Summary
I detta protokoll beskriver vi en teknik för att upptäcka Zika virus specifika diagnostiska peptider med en hög densitet peptid microarray. Detta protokoll kan readly anpassas för andra framväxande infektionssjukdomar.
Abstract
Hög densitet peptid microarrays tillåta screening av mer än sex tusen peptider på en enda standard mikroskopi bild. Denna metod kan tillämpas för läkemedelsutveckling, terapeutiska target identifiering och utveckling av diagnostik. Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka specifika Zika virus (ZIKV) diagnostiska peptider med en hög densitet peptid microarray. Ett humant serumprov validerade för ZIKV infektion var inkuberas med en hög densitet peptid microarray som innehåller hela ZIKV proteinet översatt till 3 423 unika 15 linjär aminosyra (aa) rester med en 14-aa rester överlappning tryckt i två exemplar. Färgning med olika sekundära antikroppar inom samma matrisen, upptäckt vi peptider som binder till immunglobulin M (IgM) och immunglobulin G (IgG)-antikroppar i serum. Dessa peptider valdes för ytterligare validering experiment. I detta protokoll beskriver vi den strategi som följts för att utforma, bearbeta och analysera en hög densitet peptid microarray.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnos baserad på kliniska symtom utmanande eftersom den delar vektorer, geografisk spridning och symtom med denguefeber och Chikungunya virus infektion1. Med tanke på risken för oönskade graviditeter hos kvinnor som smittats med ZIKV under graviditet, är det viktigt att skilja mellan de 3 virus. Även de molekylära diagnostik testerna är specifika, är de endast användbar i blod eller saliv under den relativt korta perioden av akut infektion2,3. Serologiska analyser är väsentliga för diagnosen utanför denna inledande period infektion4.
Utvecklingen av en ZIKV specifika serologiska test är utmanande av två skäl: först, de Zika antigener som människans immunsystem reagerar på inte är för närvarande kända; och andra, bevarade flavivirus amino syra ordnar inducera antikroppar korsreaktivitet. Vårt mål var att upptäcka unika ZIKV särskilda peptider som ska användas i diagnostik. Olika metoder har utvecklats till skärmen peptid bibliotek som täcker hela proteiner inklusive phage, bakteriell, och jäst ytan Visa5,6,7,8,9, 10. Vår strategi var att använda en hög densitet peptid microarray som tillåter snabb och billig hög genomströmning serologiska filmvisningar11,12 och därefter de identifiera peptiderna kan användas för att förbättra nuvarande serologiska analyser för detektion av ZIKV infektion.
Detta protokoll kan upptäckten av Zika virus specifika diagnostiska peptider med en hög densitet peptid microarray (figur 1). Högdensitets peptid microarray producerades med hjälp av peptiden laser utskrift teknik. Hela ZIKV protein sekvensen bestående av 3 423 aminosyra rester baserat på den franska polynesiska stammen (GenBank: KJ776791.2), trycktes på en vanlig glasskiva i Block 15 linjär resthalter överlappning av 14 aminosyra rester i duplikat för en totalt 6.846 peptid ställen. Förutom hela Zika protein sequence peptiderna, microarray använder tredjeparts influensa hemagglutinin (HA) peptider för interna kontroller.
En Zika validerade positiva serumprov som erhållits från Wadsworth Center (Albany, NY), användes för att identifiera specifika immunglobulin M (IgM) och immunglobulin G (IgG) reaktiv peptider. Efter inkubation med provet över natten, var microarray målat med en sekundär fluorokrom konjugerad antikropp (anti-humant IgM eller anti-humant IgG), och analyseras på en microarray skanner. Kvantifiering av spot stödnivåer och peptid annotation utfördes med en särskild programvara som tillhandahålls av samma företag som tillverkat microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dessa data är en del av en pågående forskningsstudie som bedrivs vid New York University College of Dentistry och godkändes av den institutionella Review Board av den New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Kliniska prover som används i denna studie var avidentifierade prover som användes tidigare för diagnos och med tillåtelse från Wadsworth Center av New York State Department of Health, Albany, NY.
