Summary
I denne protokollen beskriver vi en teknikk for å oppdage Zika virus spesifikke diagnostiske peptider ved hjelp av en høy tetthet peptid microarray. Denne protokollen kan readly tilpasses for andre fremvoksende infeksjonssykdommer.
Abstract
Høy tetthet peptid microarrays kan screening av mer enn seks tusen peptider i et enkelt standard mikroskopi lysbilde. Denne metoden kan brukes for medisiner, terapeutiske mål identifisering og utvikling av diagnostikken. Her presenterer vi en protokoll for å finne bestemte Zika virus (ZIKV) diagnostiske peptider ved hjelp av en høy tetthet peptid microarray. En humant serum prøve godkjent for ZIKV infeksjon ble inkubert med en høy tetthet peptid microarray som inneholder hele ZIKV protein oversatt 3,423 unike 15 lineær aminosyre (aa) rester med en 14-aa rester overlapping trykt i duplikat. Flekker med ulike sekundære antistoffer i samme array, oppdaget vi peptider som binder seg til immunglobulin M (IgM) og immunglobulin G (IgG) antistoffer i serum. Disse peptider ble valgt for ytterligere validering eksperimenter. I denne protokollen beskriver vi strategien følges for å utforme, behandle og analysere en høy tetthet peptid microarray.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnose basert på kliniske symptomer er utfordrende fordi den deler vektorer, Geografisk fordeling og symptomer med Dengue og Chikungunya virus infeksjon1. Gitt risikoen for uønskede svangerskap resultater i kvinner er smittet med ZIKV under graviditet, er det viktig å skille mellom 3 virus. Selv om gjeldende molekylær Diagnosetestene er bestemt, er de bare nyttig i blod eller spytt i løpet av relativt kort perioden akutt infeksjon2,3. Serologisk analyser er avgjørende for diagnosen utenfor denne første perioden av smitte4.
Utviklingen av en ZIKV bestemt serologisk analysen er utfordrende for to grunner: først Zika antigener som menneskets immunsystem reagerer ikke for øyeblikket kjent; og andre, konserverte flaviviruses amino acid sekvenser indusere antistoff kryssreaktivitet. Vårt mål var å oppdage unike ZIKV bestemt peptider som skal brukes i diagnostikk. Ulike tilnærminger har blitt utviklet til skjermen peptid biblioteker som dekker hele proteiner inkludert phage, bakteriell og gjær overflate vise5,6,7,8,9, 10. Vår strategi var å bruke en høy tetthet peptid microarray som tillater rask og rimelig høy gjennomstrømming serologisk screenings11,12 og senere identifisert peptidene kan brukes til å forbedre gjeldende serologisk analyser for gjenkjenning av ZIKV.
Denne protokollen kan oppdagelsen av Zika virus spesifikke diagnostiske peptider ved hjelp av en høy tetthet peptid microarray (figur 1). Høy tetthet peptid microarray er produsert ved hjelp av peptid laserutskrift teknologi. Hele ZIKV protein sekvensen bestående av 3,423 aminosyre rester basert på fransk polynesiske belastningen (GenBank: KJ776791.2), ble trykket på et standard glass lysbilde i blokker av 15 lineær rester med overlapping mellom 14 aminosyre rester i duplikat for en totalt 6,846 peptid flekker. I tillegg til hele Zika protein sekvens peptidene, microarray benytter influensa hemagglutinin (HA) peptider for internkontroll.
En Zika bekreftet positive serum utvalg fra Wadsworth Center (Albany, NY), ble brukt til å identifisere bestemte immunglobulin M (IgM) og immunglobulin G (IgG) reaktive peptider. Etter rugende med eksempelet over natten, var microarray farget med en sekundær fluorochrome konjugert antistoff (anti-menneskelige IgM eller anti-menneskelige IgG) og analysert på en microarray skanner. Kvantifisering av spot intensitet og peptid merknader ble utført med spesifikk programvare levert av samme firma som produserte microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse dataene er en del av en pågående studie utført ved New York University College odontologiske og ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret i New York University School of Medicine, til IRB # H10-01894. Klinisk prøver som brukes i denne studien var de identifiserte prøver tidligere brukt for diagnose og med tillatelse fra Wadsworth Center i New York State Department helse, Albany, NY.
