Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Published: January 9, 2018 doi: 10.3791/56785
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Anatomical and Cellular Pathology, The Chinese University of Hong Kong, 2Li Ka Shing Institute of Health Sciences and Department of Medicine & Therapeutics, The Chinese University of Hong Kong

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنتاجها إسكات الجينات مورين ناغورني كاراباخ الخلايا باستخدام نظام تمايز خالية من التغذية للدراسة الميكانيكية في المختبر و في فيفو.

Abstract

تنتمي إلى نظام المناعة الفطرية الطبيعية القاتل من الخلايا (ناغورني كاراباخ) وهي الخط الأول لمكافحة سرطان المناعي دفاع؛ ومع ذلك، أنها تقمع في ورم المكروية والآلية الأساسية التي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. يحد عدم وجود مصدر متسقة وموثوق بها للخلايا ناغورني كاراباخ تقدم البحوث الحصانة خلية ناغورني كاراباخ. هنا، نحن التقرير في المختبر نظام التي يمكن أن توفر عالية الجودة والكمية المستمدة من نخاع العظم خلايا ناغورني كاراباخ مورين تحت شرط خالية من علبة التغذية بالورق. الأهم من ذلك، نبدي أيضا إسكات الجينات بوساطة siRNA أن يمنع نضوج الخلية E4bp4-تعتمد على ناغورني كاراباخ بنجاح باستخدام هذا النظام. وهكذا، هذه الرواية في المختبر ناغورني كاراباخ الخلية التفريق بين النظام حل مادة بيولوجية للبحوث الحصانة.

Introduction

تطور السرطان يعتمد إلى حد كبير على ورم المكروية1،2، بما في ذلك إيمونوسيتيس المستمدة من المضيف، مثلاً، خلايا ناغورني-كاراباخ. وأظهرت دراسات عدة أن ناغورني كاراباخ intratumoral الخلايا ترتبط سلبا مع3،4تطور الورم. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات السريرية أن ناغورني كاراباخ خلية العلاج التبني استراتيجية ممكنة للسرطان5،،من67،،من89. ناغورني كاراباخ المستندة إلى خلايا السرطان العلاج المناعي قد اقترح مؤخرا كخيار علاجي للأورام الصلبة، ولكن توجد تحديات بسبب إفراز السيتوكينات كآبته ودوونريجوليشن لتفعيل يغاندس في المكروية الأورام الصلبة 10،11. تحويل عامل النمو-بيتا (TGF-β) قد اقترح القيام بدور قمعية في التسرطن، ولكن من المفارقات أيضا إنتاج الخلايا السرطانية TGF-β1 لدعم التنمية ورم12،،من1314 , 15-مما يشير إلى TGF-β يمكن قمع النشاط عن ناغورني كاراباخ الخلايا عن طريق تنظيم أسفل استجابة انترفيرون ووساطة CD16 انترفيرون-غاما (IFN-γ) الإنتاج في المختبر16،17، 18.

على الرغم من أن قد يكون تعطل إشارات TGF-β في ورم المكروية طريقة ممكنة للقضاء على أمراض السرطان، حجب تماما مما يشير إلى TGF-β سوف يسبب أمراض المناعة الذاتية بسبب وظيفتها للالتهابات، كما يدل على ذلك وضع الآثار الجانبية الضارة بما في ذلك التهاب النظامية، تشوهات القلب والأوعية الدموية، والمناعة الذاتية في الماوس نماذج19. ومن ثم، فهم إليه العامل TGF-β-بوساطة الكبت المناعي سوف يؤدي إلى تحديد هدف العلاجية موجوداً لعلاج السرطان.

لتوضيح الأحداث الجزيئية الضرورية للتنمية الخلية ناغورني-كاراباخ، أنشأت ويليامز et al. نظاما في المختبر للتفريق بين الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام مورين في ناغورني كاراباخ الخلايا20. وييسر هذا النظام إلى حد كبير الدراسة الميكانيكية للتنمية الخلية ناغورني كاراباخ، بما في ذلك تحديد المتكفل رواية من ناغورني كاراباخ الخلايا21. ومع ذلك، ينبغي أن تكون مثقف المتكفل نخاع العظام في النظام مع دعم الخلايا اللحمية OP9 كتغذية طبقة20،21، ويحد هذا السكان خلية غير متجانسة إلى حد كبير تطبيق مزيد من تعطيل الجينات أدوات (مثلاً، إسكات الجينات بوساطة siRNA) المطبقة على وجه التحديد إلى تمييز الخلايا ناغورني-كاراباخ.