1. Installera den ZIKV High-density peptid Microarray Skjut i ett specifikt inkubation fack
- Hantera glasskiva av skarpa kanter med puderfria handskar. Glas bild måtten är 75,4 mm av 25.0 mm och 1 mm tjock. Placera bilden i inkubation facket med microarray ytan vänd uppåt.
- Placera den blanka sidan av försegla nedåt på microarray tryckt yta. För att säkerställa en bra position, överlappa skruvhålen av tätningen och bottenplattan.
- Placera den övre delen av magasinet på tätningen till skapa en microarray kammare.
- Säkra bilden i facket genom att dra åt lika skruvarna efter varandra för hand i ett alternerande mönster från övre vänster följt av lägre rätt. Placera locket på fackets inkubation.
2. bakgrund interaktion Detection: Färgning av Microarray med sekundära antikroppar
Obs: Använd en pipett för att deponera lösningarna (standard och blockering buffertar, utspädda sekundära antikroppar) i hörnet av microarray kammaren.
- Inkubera i microarray med en standard buffert (1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 0,05% Tween-20, pH 7,4, filtreras med ett 0,45 µm filter) (hela 2 000 µL/microarray) under 15 minuter vid rumstemperatur (RT) i orbitalskak vid 140 rpm.
- Ta bort standard bufferten genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren. Fyll tomma bild innehavare med tomma bilder att förhindra brytandet av microarray bilden.
- Blockera microarray med det blockerande buffert (total volym av 2 000 µL/microarray) för 60 min på RT i orbitalskak vid 140 rpm.
- Ta bort det blockerande buffert genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
- Inkubera i microarray med sekundära antikroppar, anti-humant IgM fluorokrom konjugerat, utspädd 1: 5.000 (total volym av 2 000 µL/microarray) i färgningen buffert (10% blockerande buffert i standard buffert) för 30 min vid RT i mörkret i orbitalskak på 140 RPM.
- Ta bort den sekundära antikroppen genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
- Tvätta microarray 3 x, 1 min per tvätt med standard buffert (total volym av 2 000 µL/microarray på RT i orbitalskak vid 140 rpm. Efter varje tvätt, ta bort standard bufferten genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
- Fördjupa bilden 2 x i en nylagad doppa buffert (1 mM Tris, pH 7,4), (total volym 200 ml).
- Torka microarray noga, för ca 1 min, av aspirering överflödig vätska mycket noggrant från toppen till botten av bilden utan att röra bilden ytan. Analysera bilden i en microarray scanner läsare.
3. exponering av Microarray värd Serum
FÖRSIKTIGHET: Utföra det här steget under laboratorieförhållanden säkerhet, biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) på grund av den potentiella smittrisken av serum exemplar. Arbete inom klass II biologiska säkerhetsdragskåp (BSC).
- Inaktivera serumprov vid 56 ° C i 30 minuter och centrifugera vid 16.000 rcf under 5 minuter vid 4 ° C13.
Obs: Använd en pipett för att deponera lösningarna (färgning, standard buffert och utspädda serum) i hörnet av microarray kammaren. - Späd serumprov i färgning buffert börjar med en 1:1,000 (total volym av 2 000 μL/microarray) utspädning. Förvara den i 4 ° C fram till användning.
- Inkubera i microarray med färgning bufferten (total volym av 2 000 μL/microarray) i 15 min på RT i orbitalskak vid 140 rpm.
- Ta bort färgning bufferten genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
- Inkubera i microarray med spädda serumprovet övernattning på 4 ° C i orbitalskak vid 140 rpm.