1. installere ZIKV High-density peptid Microarray lysbilde i en bestemt inkubasjon skuff
- Håndtere av objektglass i kantene med Pudderfrie hansker. Skyve er glass 75.4 mm 25.0 mm og 1 mm tykk. Plassere lysbildet i inkubasjon skuffen med microarray overflaten grossist.
- Plass den blanke siden av segl vendt nedover på microarray trykte overflaten. For å sikre en god posisjon, overlappe skruehullene segl og bunnplate.
- Plass øverst i skuffen på seglet for å opprette et microarray kammer.
- Sikre lysbildet i skuffen ved å stramme like tommeskruene etter en hånd i en alternerende mønster fra øvre venstre etterfulgt av nede t.h.. Sett lokket på inkubasjon skuffen.
2. bakgrunn samhandling Detection: Flekker Microarray med sekundær antistoffer
Merk: Bruk en pipette innskudd løsninger (standard og blokkerer buffere, utvannet sekundære antistoffer) i hjørnet microarray kammeret.
- Inkuber microarray med en standard buffer (1 x fosfat bufret saltvann (PBS), 0,05% mellom 20, pH 7.4, filtrert med filtere 0,45 µm) (totalt antall 2000 µL/microarray) i 15 min ved romtemperatur (RT) på en orbital shaker på 140 rpm.
- Fjern standard bufferen ved aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret. Fylle tomme lysbildet holdere med tomme lysbilder å forhindre bryte microarray lysbildet.
- Blokkere microarray med blokkering bufferen (totalt volum på 2000 µL/microarray) for 60 min på RT på en orbital shaker på 140 rpm.
- Fjerne blokkering bufferen ved aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
- Inkuber microarray med sekundær antistoff, anti-IgM fluorochrome bøyd, fortynnes 1:5000 (totalt volum på 2000 µL/microarray) i den flekker buffer (10% blokkerer buffer i standard buffer) i 30 min på RT i mørket på en orbital shaker på 140 RPM.
- Fjern sekundær antistoffer av aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
- Vask microarray 3 x, 1 min per vask med standard buffer (totalt volum på 2000 µL/microarray på RT på en orbital shaker på 140 rpm. Etter hver vask, fjerne standard bufferen ved aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
- Fordype lysbilde 2 x i en nylaget dipping buffer (1 mM Tris, pH 7.4), (totalt volum på 200 mL).
- Tørke microarray nøye, for ca 1 min, ved aspirating overflødig væske nøye fra toppen til bunnen av lysbildet uten å ta på lysbildet. Analysere lysbildet i et microarray skanner reader.
3. eksponering av Microarray vert Serum
FORSIKTIG: Utføre dette trinnet under laboratorieforhold sikkerhet, grad 2 (BSL-2) på grunn av potensielle smittsomme serum-prøver. Arbeid i en klasse II biologiske sikkerhetskabinett kabinett (BSC).
- Deaktiver serum eksempel på 56 ° C i 30 min og sentrifuge på 16.000 rcf for 5 min 4 ° C13.
Merk: Bruk en pipette innskudd løsninger (flekker, standard buffer og utvannet serum) i hjørnet microarray kammeret. - Fortynne serum eksempel flekker buffer starter med en 1:1,000 (totalt volum på 2000 μL/microarray) fortynning. Hold det på 4 ° C før bruk.
- Inkuber microarray med flekker bufferen (totalt volum på 2000 μL/microarray) i 15 min på RT på en orbital shaker på 140 rpm.
- Fjerne flekker bufferen ved aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
- Inkuber microarray med fortynnet serum prøven overnatting på 4 ° C på en orbital shaker på 140 rpm.
