å øke Løseligheten av gelatin, varme løsningen på 37 ° C.
- Legg 100 µL 0,1% gelatin løsning per brønn av 96-brønns platen ved hjelp av en flerkanals pipette. Inkuber 2 h på RT.
- I mellomtiden, forberede cellene seeding i belagt 96-brønns plate.
- Koble cellene fra kultur kolbe, resuspend dem i frisk vekst medium og telle dem ved hjelp av trypan blå flekker metoden.
- Nedspinning cellene i en 50 mL tube i 5 min på 400 x g ved RT.
- Resuspend cellene i frisk oppblomstringen medium (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, ingen antibiotika) å få en celle tetthet 0,1 x 106 (levedyktig) celler/mL.
- Fjern gelatin løsningen fra svart vegger platene med klart bunnen av bla over platen og tørk den på en vev. Legge til 200 µL/vel PBS fjerne overflødig gelatin og snu platen igjen.
- Dispensere 200 µL av cellen suspensjon (tilsvarende 0,2 x 105 celler) per brønn i gelatin-belagt 96-brønns plate (fra nå en denne platen vil ytterligere kalles "måling plate").
- Inkuber platen overnatting på 37 ° C og 5% CO2.
3. lasting av cellene med et fluorescerende Ca2 + -sensitive Dye
- På dag 1 utføre faktiske Ca2 + mobilisering analysen, starter med lasting av seeded cellene med den fluorescerende Ca2 +-binding fargestoff fluo-2 AM.
- Forberede analysebuffer ved å legge til 40 mL HEPES (1 M) til 200 mL Hanks balansert saltløsning (HBSS, 10 x, ingen fenol rød, ingen natriumbikarbonat). Legg ultrapure vann for å få et endelig antall 2 L og legge 4 g Bovine Serum Albumin (BSA). Oppløse BSA via magnetisk omrøring. Justere pH 7,4 (med NaOH) og filtrere løsningen.
Merk: Under alle følgende samme bufferen, referert til som "analysebuffer", brukes. - Forberede en lagerløsning (4 mM i dimethyl sulfoxide (DMSO)) av fluorescerende Ca2 +-sensitive fargestoff fluo-2 AM. Unngå overdreven eksponering for lys. Oppløse 1 mg fluo-2 AM (molekylvekt: 1,061 g/mol) i 235.6 µL DMSO.
- Forberede en fungerende løsning av fluo-2 AM. En 96-brønns analysen plate blande 12.5 µL av fluo-2 AM lagerløsning (4 mM) og 12,5 µL ikke-ionisert surfactant polyol (f.eks, pluronic f-127) løsning (20% vekt/volum i DMSO se Tabellen for materiale). Legge til 22 µL av denne blandingen i 11 mL analysebuffer i en 15 mL tube. Siste konsentrasjonen av fluo-2 AM er 4 µM.
Merk: Ikke-ionisert surfactant brukes som spredning agent for å forbedre vandig Løseligheten av fluo-2 AM, og i konsekvens, å forbedre celle lasting. For å solubilize surfactant i DMSO, varme prøven på 37 ° C og bland regelmessig for å få en homogen løsning. - Fjern vekstmediet fra tidligere seeded cellene i 96-brønnen måling plate av bla over platen og tørk den på et papirhåndkle.
- Legg 100 µL av lasting fargestoff løsning per brønn ved hjelp av en flerkanals pipette og ruge for 45 min på RT i mørket.
- Forberede analysebuffer ved å legge til 40 mL HEPES (1 M) til 200 mL Hanks balansert saltløsning (HBSS, 10 x, ingen fenol rød, ingen natriumbikarbonat). Legg ultrapure vann for å få et endelig antall 2 L og legge 4 g Bovine Serum Albumin (BSA). Oppløse BSA via magnetisk omrøring. Justere pH 7,4 (med NaOH) og filtrere løsningen.