وهنا يصف لنا نظام خال من علبة التغذية بالورق الذي تم وضعه عن طريق زيادة تعديل النظام في المختبر وآخرونويليامز20. في نظامنا، وخلايا التغذية اللحمية OP9 غير مطلوبة، وبدلاً من ذلك OP9 يستخدم المتوسط الشرطي دون التأثير على التفريق بين ناغورني كاراباخ الخلايا في المختبر، وهذا مؤخرا يؤدي بنا إلى الكشف عن أن TGF-β غير قادرة على تعزيز تطور السرطان عن طريق قمع التنمية الخلية E4bp4-تعتمد على ناغورني كاراباخ في ورم المكروية22. ويوفر هذا النظام الرواية بنجاح أسلوب خال من الخلفية لتوضيح الآلية الجزيئية للتنمية الخلية ناغورني كاراباخ تحت شروط معينة (مثلاً، ارتفاع TGF-β1، إسكات الجينات بوساطة siRNA، إلخ.) في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

البروتوكول للحصول على والتفريق بين ناغورني كاراباخ المشتقة من نخاع العظم خلايا (بي أم-ناغورني كاراباخ) يستند إلى أساليب المنشورة سابقا20،،من2122. تمت الموافقة على جميع الإجراءات مع الفئران بالحيوان الأخلاقيات التجريبية اللجنة (الكنائس) في الجامعة الصينية في هونج كونج.

1-إعداد متوسطة الشرطي OP9

  1. الثقافة خط الخلية ستروما مورين OP9 في ألفا-الفنزويلية التي تحتوي على 20% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد من الهواء/CO2 (95%: 5 ٪).
    1. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير، ثم البذور 2 × 106 خلايا OP9 لكل قارورة الثقافة2 75 سم مع 15 مل متوسطة. الثقافة من أجل ح 48.
    2. عندما يصل الثقافة إلى التقاء 80%، يغسل قارورة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 20 مل متوسطة ألفا-الفنزويلية عادي (بدون FBS والمضادات الحيوية) كل قارورة.
  2. جمع المتوسطة شرط OP9 من قارورة الثقافة في 24 ساعة وتنظيف الحطام خلية مع 0.25 ميكرومتر بولييثيرسولفوني (PES) تصفية والحفاظ عليها عند 4 درجة مئوية (استخدم في غضون أسابيع 2).

2-عزل خلايا نخاع العظام الماوس

  1. Euthanize ماوس C57BL/6J عمرها 12 أسبوع مع جرعة بينتوباربيتوني (100 مغ/كغ، والحقن داخل). تأكيد وفاة بسبب عدم التنفس، ثم الحصاد عظام الفخذ مع قطع سكين جراحية في الوصلات بين العظام وإزالة العضلات المتبقية مع الشفرة بخدش لطيف.
  2. وضع العظام في أنبوب الطرد مركزي 50 مل يحتوي على ألفا العقيمة برود-الفنزويلية، وقم بتنفيذ الخطوات التالية في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  3. تجاهل المتوسطة ألفا-الفنزويلية، وشطف العظام مع الإيثانول 70% لمدة 30 ثانية.
  4. غسل العظام مع PBS العقيمة المثلج مرتين لتنظيف الإيثانول المتبقية.
  5. نقل العظام في قذيفة هاون تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، وفراجمينتيزي العظام برفق مع مدقة (لا يطحنون لهم).
  6. تحرض العظام برفق بدوامات المدقة إطلاق خلايا النخاع العظمى في برنامج تلفزيوني. جمع الخلايا نخاع العظام التي تحتوي على برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة.
  7. كرر الخطوة 2.6 لأربع مرات حتى تصبح شظايا العظام صلبة بيضاء اللون.
  8. الطرد المركزي الأنبوب في 465 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم تجاهل المادة طافية.
  9. ريسوسبيند بيليه مع 18 مل ماء المقطر المعقم والسماح لها الوقوف لمدة 30 ثانية لإزالة خلايا الدم الحمراء.
  10. إضافة 2 مل 10 المثلج X برنامج تلفزيوني التوقف عن رد فعل، ثم تصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة خلايا الدم الحمراء ليسيد.
  11. الطرد المركزي الأنبوب في 465 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه مع 20 مل من برنامج تلفزيوني المثلج.
  12. غسل الخلايا بتكرار الخطوة 2.11 مرة ثانية.
  13. نقل بيليه الخلية في 100 ملم معقمة بيتري طبق مع 10 مل من OP9 المتوسطة الشرطي من الخطوة 1، 2 وتستكمل مع 20% FBS وخليط من 0.5 نانوغرام/مليلتر مورين إيل-7, 30 نانوغرام/مليلتر الماوس صندوق إنقاذ الطفولة، و flt3L مورين يو/مليلتر 100.
  14. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 2 حاء نقل الخلايا فاتحة في وعاء ثقافة جديدة في كثافة 5 × 105 صالحة خلايا/مل (حساب عدد الخلايا التي هيموسيتوميتير مع استبعاد تريبان الأزرق) مع نفس الصيغة المتوسطة كما هو الحال في الخطوة 2، 13 ، واحتضان في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  15. في يوم 4، تستكمل تغيير شرط الثقافة المتوسطة الشرطي OP9 مع 20% FBS و 2,000 يو/مليلتر من مورين إيل-2.
  16. تحديث المتوسط الثقافة كل 3 أيام؛ يمكن الحصول عليها من يوم 7 ناضجة ناغورني كاراباخ الخلايا والمؤهلين كما هو الحال في القسم 4.