- Fjerne utvannet serum prøven ved aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
- Vask microarray 3 x, 1 min per vask med standard buffer (totalt volum på 2000 μL/microarray på RT på en orbital shaker på 140 rpm. Etter hver vask, fjerne standard bufferen ved aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
4. farging med sekundær antistoffer og merket kontroll antistoffer
Merk: Bruk en pipette innskudd løsninger (standard buffere, utvannet videregående og etiketten antistoffer) i hjørnet microarray kammeret.
- Fortynne det sekundære antistoffet flekker bufferen.
Merk: Bruk anti-IgM fluorochrome konjugerte antistoffer eller anti-IgG fluorochrome konjugert antistoff på en fortynning av 1:5,000 (totalt volum på 2000 µL/microarray) i flekker buffer. - Mix kontroll etiketten antistoff (monoklonale anti-HA fluorochrome konjugert) på en fortynning av 1:1,000 (totalt antall 2 000 µL/microarray) i farging buffer med sekundær antistoff tidligere fortynnet i flekker buffer.
- Inkuber med microarray i 30 min på RT i mørket på en orbital shaker på 140 rpm.
- Fjern blanding av utvannet videregående og etiketten antistoffer av aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
- Vask 3 x med standard buffer (totalt volum på 2000 µL/microarray). Hver vask er for 1 min på en orbital shaker på 140 rpm. Etter hver vask, fjerne standard bufferen ved aspirating med en pipette fra hjørnet microarray kammeret.
5. Microarray skanning
- Fordype lysbilde 2 x i nylagde dipping buffer (1 mM Tris, pH 7.4) (totalt volum på 200 mL).
- Tørk microarray nøye, rundt 1 min, ved aspirating nøye fra toppen til bunnen av lysbildet uten å ta på lysbildet.
- Skanne microarray følge instruksjonene på skanneren. Sted i lysbildet på skanneren med den trykte overflaten grossist.
- Oppretter et nytt prosjekt og velger skanneområdet. Angi skanner parameterene idet: oppløsning: 21 µm, intensitet for både 700 og 800 nm kanaler: 7.0, skanning kvalitet: medium og forskyvning: 0,8.
- Skaffe og lagre søk rå bildet som en 16-biters gråtone-TIFF-filformatet.
6. Microarray analyse ved hjelp av en bestemt programvare
- Åpne rå bildet (TIFF-bilde). Åpne filen matrise rutenett.
- Juster matrise nettet for å skanne bildet med datamaskinens musen eller tastaturet piltastene.
- Velg "Kvantifisere utvalg" i det bestemte programmet, som skaper en avlesning fil som inneholder signal intensiteten for hver spot, bakgrunn verdien og tilsvarende peptid sekvensen.
Merk: Denne utdatafilen kan også importeres til et regnearkprogram for ytterligere analyse og grafer.
7. Microarray lagring
- Lagre microarray forseglet i mørket på 4 ° C oksygen gratis nitrogen eller argon gass.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene ved hjelp av protokollen beskrevet er vist i figur 2 og Figur 3. Ingen bakgrunn interaksjoner ble bemerket når pre flekker microarray med sekundær anti-human IgM (data ikke vist). Flekker med en anti-human IgM resulterte konjugert i flere områder over bakgrunnen grønn fluorescens intensitet, indikerer binding av disse peptider med IgM i vert serum utvalget (figur 2). IgG gjenkjenning (rød fluorescens signal) avslørte bare noen peptider (figur 2).
Den spesifikke programvaren levert av samme firma som produserte microarray analyserer microarray etter skanning. Filen avlesning opprettet inneholder signal intensiteten for hver spot, bakgrunn verdien og tilsvarende peptid sekvensen. Spot fluorescens intensiteter av hver peptid med en sterk reaksjon på IgM var visualisert ved å plotte grønne forgrunnen median verdier Hentet fratrukket bakgrunnen fra rå verdien (Figur 3).