4. forberedelse av 96-brønns polypropylen plater som inneholder Chemokine Ligand CXCL12 eller forbindelser under etterforskning
- Få runde polypropylen (PP) 96-brønns bunnplater (se Tabell for materiale).
- Tillate lager løsning av CXCL12 (1 mg/mL) og lager løsningen av forbindelser under etterforskning til equilibrate på RT.
Merk: Lager løsning av CXCL12 er utarbeidet i ultrapure vann supplert med 0,01% Tween20 og lagret på 20 ° C som engangs dele. - Forbered en 5 x konsentrert løsning av CXCL12 i analysebuffer (250 ng/mL som tilsvarer 31.25 nM) og en 5 x konsentrert fortynning av hver sammensatte (i analysebuffer).
- Dispensere lager løsninger i riktig 96-brønns platen etter en forhåndsdefinert plate layout. Dispensere 75 µL/godt i plate inneholder CXCL12 ("chemokine plate"), dispensere 50 µL/godt i platen inneholder forbindelser ("sammensatt plate").
Merk: Begge forbindelser og CXCL12 vil endelig blitt utvannet 5 x på utlevering i måling plate. Det er også viktig å inkludere negativ kontroll brønner som inneholder bare analysebuffer i både sammensatte platen samt chemokine platen. Også positivt kontroll brønner må inkluderes (i.e.brønner med CXCL12 i chemokine platen, men med analysebuffer i tilsvarende brønnene av sammensatte plate).
- Tillate lager løsning av CXCL12 (1 mg/mL) og lager løsningen av forbindelser under etterforskning til equilibrate på RT.
5. protokollinnstillingene på fluorescens Microplate leseren
Merk: Fluorescens microplate leseren i denne protokollen er referert til i Tabellen for materiale.
- Slå på fluorescens plate leseren kjøligere enheten først, og deretter slå på fluorescens leseren selv. La starte i noen minutter og åpne datasystemet.
- Opprette analysens protokollen ved hjelp av dra og slipp-menyen som inkluderer følgende:
- "Innstillinger", velg "Read_Mode" med eksitasjon bølgelengde: 470-495 nM; utslipp bølgelengde: 515-575 nM.
Merk: De valgte bølgelengdene er hensiktsmessig for bruk med Ca2 +-sensitive fargestoff fluo2. - Inkluderer boksen "Blanding med TF" (væske) for automatisk blanding av forbindelser i sammensatte platen, som vil bli satt på kilde 2 plasseringen av enheten (se trinn 6,4). Velg 15 µL løsning i hver brønn automatisk pustende og blandet tre ganger. Juste høyden på pipette-spisser på 20 µL under flytende overflaten. Angi hastigheten på aspirasjon og utlevering på 50 µL/s.
Merk: Høyden av pipette-spisser refererer til volumet som er igjen under pipette-spisser. For eksempel hvis brønnene av en sammensatt plate inneholder 50 µL, tilsvarer en høyde på 30 µL 20 µL under flytende overflaten. Volumet av sammensatte løsningen tatt å blande, hastigheten på blanding, posisjonen til pipette tips under blanding, og antall blande sykluser kan endres ved hjelp av programvaren. - I boksen "Overføre væske" definere at 20 µL av hver godt av sammensatte platen vil bli overført til måling platen. Plasserer tips Pipetter 20 µL under væsken overflaten dvshøyde 30 µL under aspirasjon av forbindelser og høyde 60 µL under dispensering i måling plate. Angi hastigheten på aspirasjon på 50 µL/s og hastigheten på utlevering på 25 µL/s.
Merk: Sammensatte platen inneholder 50 µL løsning per brønn (se trinn 4.1.3), dermed en høyde på 30 µL tilsvarer en posisjon 20 µL under flytende overflaten. Måling platen inneholder 80 µL av analysebuffer per brønn (se trinn 6.3), dermed en høyde på 60 µL tilsvarer en lignende plassering tips. - Velg «Les med TF». Under det første intervallet, velger du 60 leser (fluorescerende målinger) med Les intervalltiden 1 s. Definer som 10 leser registreres før utlevering av forbindelser inn i mål-plate, og 50 leser etterpå. Definere andre intervallet med Les intervalltiden 30 s og 18 leser.