3-بوساطة siRNA سيلينسينج الجينات "التفريق بين الخلايا ناغورني كاراباخ"

  1. بريمكس siRNA أو هراء عنصر التحكم (NC) مع عامل تعداء وفقا لدليل المنتج.
  2. نفذ الخطوة 3.1 في أي وقت منذ اليوم 0.
  3. إضافة 50 نانومتر siRNA أو خليط NC للخلايا من الخطوة 2، 14.
  4. كرر الخطوة 3.1 على كل المرطبات متوسطة الحجم (مثلاً، اليوم 0 و 4 و 7) حتى نقطة النهاية التجريبية.

4-تحليل تمايز خلية ناغورني كاراباخ باستخدام التدفق الخلوي

  1. عند نقطة في وقت مناسب، بجمع التعليق للتفريق بين الخلايا وتغسل مع برنامج تلفزيوني المثلج.
  2. إصلاح الخلايا مع المخزن المؤقت لتثبيت الخلية وفقا لدليل المنتج.
  3. تغسل الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني المثلج، ومن ثم ريسوسبيند 1 × 106 خلايا في 100 ميليلتر من "التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت" الذي يتضمن مترافق Cy3 المضادة الماوس NKp46 ومترافق PE الأجسام المضادة CD244 المضادة الماوس في تخفيف نسبة 1: 100.
  4. وصمة عار العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ح 2.
  5. ريسوسبيند العينات الملون مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم الحصول على بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليلها مع سيتوبانك منصة20 (http://cytobank.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم الحصول على نتائج الممثل بعد وصف البروتوكول. كانت تزرع خلايا نخاع العظام مجموع تعليق تحت نظام التمايز خالية من علبة التغذية بالورق لمدة 11 يوما؛ ولوحظ زيادة كبيرة في معدل انتشار يوم 7 مقارنة مع عدد مجموع الخلايا في اليوم 0 (الشكل 1أ). عثر ناضجة ناغورني كاراباخ الخلايا مع ارتفاع نسبة النووي إلى هيولى ومورفولوجيا السيتوبلازم الحبيبية الغنية يوم 6 في النظام (الشكل 1ب).