- Ta bort spädda serumprovet genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
- Tvätta microarray 3 x, 1 min per tvätt med standard buffert (total volym av 2 000 μL/microarray på RT i orbitalskak vid 140 rpm. Efter varje tvätt, ta bort standard bufferten genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
4. färgning med sekundära antikroppar och märkta kontroll antikroppar
Obs: Använd en pipett för att deponera lösningarna (standard buffertar, utspädda sekundär och etikett antikroppar) i hörnet av microarray kammaren.
- Späd den sekundära antikroppen i färgning bufferten.
Obs: Använd antihumana IgM fluorokrom konjugerade antikroppar eller anti-humant IgG fluorokrom konjugerad antikropp vid en spädning på 1:5,000 (total volym av 2 000 µL/microarray) i färgning buffert. - Blandning kontroll etikett antikropp (monoklonala anti-HA fluorokrom konjugerat) vid en spädningsgrad av 1:1,000 (total volym av 2 000 µL/microarray) i färgning buffert med sekundär antikropp tidigare utspätt i färgning buffert.
- Inkubera med microarray för 30 min vid RT i mörkret i orbitalskak vid 140 rpm.
- Ta bort blandningen av utspädda sekundär och etikett antikroppar genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
- Tvätta 3 x med standard buffert (total volym av 2 000 µL/microarray). Varje tvätt är för 1 min i orbitalskak vid 140 rpm. Efter varje tvätt, ta bort standard bufferten genom att aspirera med en pipett från hörnet av microarray kammaren.
5. Microarray skanning
- Fördjupa bilden 2 x till nylagad doppa buffert (1 mM Tris, pH 7,4) (total volym 200 ml).
- Torka microarray noga, ca 1 min, av aspirering mycket noggrant från toppen till botten av bilden utan att röra bilden ytan.
- Skanna den microarray följa instruktionerna för skannern. Placera bilden på skannern med den utskrivna ytan vänd uppåt.
- Skapa ett nytt projekt och väljer skanningsområdet. Scanner-parametrarna som: upplösning: 21 µm, intensitet för både 700 och 800 nm kanaler: 7,0, skanning kvalitet: medium och Offset: 0,8.
- Förvärva och spara scan raw-bild som en 16-bitars gråskala TIFF format.
6. Microarray analys med hjälp av en särskild programvara
- Öppna raw bilden (TIFF-bild). Öppna filen grid array.
- Anpassa rutnätet matris att skanna bilden med datorns mus eller tangentbord piltangenterna.
- Välj ”kvantifiera Selection” i den specifika programvara, vilket skapar en avläsning-fil som innehåller signal intensiteten för varje plats, bakgrunden värdet och motsvarande peptid sekvensen.
Obs: Denna utdatafilen kan också importeras till ett kalkylprogram för ytterligare analys och diagram.
7. Microarray lagring
- Lagra den microarray förseglade i mörker vid 4 ° C under syre fri kväve eller argon gas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultat som erhålls med hjälp av protokollet beskrivs visas i figur 2 och figur 3. Ingen bakgrund interaktioner noterades när före färgning i microarray med sekundära antihumana IgM (inga data anges). Färgning med en anti-humant IgM resulterade konjugat i flera områden över bakgrunden grön fluorescens stödnivåer, som anger bindningen av dessa peptider med IgM i värd serumprovet (figur 2). IgG-detektion (röd fluorescens signal) visade endast några peptider (figur 2).
Den specifika programvara som tillhandahålls av samma företag som tillverkat microarray analyserar microarray efter skanning. Den avläsning-fil som skapas innehåller signal intensiteten för varje plats, bakgrunden värdet och motsvarande peptid sekvensen. Spot fluorescens stödnivåerna varje peptid med en stark reaktion på IgM var visualiserat genom att rita de gröna förgrunden medianvärden erhålls efter subtrahera bakgrunden från raw värdet (figur 3).