Figur 1: Skjematisk viser analyseprosessen for høy tetthet peptid Microarray. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Peptid Microarray skannede bilder. Rå fluorescens bilder av flekker peptid microarray etter rugende med en ZIKV serum prøve utvannet 1:250. IgG reaktivitet er avbildet i rødt (venstre) og IgM reaktivitet vises i grønt (høyre). HA ramme kontroll peptider peptid microarray. Zoom paneler viser gruppen av peptider med høy fluorescens intensitet, som indikerer en sterk reaksjon på IgM eller IgG. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representant Zika Virus Epitope konsensus sekvens reagere med IgM i vert Serum utvalget. Grønne forgrunnen median verdier fra overlappende peptider var plottet i en graf. Peptider fra epitope konsensus sekvensen er uthevet i rødt. Peptid med høyeste fluorescens intensiteten er merket med fet skrift. Vektor basert grafisk design programvare ble brukt til å generere denne figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utviklet en protokoll som bruker en høy tetthet peptid microarray som inneholder hele Zika virus protein sekvensen (fransk polynesiske belastning). Microarray ble produsert av utskrift 3,423 ulike overlappende lineær peptider. Hver peptid var 15 aminosyrer og variert med bare én rester fra sin nærmeste nabo i rekkefølge (dvs., 14 rester overlapping). Selv om kortere overlapper kan skrives, er epitope kartlegging mer nøyaktig med lengre overlapper. Hver peptid ble trykt i duplikat for økt stabilitet.
Det er viktig å starte prosessen med pre flekker microarray med sekundær antistoffer oppdage mulig bakgrunn interaksjoner og skille dem fra prøven bestemt signalet. Bruke en bestemt blokkerer buffer er også viktig som andre blokkerer buffere som storfe Serum Albumin (BSA) eller tørrmelk pulver kan resultere i redusert signal intensitet. Et valideres serum eksempel for ZIKV IgM antistoffer ble først inkubert med microarray på 1:1,000, men ingen signal ble oppdaget. Etterfølgende inkubasjon på en lavere fortynning av 1:500 resulterte i en lav intensitet signalet fra peptider som reagerte med IgM antistoffer i utvalget. De beste resultatene ble oppnådd når Zika validert serum prøven ble utvannet på 1:250. Vi ikke retest serum prøven på en høyere konsentrasjon å unngå en økning av bakgrunnen. Forsiktig håndtering av microarray er avgjørende for å unngå riper microarray overflaten. Derfor løsningene slik oss utvannet serum og standard buffer er lagt til og fjernet fra hjørnet microarray kammeret. Også viktig for en vellykket resultatet er lysbildet bestemt inkubasjon skuffen levert av produsenten microarray, som er utformet slik at arbeider med minimal eksempel volumer. Brett er inkubasjon 13.0 cm 9,0 cm og 3 cm tykk. Det er 3 lysbilder utpekt hulrom i inkubasjon skuffen at assaying 3 forskjellige lysbilder samtidig. Men i dette eksperimentet brukte vi bare 1 lysbildet. Tom objektglass ble plassert i andre to cavities å balansere skuffen og forhindre bryte matrise lysbildet. Inkubasjon skuffen består av 4 deler: en bunnplate hvor lysbildene er plassert i utpekte hulrom; en sealer laget av silisium å skille hvert lysbilde fra de andre; en øvre del som inneholder tommeskruene vil bli fangstskuta med base platen og opprette microarray avdelingene legge løsninger for analysen som vaske bufferen eller serum prøven. Sealer og overdel unngå forurensning eller blanding av løsninger lysbilder. Den siste del-komponenten er lokk for å minimere risikoen for fordampning eller miljøforurensning prøvene. En orbital shaker er foretrukket å få optimal wetting og flekker forhold.