Merk: I dette trinnet fluorescens vil måles kinetically (med de definerte tidsintervallene) for ~ 10 min totalt. - Inkluder knappen "Vask Tips" i protokollen tre ganger. I hvert vask trinn, Velg væske: væske (ultrapure vann) eller væske B (70% etanol), antall vask sykluser (1), pumpen speed (rask), og antallet av slag (5) under hver vask trinn.
Merk: Under først og siste vask trinn flytende A er brukt, under andre trinn væsken B brukes. - Inkluder funksjonen "Pause å hindre". Angi hindre for å 300 s.
Merk: Ved dette trinnet i protokollen, hindre hodet, som er integrert i fluorescens plate reader enhet, stopper oppringningen i 5 minutter før du fortsetter protokollen. - Inkluderer "Blanding med TF" for å tillate automatisk blanding av CXCL12 løsningen på chemokine plate, som plasseres ved kilden 3 enheten (se trinn 6,4). Velg 15 µL løsning i hver brønn automatisk pustende og blandet tre ganger. Under aspirasjon og miksing, plasser den tips Pipetter 20 µL under flytende overflaten. Aspirasjon og dispensing ligger 50 µL/s.
Merk: Tilsvarende som for trinn 5.2.2, disse parametrene kan justeres. - I boksen påfølgende "Overføre væske" definere at 25 µL fra hver brønn av chemokine plate vil bli overført til måling platen. Posisjon tips 20 µL under væsken overflaten dvspå høyden 55 µL under aspirasjon fra chemokine plate som inneholder 75 µL/vel (se trinn 4.1.3), og på høyden 80 µL under dispensering i måling plate. Angi hastigheten på aspirasjon på 50 µL/s og hastigheten på utlevering på 25 µL/s.
- Inkludere "Les med TF" knappen. Under det første intervallet, Velg 145 leser med Les intervalltiden 1 s. Definer 5 leser registreres før utlevering CXCL12 inn i mål-plate, og 140 leser etterpå. Definere andre intervallet med Les intervalltiden 6 s og velg 20 leser.
Merk: Samlet gjennom hele protokollen 243 leser (fluorescerende målinger) registreres: 78 på trinn 5.2.4 og 165 under trinn 5.2.9. - Lignende trinn 5.2.5, inkludere knappen "Vaske tips" tre ganger i protokollen.
Merk: Inkludert dette trinnet på slutten av protokollen tillater at tipsene kan brukes å utføre en annen analysen uten å måtte endre tips.
- "Innstillinger", velg "Read_Mode" med eksitasjon bølgelengde: 470-495 nM; utslipp bølgelengde: 515-575 nM.
- Angi temperaturen på enheten på 37 ° C ved å klikke "Angi scenen temperatur" og velge 37 ° C.
6. kjøre fluorescens analysen
- Etter måling plate har inkubert med lasting bufferen for 45 min (se trinn 3.1.5), fjerne bufferen ved å bla over platen og tørk den på en vev.
- Vask seeded cellene ved å legge 150 µL/vel av analysebuffer og ruge i 2 minutter.
- Fjerne bufferen igjen ved å bla over platen. Legge til 80 µL/vel av analysebuffer med en flerkanals pipette.
- Alle platene inn enheten mot sin aktuelle posisjon: sammensatte platen kilde 2 der chemokine platen kilde 3 der og måling platen Les der. Sette en boks med sorte Tupper kilde 1 tips der. Lukk enhetens dør og ruge i 5 minutter før du fortsetter protokollen.
- Velg knappen "Protokollen signal test" å finne bakgrunnen relative lette enheter (RLUs) og fluorescens avvik over platen. Et nytt vindu ville popmusikk opp. Velg "Test signal".