Figur 1: Schematisk visar analysprocessen för högdensitets peptid Microarray. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Peptid Microarray skannade bilder. Råa fluorescens bilder av färgning av peptid microarray efter inkubation med ett ZIKV serum prov utspädda 1: 250. De IgG-reaktiviteten avbildas i rött (vänster) och IgM reaktiviteten visas i grönt (höger). HA inramar kontroll peptider den peptid microarray. Zooma paneler Visa grupp av peptider med hög fluorescence stödnivåer, som indikerar en stark reaktion på IgM eller IgG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representant Zika Virus epitop samförstånd sekvens reagerar med IgM i värd serumprovet. Gröna förgrunden Medianvärden från överlappande peptider var inritade i ett diagram. Peptider från sekvensen epitop konsensus är markerade i rött. Peptiden med högsta fluorescensintensiteten är markerade i fetstil. Vektoriserad grafisk design mjukvara användes för att generera denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utformade ett protokoll som använder en hög densitet peptid microarray som innehåller hela Zika virus protein sekvensen (franska polynesiska stam). Microarray tillverkades av utskrift 3 423 olika överlappande linjär peptider. Varje peptid var 15 aminosyror och varierade efter endast en rester från närmsta granne i sekvensen (dvs, 14 rester överlappning). Även om kortare överlappningar kan skrivas, är epitop mappning mer exakt med längre överlappningar. Varje peptid trycktes i dubblett att öka tillförlitligheten.
Det är viktigt att starta processen med före färgning microarray med sekundära antikroppen att upptäcka möjliga bakgrund interaktioner och skilja dem från provet specifika signalen. Använda en specifik blockerande buffert är också viktig som andra blockerande buffertar som bovint serumalbumin (BSA) eller torkad mjölk pulver kan resultera i minskad signalintensitet. En validerad serumprov för ZIKV IgM antikroppar var först inkuberas med microarray på 1:1,000 men ingen signal upptäcktes. Efterföljande inkubation vid en lägre utspädning av 1: 500 resulterade i en låg intensitet signal kommer från peptider som reagerade med IgM-antikroppar i provet. Bästa resultat erhölls när Zika validerade serumprovet var utspätt till 1: 250. Vi inte testa serumprovet vid en högre koncentration att undvika en ökning av den bakgrund signalen. Varsam hantering av microarray är viktigt att undvika att repa microarray. Därför lösningar sådan oss utspädd serum och standard buffert läggs till och tas bort från hörnet av microarray kammaren. Viktigt för ett lyckat resultat är också bild specifika inkubation facket som tillhandahålls av företaget som tillverkade den microarray, som är utformat för att arbeta med minimal provvolymer. Inkubation fack mått är 13,0 cm av 9,0 cm och 3 cm tjock. Det finns 3 bilder designerat håligheter i inkubation facket som tillåter testmetoder 3 olika bilder samtidigt. I detta experiment använde vi dock bara 1 bild. Tom objektglas placerades i de andra två håligheter att balansera facket och förhindra att bryta av array bilden. Inkubation facket består av 4 delar: en bottenplatta där bilderna är placerade i utsedda håligheter; en sealer som består av kisel att separera varje bild från de andra; en övre del som innehåller vingskruvarna för att gå med sealer med bottenplattan och skapa microarray kamrarna för att lägga till lösningar för analysen som att tvätta buffert eller serum prov. De sealer och övre delen undvika kontaminering eller blandning av lösningar mellan bilderna. Den sista avsnitt-komponenten är ett lock för att minimera risken för avdunstning eller miljöförorening av prover. Orbitalskak föredras att få optimal vätning och färgning villkor.