وبغية توضيح تأثير تنظيمي مما يشير إلى TGF-β1/Smad3 في ناغورني كاراباخ الخلية التمايز، نخاع العظم خلايا تم transfected مع siRNA ضد E4bp4 مرناً (siE4bp4، الذي يمنع فعالية مستوى مرناً E4bp4 كما هو مبين في الشكل 2) أو هراء التحكم في اليوم 0 واليوم 4 في علبة التغذية بالورق-الخلية الحرة النظام. كانت مثقف الخلايا التفريق في النظام مع أو بدون المانع Smad3 SIS3 لمدة 6 أيام. تحليل تدفق ذلك ضربة قاضية للكشف عن E4bp4 إلى حد كبير قمعت نضوج الخلية ناغورني كاراباخ كما هو موضح بالتخفيض في CD244+ ve NKp46-ve خلايا غير ناضجة ناغورني كاراباخ بالمقارنة مع التحكم transfected نورث كارولاينا، في حين تثبيط تفعيل TGF-β1/Smad3 كبير ينقذ قمع siRNA بوساطة من ناغورني كاراباخ نضوج الخلية مقارنة مع مجموعة ترانسفيكتيد siE4BP4 (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1 . صورة ناغورني كاراباخ المشتقة من نخاع العظم خلايا من نظام تغذية خالية. (أ) النمو منحنى نخاع العظم خلايا ناغورني كاراباخ تمر الخلية التمايز في النظام حتى 11 يوما، تم الحصول عليها عن طريق خلية العد. (ب) تظهر الخلايا "الناضجة ناغورني كاراباخ" مع ارتفاع نسبة النووي إلى هيولى ومورفولوجيا السيتوبلازم الحبيبية الغنية يوم 6، كما هو مبين بالأسهم. التكبير 200 x، مقياس بار 50 البيانات تمثل يعني ± ووزارة شؤون المرأة للتجارب المستقلة 3، ميكرومتر. * * *ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . تأثير لإسكات الجينات siRNA بوساطة في نخاع العظم خلايا ناغورني كاراباخ تمر الخلية التمايز في يوم 6- تم transfected الخلايا مميزة مع مراقبة هراء (NC) أو siRNA لاستهداف مورين E4bp4 مرناً (siE4bp4) واليوم 0 4. PCR الوقت الحقيقي يظهر أن مستوى التعبير مرناً E4bp4 انخفاضا ملحوظا في سي-E4bp4 معاملة ناغورني كاراباخ الخلايا في يوم 6 مقارنة مع فئة NC. وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة للتجارب المستقلة 3، * *ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . تكميم أفواه E4bp4 يحول دون التفريق بين مورين المشتقة من نخاع العظم خلايا ناغورني كاراباخ بطريقة TGF-β1/Smad3-تعتمد على- (أ) التدفق الخلوي التحليل يبين أن ضربة قاضية ل E4bp4 يقلل إلى حد كبير من إنتاج خلايا غير ناضجة في ناغورني كاراباخ (CD244+ ve NKp46-ve) في يوم 6 مقارنة مع مجموعة التحكم (NC) هراء باستخدام خالية من تغذية نظام في المختبر ، الذي يمكن إنقاذهم بقمع تفعيل TGF-β1/Smad3 مع 1 ميكرومتر مثبط Smad3 SIS3 إلى حد كبير. (ب) التحديد الكمي لنتائج تحليل التدفق، * * *ف < 0.01 بالمقارنة مع نورث كارولاينا؛ ### ف < 0.01 بالمقارنة مع المجموعة ترانسفيكتيد siE4BP4. وترد بيانات تمثيلية من 3 التجارب المستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 1
التكميلية الرقم 1. النابضة استراتيجية لتحليل تدفق التعبير علامة الخلية ناغورني كاراباخ في التفريق بين مجموع الخلايا في يوم 6- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل، لقد قمنا بوصف طريقة جديدة لإنتاج المشتقة من نخاع العظم مورين ناغورني كاراباخ الخلايا في المختبر. وحدة تغذية الخلية في21،النظام الأصلي22 بنجاح محله المتوسطة الشرطي من الخلايا OP9، مما زاد إلى حد كبير في استقرار نظام التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، أن النظام يمكن أن تنتج كمية عالية ونقاء ناضجة ناغورني-كاراباخ الخلايا في المختبر كذلك في فيفو فحوصات، التي يمكن أن تيسر الدراسة الميكانيكية، فضلا عن البحوث متعدية الجنسيات من ناغورني كاراباخ الخلايا في الأمراض التي تصيب الإنسان.

وقد استخدمت الأسلوب وصف للتحقيق في الدور التنظيمي لإشارات TGF-β1 في قمع خلية ناغورني كاراباخ خلال السرطان التنمية23. كما كان هناك أي تأثير من الخلايا المغذية، هي إلى حد كبير تحسين كفاءة الجيني بوساطة siRNA ضربة قاضية، فضلا عن تثبيط المانع بوساطة. نظراً لغياب الخلايا المغذية OP9 يسمح لنا بجلاء وظيفة Smad3 البيولوجية في تطوير خلية E4BP4 بوساطة ناغورني كاراباخ، بإظهار ضربة قاضية أو تثبيط الجينات المستهدفة في المختبر23.