Merk: Under dette trinnet bakgrunn RLUs, bestemmes av ICCD kameraet, som er integrert i optikk rommet fluorescens leser enheten. Disse RLUs skyldes magnetisering av Ca2 +-sensitive fargestoff (fluo-2) av lys emitting diodene (lys) (LED utgang bølgelengde 470-495 nm). Verdiene i 8000-10.000 RLUs er godt egnet for dette programmet. RLUs kan eventuelt tilpasses ved å endre eksitasjon intensiteten (Velg Exc. intensitet) eller kameraet porten (Velg porten åpen). Avviket over platen bør ideelt sett være mindre enn 7,5%. - Velg "Update" Hvis bakgrunnen verdier av 8000-10.000 RLUs hentes. Lagre den viktigste protokollen ved å klikke Lagre.
Merk: Dermed innstillingene fra protokollen signal test vil bli utført viktigste protokollen. - Kjør analysen ved å trykke på "RUN" knappen.
7. dataanalyse og kvalitet
- Når analysen er fullført, kan du åpne boksen "Analyse" i datasystemet.
- Gå til "Konfigurer rettelser" og velg "svar over grunnlinjen". Definere base linje 1 for å starte på måling 1 og slutten på måling 5; den betyr fluorescensen beregnes i hver brønn mellom måling 1 og 5.
Merk: Alle ytterligere mål fra en bestemt godt er delt på denne brønnen-spesifikke base linje 1.- Definere base linje 2 å starte ved måling 78 til mål 83 (CXCL12 er utlevert etter måling 83, igjen betyr fluorescens beregnes i hver godt mellom måling 78 og 83 og denne korrigeringsfaktoren brukes til alle mål etter måling 83).
- Aktivere kryss "Vis som prosent" og "trekk fra bakgrunn".
- Gå til "Konfigurer Kinetic reduksjon". For å evaluere den hemmende effekten av forbindelser på CXCL12-indusert Ca2 + svar, velger du Max-Min fra måling 84 (dvs.det første målet etter som CXCL12 er utlevert) til 243 (dvs., til ferdig mål).
Merk: Ved å velge Max-Min forskjellen mellom minimums- og responsen over planlagt mellom måling 84 og måling 243 rapporteres. Max-Min velges starter mellom måler 11 og måling 78, rapporteres forskjellen mellom minimums- og responsen over grunnlinjen i forhold til opprinnelig plan 1. Denne verdien kan brukes å analysere potensielle agonistic aktiviteten forbindelser, se diskusjonen). - Dataene vil bli visualisert i datasystemet. Hvis nødvendig, eksport rådata til ytterligere analyse og visualisering i andre felles analyse-programvarepakker.
- Gå til "Konfigurer rettelser" og velg "svar over grunnlinjen". Definere base linje 1 for å starte på måling 1 og slutten på måling 5; den betyr fluorescensen beregnes i hver brønn mellom måling 1 og 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av CXCL12 stimulering på intracellulær Ca2 + Mobilisering i U87. CD4.CXCR4+ og U87. CD4 celler ble evaluert med Ca2 + mobilisering analysen. I stedet for 20 µL av test forbindelse som normalt legges under pipettering steg av protokollen (figur 1), analysebuffer ble lagt til fluo-2 AM lastet U87. CD4.CXCR4+ celler i måling plate. Under det andre dispensering trinnet ulike konsentrasjoner av CXCL12 (0,2-102.4 nM, siste konsentrasjon) ble utlevert i måling platen. En doseavhengig økning i fluorescens, samkjøre med en doseavhengig økning av utgivelsen av Ca2 +, demonstreres (figur 2A). Her negativ kontroll prøven representerer de brønnene som på begge filer bare analysebuffer ble lagt til måling platen (dvs.0 nM CXCL12), noe som resulterer i fravær av et svar (figur 2A). Økende mengder CXCL12 induserer økte nivåer av fluorescens som forfalle over tid (figur 2A). Fra disse dataene får en dose respons kurve ble generert basert på "Max-Min svar over grunnlinjen" mellom måling 84 (dvs.det første målet etter CXCL12) og måling 243 (dvs., den siste målingen i protokollen ). Bruker lineær regresjon, EF50 verdien (dvs., konsentrasjonen trengs å fremkalle halv maksimal svaret) ble bestemt og tilsvarer 1.14 nM (figur 2B). Ingen fluorescerende Ca2 +-relaterte svar var fremkalt av CXCL12, selv ved høy konsentrasjon (102.4 nM) når U87. CD4 celler mangler funksjonelle CXCR4 uttrykk ble brukt. Dette viser reseptor-spesifisiteten av målingen fremkalt av CXCL12 (figur 2C).
En nøkkel program for denne cellen-basert analysen er identifikasjonen av små molekyler spesielt rettet mot CXCR4 og i stand til å hemme CXCL12-indusert Ca2 + mobilisering. Hvis aktive forbindelser ("treff") er angitt, kan de være ytterligere preget av testing føljetong fortynninger av sammensatte og analysere hemmende styrken i mer detalj. Som et eksempel, er effekten av bicyclam AMD3100, en veletablert små molekyl CXCR4-spesifikke reseptor antagonist med en potent anti-HIV-1 aktivitet21,22illustrert i Figur 3. En konsentrasjon rekke AMD3100 (n = 4, 3 µM ned 1.37 nM siste konsentrasjon i en 1/3 fortynning serie) ble utlevert på U87. CD4.CXCR4+ celler under det første steget av protokollen. Sammensatt da var lov å ruge med cellene for ~ 10 min da fluorescens signalet ble registrert kontinuerlig. Deretter 6,4 nM i CXCL12 (50 ng/mL, siste konsentrasjon) ble lagt til alle brønnene av cellen platen samtidig å indusere CXCR4-mediert Ca2 + mobilisering. Doseavhengig hemming av dette svaret av de forskjellige fortynninger av AMD3100 vises i figur 3A. I dette tilfellet vises bare delen av diagrammet etter tillegg av CXCL12. Som en negativ kontroll (blå linjen) bare buffer ble brukt i analysen (ingen pre-inkubering med AMD3100, ingen CXCL12 fordelt), noe som resulterer i forventede mangelen på respons. Positiv kontrollen (rød linje) tilsvarer eksemplene i hvilke 6.4 nM CXCL12 ble lagt til brønner uten forutgående inkubasjonstiden for AMD3100 (figur 3A). Basert på disse definert negative og positive styrer Z' verdien i denne analysen er vanligvis mellom 0,5 og 1. For å fastslå hemmende styrken på AMD3100 en dose-respons kurve ble generert av ikke-lineær regresjon resulterer i beregnede IC50 verdien 770.8 nM (figur 3B). For å ytterligere illustrere virkemåten til en inaktiv forbindelse, ble maraviroc inkludert i dette eksperimentet. Maraviroc er et lite molekyl spesielt hemme CC chemokine reseptoren 5 (CCR5) og blokkert (CCR5)-tropic HIV-1 smitte23 . Selv ved høy konsentrasjon (10 µM siste konsentrasjon) ble ingen hemmende effekten av dette sammensatte observert på CXCR4-mediert Ca2 + svar (figur 3A).
Til slutt, for å demonstrere at denne Ca2 + mobilisering analysen kan også brukes for å studere andre GPCRs, en seriell fortynning av CC chemokine ligand 5 (CCL5), endogen ligand for CCR5, ble lagt til celler som uttrykker CCR5 (U87. CD4.CCR5+) med nøyaktig samme eksperimentelle forhold og maskinvareinnstillinger. Doseavhengig fluorescerende Ca2 + svar er vist etter en seriell fortynning av CCL5 (Figur 3 c). I tillegg, og i motsetning til sin effekt på CXCR4, pre-inkubering med 100 hemmet nM (siste konsentrasjon) av maraviroc sterkt dette svaret (figur 3D).