Avhengig av når virus infisert vert den resulterende bestemt Zika IgM kan antistoffer konsentrasjon i sera være høyt eller lavt. Derfor var det ventet at bruker en serum prøve med en høyere IgM konsentrasjon ville øke relative fluorescens signal intensiteten. Etter IgM, samme serum prøven ble inkubert på en fortynning av 1:250 med microarray, men en anti-menneskelige IgG ble brukt som sekundær antistoffer. Eventuelt kan annet antistoff klasser oppdages samtidig i den samme microarray bruker en blanding av sekundær antistoffer hver konjugert med forskjellige fluorescens fargestoffer. Den samme microarray kan være farget igjen med en mer konsentrert serum prøve hvis signalet intensitet er lav. Hvis lagret riktig til microarray er stabilt i flere måneder og kan eventuelt brukes igjen.
Kvantifisering av spot intensitet og peptid merknader ble utført ved hjelp av proprietær programvare fra produsenten microarray som også gir en ".psf" fil med malen matrise formatet. Den psf-filen er i hovedsak et rutenett som er justert til rå skanner bildet ved hjelp av proprietær programvare. En programvare algoritmen analyserer relative fluorescens intensiteter av hver spot i rå (intensitetsverdien stedets signal), bakgrunnen (estimert verdi av skyldes ikke-spesifikk bindende) og forgrunnen (trukket bakgrunnen fra rå verdi) signal. Også beregnes forgrunnen median verdier og samlet forgrunnen median tilsvarende middelverdien av to median spot verdiene i hver peptid i duplikat. I tillegg identifiserer programmet konsensus motiver/epitope i overlappende peptider. Alternativt signal intensiteter kan kvantifiseres microarray skannerprogramvaren og deretter bruke malen matrise formatet, peptid sekvensen kan identifiseres.
Etter denne protokollen, flere lovende peptid kandidater ble identifisert basert på fluorescens intensiteten. Påfølgende BLAST14 analyse ble brukt til å identifisere rester med potensielle kryssreaktivitet til andre flavivirus. Totalt 14 identifiserte peptider finnes bare i ZIKV som er identifisert i 3 proteom databaser. Et sekund serie av microarrays er planlagt som vil inneholde de valgte peptidene fra første rekke. Dette vil tillate testing flere godkjente eksemplarer i tillegg prøver fra mennesker smittet bare med flavivirus enn ZIKV for å bekrefte spesifisitet. For screening, vil vi tilpasse en ELISA analysen format, belegg platene med de valgte peptidene og testing bindingen til ZIKV spesifikke antistoffer i prøver fra mennesker serum og spytt.
ZIKV håndtering krever arbeider i grad 2 (BSL-2) anlegg15. Som vi jobbet med en serum prøve godkjent for ZIKV infeksjon jobbet vi i BSL-2 anlegget utfører alle prøve manipulering i en klasse II (eller høyere) biologiske sikkerhetskabinett kabinettet (BSC). Det er derfor vi inaktivert viruset oppvarming serum prøven på 56 ° C i 30 min før rugende prøven med microarray13. Etter varme inaktivering, det anbefales også fortsette å arbeide i BSL-2 anlegg med riktig god sikkerhet laboratoriepraksis å unngå sjansen for infeksjon.
Microarray at vi utformet inneholder bare lineær peptider og consequentially conformational epitopes som kan være verdifulle som diagnostikk kan ha vært savnet. Denne begrensningen kan adresseres ved hjelp av en høy tetthet microarray inneholder syklisk begrenset peptider som etterligner løkker epitope strukturer16. Denne protokollen kan raskt tilpasses til andre patogener fordi når protein sekvensen kalles en ny microarray kan utformes for oppdagelse av potensielle diagnostiske peptider. Det kan også tilpasses for andre programmer som biomarkør funnet17, antigen og epitope funn for vaksineutvikling eller terapeutiske mål18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dagens støtte er levert av en SBIR (Small Business Innovation Research) administrative supplement tilskudd fra NIDCRR44 DE024456. NIDCR HIV grant som utviklet seg ut av NIDCR gi U01 DE017855 for utvikling av en bekreftende point-of-care diagnose for HIV. Vi erkjenner takknemlig Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) for hennes kundestøtte og vennlig støtte. Vi takker også NYU Langone Medical Center for LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
- Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