Beroende på när viruset infekterade värden resulterande specifika Zika IgM kan antikroppskoncentration i serum vara hög eller låg. Därför, det var väntat att använda ett serumprov med en högre IgM-koncentration skulle öka relativ fluorescensintensiteten signal. Efter IgM upptäckt, samma serumprov var inkuberas vid en spädningsgrad av 1: 250 med microarray, men en anti-humant IgG användes som sekundära antikroppen. Alternativt kan olika antikroppar klasser upptäckas samtidigt inom den samma microarray med en blandning av sekundära antikroppar varje konjugerad med olika fluorescens färgämnen. Den samma microarray kan färgas igen med en mer koncentrerad serumprov om signal intensiteten är låg. Om lagras korrekt microarray är stabil i flera månader och kan eventuellt användas igen.
Kvantifiering av spot stödnivåer och peptid anteckningar utfördes med hjälp av egenutvecklade programvara från företaget som tillverkade den microarray som även ger en ”.psf” fil med mallen av formatet array. Psf filen är i huvudsak ett rutnät som är anpassad till raw scanner bilden med den egenutvecklade programvaran. En programvara algoritm analyserar relativa fluorescens stödnivåerna varje plats i raw (intensitetsvärdet på platss signal), bakgrund (beräknade värdet för den signal som orsakas av icke-specifik bindning) och förgrund (subtraheras bakgrunden från raw värde) signal. Det beräknar också förgrunden medianvärden och sammanlagda förgrunden medianen motsvarar medelvärdet av de två spot medianvärden av varje peptid i två exemplar. Dessutom identifierar programvaran samförstånd motiv/epitop inom överlappande peptider. Alternativt, signal stödnivåer kan kvantifieras med microarray skannerprogramvara och sedan använda mallen av formatet array, peptid sekvensen kan identifieras.
Efter detta protokoll identifierades flera lovande peptid kandidater baserat på fluorescensintensiteten. Efterföljande BLAST14 analys användes för att identifiera rester med potentiella korsreaktivitet till andra flavivirus. Sammanlagt 14 identifierade peptider är närvarande endast i ZIKV som identifierats i 3 proteomet databaser. En andra serie av microarrays planeras som kommer att innehålla de valda peptiderna från den första matrisen. Detta gör att testa flera validerade exemplar samt prover från människor som smittats endast med flavivirus's än ZIKV för att bekräfta specificitet. För screening, kommer vi att anpassa ett ELISA test format, beläggning plattorna med de valda peptiderna och testar bindningen till ZIKV specifika antikroppar i humant serum och saliv prover.
ZIKV hantering kräver arbetar i biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) anläggning15. Som vi arbetade med serum prov validerade för ZIKV infektion vi arbetade i BSL-2 anläggning utför alla prov manipulation inom en klass II (eller högre) biologiska säkerhetsdragskåp (BSC). Det är därför vi inaktiverat virus värme serumprovet vid 56 ° C i 30 min innan ruvning provet med microarray13. Efter Värmeinaktivering, rekommenderas också fortsätta att arbeta i en BSL-2 anläggning med lämplig god laboratoriesed säkerhet att undvika risken för infektion.
Den microarray att vi utformat innehåller endast linjär peptider och följdriktigt konfirmerande epitoper som kan vara värdefull som diagnostik kan ha missats. Denna begränsning kan åtgärdas med hjälp av en hög densitet microarray som innehåller cykliska begränsad peptider som efterliknar loopas epitop strukturer16. Detta protokoll kan snabbt anpassas till andra patogener eftersom när sekvensen protein är känt en ny microarray kan utformas för upptäckt av potentiella diagnostiska peptider. Det kan också anpassas för andra applikationer såsom biomarkör identifiering17, antigen och epitop upptäckt för utveckling av vaccin eller terapeutiska mål18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Dagens stöd tillhandahålls av ett SBIR (Small Business Innovation Research) administrativa tillägg stipendium från NIDCRR44 DE024456. NIDCR HIV-anslaget som utvecklats ur NIDCR bevilja U01 DE017855 för utvecklingen av en bekräftande point-of-care-diagnostik för HIV. Vi erkänner tacksamt Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) för hennes tekniskt stöd och vänliga support. Vi tackar också NYU Langone Medical Center för LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
- Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