Figur 1: skjematisk oversikt over analysens arbeidsflyt. Dagcellene 0 uttrykke GPCR rundt (i dette tilfellet CXCR4) er sådd i svart vegger 96-brønns plater med klart bunn og dyrkes over natten på 37 ° C og 5% CO2. På dag 1 utføres fluorescens-baserte Ca2 + analysen. Celler er først lastet med et fluorescerende Ca2 +-sensitive fargestoff (fluo-2 AM) og ruges i 45 min på RT i mørket. En "chemokine plate" og "sammensatt plate" tilberedes (PP = polypropylen). Etter inkubasjon med lasting fargestoff, skylt seeded celler når med analysebuffer (150 µL/vel) etter som 80 µL/vel av analysebuffer legges. Alle platene er deretter ruges i 5 min til enheten på 37 ° C før analysen. Deretter forbindelser av interesse (f.eks, små molekyler) er utlevert på ønsket konsentrasjonen i brønnene av måling plate og lov til å ruge ~ 10 min mens fluorescens måles kontinuerlig. Deretter en fast konsentrasjon av endogene Agonistiske av GPCR (her CXCL12) legges til fremkalle Ca2 + utgivelsen og fluorescens registreres videre over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Agonist aktiviteten til CXCL12 på CXCR4+ celler og spesifisitet av oppdaget svaret. (A) doseavhengig effekten av CXCL12 på Ca2 + Mobilisering i U87. CD4.CXCR4+ celler. (B) basert på Max-Min svar over planlagt mellom måling 84 og 243 en dose-respons kurve ble generert og EF50 verdien beregnet (n = 4, mener ± SD). (C) ingen svar ble indusert ved CXCL12 når det ble utlevert på U87. CD4 celler mangler CXCR4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Illustrasjon av effekten av en CXCR4 antagonist (AMD3100) og en inaktiv forbindelse (maraviroc) på CXCR4+ celler og aktivering av CCR5 av sin endogene Agonistiske, CCL5. (A) doseavhengig hemmende effekten av AMD3100 på Ca2 + mobilisering fremkalt av tilføyer 6.4 nM CXCL12 til U87. CD4.CXCR4+ celler. Maraviroc (på 10 µM siste konsentrasjon) viste ingen hemmende effekt på CXCL12-indusert Ca2 + svaret. (B) basert på Max-Min svaret over planlagt mellom måling 84 og 243, en hemmende dose-respons kurve ble generert og IC50 verdien beregnet til 770.8 nM (n = 4, mener ± SD). (C) doseavhengig aktivering av CCR5 av sin endogene Agonistiske, CCL5. (D) hemming av CCR5-mediert Ca2 + svaret av pre-inkubering cellene med 100 nM i maraviroc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ca2 +-mobilisering analysen beskrevet her har tidligere vist seg å være et verdifullt verktøy for å identifisere og karakterisere reseptor antagonister målretting CXCR417. Det er imidlertid forventet at denne metoden kan generelt brukes til en stor gruppe av andre GPCRs som utløser en cytosolic Ca2 + utgivelse på deres aktivisering, som illustrert for relaterte chemokine reseptoren CCR5. Mens nøyaktig samme eksperimentelle forhold kan brukes i CCR5, må flere trinn i protokollen (f.eks, celle nummer på plating, lasting av cellene med en fluorescerende farge) være re optimalisert før du overfører analysen til andre GPCRs for å oppnå en gunstig signal-til-støy-forhold. En viktig sak her er også valg av en egnet i vitro mobilnettet vert slik at høyt nivå uttrykk for GPCR av interesse og funksjonelle kopling til Ca2 + veien. Ved CXCR4, menneskelige glioblastom U87 celler ble valgt på grunn av: (1) mangel på endogene uttrykk for CXCR7 (en relaterte chemokine reseptor som opptar den samme Agonistiske som CXCR4), (2) deres evne til å CXCR4 aktivisering til Ca2 +-signalisering veien, (3) gunstige dynamiske område fluorescerende svaret innhentet etter lasting av cellene med Ca2 +-sensitive fargestoff, og (4) deres utmerket overholdelse av analysen plater minimere celle forstyrrelser i hele denne prosedyren. Alle disse parameterne må bestemmes eksperimentelt for hver romanen GPCR av interesse og hver mobilnettet uttrykk.
Når en lignende analysen for en annen GPCR, betraktes flere alternative fremgangsmåter eller reagenser i protokollen. For eksempel andre Ca2 +-sensitive fluorophores (f.eks, fluo-4, fluo-3) kan brukes som et alternativ til fluorophore (fluo-2) brukt i denne protokollen. Ved løst overholde celler, vasking av celler kan utelates ved å innføre no-vask fargestoffer for å minimere celle dislodging24. I tillegg vil unntatt vask trinnet fra protokollen ytterligere øke analysens produksjon. Selv om denne analysen kan også utføres med celler som viser endogene uttrykk for CXCR4, for eksempel inkludert flere typer menneskelig kreft cellen linjer10,25, bør det bemerkes at med stabilt transfekterte cellen linjer høy GPCR uttrykket nivåer som er stabil over tid kan oppnås. Dette vil resultere i mer uttalt analysen målinger, et større vindu for pålitelige data tolkning, og konsekvent analysen ytelse over lengre perioder. Når du bruker celler endogenously vil uttrykke CXCR4 det være mye vanskeligere å oppnå dette resultatet.
En stor ulempe for analysen er at den er avhengig av en fluorescens måling. Autofluorescent forbindelser kan derfor påvirke analysens måling, som utelukker dem fra analyse på grunn av upålitelige data tolkning. Også utføres denne Ca2 + mobilisering analysen ideelt med en mobil screening systemet utstyrt med en integrert pipettering system som lar standardisert miksing og dispension av forbindelser og reseptor Agonistiske inn i måling plate i alle brønnene samtidig. Analysen kan imidlertid tilpasses for bruk med andre, mindre dyre fluorescens microplate lesere med kinetic måling evner. Forbindelser og agonist så må utføres manuelt med flerkanals Pipetter, som vil øke hands-på tid og senker analysens produksjon. Videre, å få et tilsvarende antall fluorescens mål innenfor et gitt tidsintervall en kinetisk analysen ville være vanskelig å oppnå som mange microplate lesere måle signaler godt-av-godt mens high-end screening systemer måle alle brønner samtidig.
Reseptor antagonister hindre binding til reseptoren og påfølgende aktivering av endogene Agonistiske (CXCL12) for tiden utgjør den største kategorien av forbindelser spesielt rettet mot CXCR411,12. AMD3100, de små molekylet som illustrerer resultatene av Ca2 + mobilisering analysen, er en av de fremste eksemplene CXCR4 antagonister26. Foruten reseptor antagonister øke molekyler som regulerer GPCR signalering annerledes generell interesse. Disse molekylene er omvendt agonister, samt GPCR PAMs og NAMs19,20,27. En interessant funksjon for analysen beskrevet i dette manuskriptet er at det ikke bare kan identifisere reseptor antagonister, men også agonister og allosteric modulatorer. Noen mindre tilpasninger til analysen og begrensninger må imidlertid tas i betraktning.
PAMs og NAMs binde til receptor webområdene topografisk forskjellig fra webområdet for orthosteric-binding av reseptorens endogene ligand. Mens PAMs styrke til styrke og/eller effekten av reseptorens endogene ligand(s), hemme NAMs styrke og/eller effekt av endogene ligand(s)19,20. PAMs har ingen indre Agonistiske aktivitet. De er bare aktive i nærvær av den endogene Agonistiske, i motsetning til såkalte allosteric agonister. Fordi allosteric GPCR modulatorer vil fremkalle mindre bivirkninger enn klassisk reseptor antagonister når brukt i klinisk innstillinger28,29, er de verdifulle farmakologiske verktøy. I analysen vår, allosteric agonister vil fremkalle en forbigående økning av fluorescens umiddelbart etter tillegg til CXCR4+ celler. Reseptor spesifisitet av signalet skal deretter bestemmes ved å teste samme sammensatte med samme analysen, men på celler mangler CXCR4. Når spesielt screening for PAMs, bør en lavere konsentrasjon av endogene Agonistiske brukes i analysen for å indusere fluorescerende Ca2 + svar. Selv om denne lavere mengde Agonistiske vil generere et mindre fluorescerende signal, etterlater et større vindu å oppdage flere reseptor stimulering. Vanligvis velges en Agonistiske konsentrasjonen tilsvarer EF10- EC30 verdien av reseptor stimulering30,31. Tillegg av en PAM i første del av analysen vil ikke resultere i en økt fluorescerende måling. Imidlertid vil fluorescerende Ca2 + signalet etter påfølgende stimulering av reseptoren med sin endogene Agonistiske øke. Tilsvarende en NAM endrer ikke fluorescerende målingen før Agonistiske addisjon, men hemme reseptorens svar etter Agonistiske. Derfor vil aktivitet profilen en reseptor antagonist og en NAM ligne. Begge vil føre hemming av fluorescerende svaret etter Agonistiske. Derfor er videre eksperimentelle studier pålagt å forskjellsbehandle opptrer og en NAM. Her reseptor bindende studier der umerkede forbindelser konkurrere med en fast mengde merket CXCL12 for bindende på CXCR417,32 kan være en verdifull strategi for å skille mellom en antagonist, som ville hindre den merket Agonistiske fra binding til reseptoren og en NAM som ville ikke som det ville dele samme reseptor bindende område.
Ligand uavhengig (eller basale eller konstituerende) aktivitet av GPCRs har vært observert i mange GPCRs33 men basale aktivitetsnivået er vanligvis ganske lave når GPCRs er uttrykt recombinantly27. Basale GPCR aktivitet kan forsterkes av naturlig forekommende mutasjoner33 og en punkt mutasjon fører til økt basale CXCR4 aktivitet har vært beskrevet tidligere34. Koble denne constitutively aktive CXCR4 mutant til feromon svar veien i gjær og [35S] GTPγS binding eksperimenter, ble det vist at T140, en peptid-baserte CXCR4 antagonist med potente anti-HIV aktivitet17,35 betydelig redusert denne basale aktiviteten og dermed ble vist å oppføre seg som en omvendt Agonistiske34. Av notatet, i en Fura-2 fluorescens-baserte Ca2 + mobilisering analysen samme forfatterne observert en liten midlertidig nedgang i Ca2 +-relaterte fluorescens etter tillegg av T140 til celler som uttrykker mutant CXCR4, tyder på en nedgang på basale receptor aktivitet34. Men når analysere en ekstra panel av syklisk pentapeptide-baserte CXCR4 omvendt agonister designet fra T140, var oppdagelsen av redusert basale aktiviteten med en Ca2 + mobilisering analysen mindre grei36. Når effekten av T140 på celler som uttrykker vill-type CXCR4 ble analysert ved hjelp av Ca2 + mobilisering analysen som beskrevet i dette manuskriptet, ble ingen endring i basale fluorescens signalet observert17. Videre fluorescens svingningene er rask og forbigående og økninger i basale Ca2 + er for eksempel ikke observert i celler som uttrykker constitutively aktive Gαq-kombinert reseptorer4. Samlet ville effekten av inverse agonister være svært vanskelig, om ikke umulig å identifisere og evaluere pålitelig med våre analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Eric Fonteyn og Geert Schoofs for utmerket kundestøtte. Dette arbeidet har vært støttet av KU Leuven (gi nei. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, gir ingen. G.485.08), og Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).