الأهم من ذلك، هذا النظام يمكن أن تستخدم كذلك لإنتاج كمية كبيرة من الخلايا ناغورني كاراباخ مورين المعدلة وراثيا لفحوصات في فيفو . على سبيل المثال، لقد أصدرنا على الأقل 1 × 108 خلايا ناغورني كاراباخ ناضجة من خلايا نخاع العظام ماوس واحدة بهذا النظام، وتم غرس الخلايا ناغورني كاراباخ بضربه قاضية لجين معين في الحاملة للورم إيماءة/مشمولان الماوس نموذج لإظهار الفرق في قتل السرطان آثار في فيفو23. في الواقع، يمكن أن يتم تعديلات أخرى على ناغورني كاراباخ الخلايا في هذا النظام، مثل المورثات الفيروسية بوساطة overexpression وتلطيخ الخلايا، إلخ.

ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الحد أقصى 70 في المائة من النضج ناغورني كاراباخ الخلايا يمكن أن تنتج من النظام في يوم 9 (البيانات لا تظهر)، الذي يشبه نتيجة لنظام مثقف مع OP9 stromal أبداه ويليامز وآخرون. 21 للتغلب على هذا التحديد، ناغورني كاراباخ الخلايا المختلطة يمكن أن تكون زيادة تنقية مع تدفق الفرز آلة، فضلا عن ناغورني كاراباخ التجارية خلية عزل مجموعات من أجل عزل السكان المطلوب.

وفي الختام، تم تطوير أسلوب جديد للتفريق بين ناغورني كاراباخ الخلايا من خلايا نخاع العظام مورين. يمكن أن توفر هذا النظام الرواية خياراً للحصول على درجة نقاء عالية وكمية الخلايا ناغورني كاراباخ ناضجة لدراسة الحصانة في الأمراض التي تصيب الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذه الدراسة كانت تدعمها في البحوث منح مجلس هونج كونج (لجنتي 468513، CUHK3/نموذج الإبلاغ الموحد/12R) والابتكار والتكنولوجيا صندوق هونغ كونغ (ITS/227/15، للبحث عن البرنامج النووي العراقي/164/16، للبحث عن-البرنامج النووي العراقي/242/16)، منحة مباشرة للبحوث-الصينية (2016.035)، وعلماء هونج كونج البرنامج.

حاء-Y.L. تصميم والإشراف على جميع التجارب وساهمت في إعداد مخطوطة. بعد الظهر-ك. ت. أجرى تجارب وتحليل البيانات، وساهمت في إعداد مخطوطة. رمز بريدي-ت. ت، ج. ي-نادي، س. ج. س.-جيم، حاء،-M.W.، وزاي-Y.L. جمع العينات الحيوانية وشاركت في التجارب على الحيوانات. ج. س.، عاشرا-الصحة الإنجابية، و F.T. ك. ساهمت في إعداد مخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OP9 cell line ATCC ATCC® CRL-2749™
MEM α, no nucleosides Gibco 22561021
Fetal Bovine Serum Gibco 10500064
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
Recombinant Murine IL-7 PEPROTECH 217-17
Recombinant Murine SCF PEPROTECH 250-03
Recombinant Murine Flt3-Ligand PEPROTECH 250-31L
Recombinant Murine IL-2 PEPROTECH 212-12
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 1377815
IC Fixation Buffer  eBioscience 00-8222-49
Flow Cytometry Staining Buffer  eBioscience 00-4222-26
PE-conjugated anti-mouse CD244 eBioscience 12-2441-83
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 Bioss bs-2417R-cy3
Nonsense control (NC) Ribobio siN05815122147
siRNA against mouse E4BP4 mRNA Ribobio N/A 5′-GAUGAGGGUGUA
GUGGGCAAGUCUU-3′

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
  2. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
  3. Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
  4. Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
  5. Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
  6. Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
  7. Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
  8. Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
  9. Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
  10. Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
  11. Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
  12. Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
  13. Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
  14. Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
  15. Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
  16. Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
  17. Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
  18. Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
  19. Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
  20. Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
  21. Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
  22. Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
  23. Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).

Tags

علم المناعة، العدد 131، ناغورني كاراباخ الخلية، خالية من علبة التغذية بالورق، والجينات إسكات، TGF-β1، التمايز، OP9
نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين <em>في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, P. M. K., Tang, P. C. T.,… More

Tang, P. M. K., Tang, P. C. T., Chung, J. Y. F., Hung, J. S. C., Wang, Q. M., Lian, G. Y., Sheng, J., Huang, X. R., To, K. F., Lan, H. Y. A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e56785, doi:10.3791/56785 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter