Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at masseproducere genhæmning murine NK celler ved hjælp af en feeder-fri differentiering system for mekanistisk undersøgelse in vitro og in vivo.
Abstract
Natural killer (NK) celler tilhører den medfødte immunsystem og er en første-line anti-cancer immun forsvar; men de undertrykkes i tumor mikromiljø og den underliggende mekanisme er stadig stort set ukendt. Manglen på en konsekvent og pålidelig kilde af NK celler begrænser forskning fremskridt af NK celler immunitet. Her rapporterer vi en in vitro- system, der kan give høj kvalitet og mængde af knoglemarv-afledte murine NK celler under en feeder-fri tilstand. Endnu vigtigere, vise vi også, at siRNA-medieret genhæmning held hæmmer E4bp4-afhængige NK celle modning ved hjælp af dette system. Denne roman in vitro- NK celler differentiere system er således en biomateriale løsning for immunitet forskning.
Introduction
Kræft progression er stort set afhængig af tumor mikromiljø1,2, herunder vært-afledte immunocytes, fx, NK-celler. Flere undersøgelser viste, at intratumoral NK celler er negativt korreleret med tumor progression3,4. Derudover viste kliniske undersøgelser, at NK adoptiv celleterapi er en mulig strategi for kræft5,6,7,8,9. NK cellebaserede cancer immunterapi foreslog for nylig som en terapeutisk mulighed for solide tumorer, men udfordringer findes som følge af udskillelsen af immunosuppressive cytokiner og downregulation for at aktivere ligander i mikromiljø af solide tumorer 10,11. Omdanne vækst faktor-β (TGF-β) er blevet foreslået til at spille en forebyggende rolle i carcinogenese, men paradoksalt nok kræftceller producerer også TGF-B1 til støtte for tumor udvikling12,13,14 , 15. TGF-β signalering kan undertrykke cytolytisk aktiviteten af NK celler via ned-regulering interferon lydhørhed og CD16-medieret interferon-gamma (IFN-γ) produktion in vitro-16,17, 18.
Selv om afbrydelse af TGF-β signalering i tumor mikromiljø kan være en mulig vej til at fjerne kræft, vil fuldstændig blokering af TGF-β signalering forårsage autoimmune sygdomme på grund af dets anti-inflammatoriske funktion, som det fremgår af udviklingen i bivirkninger herunder systemisk inflammation, modeller kardiovaskulære defekter og autoimmunitet i mus19. Dermed, forståelse arbejder mekanisme af TGF-β-medieret immunosuppression vil føre til identifikation af et tilgængeligt terapeutiske mål for behandling af kræft.
For at belyse de molekylære begivenheder nødvendige for NK celle udvikling, etableret Williams et al. en in vitro- system for differentiere murine knoglemarv hæmatopoietisk stamceller i NK celler20. Dette system letter i høj grad Mekanismestudier NK celle udvikling, herunder identifikation af roman stamfaderen til NK celler21. Men knoglemarv stamceller bør være kulturperler i systemet med støtte OP9 stromale celler som en feeder lag20,21, og denne heterogene cellen befolkningen i høj grad begrænser den videre anvendelse af gen-forstyrre værktøjer (fxsiRNA-medieret genhæmning) specifikt udlignet til de differentiering NK celler.
Her, beskriver vi en feeder-fri system, der er blevet udviklet af yderligere ændring i vitro system af Williams mfl20. I vores system, OP9 stromale feeder celler er ikke påkrævet, og i stedet OP9 betingede medium bruges uden at påvirke differentiering af NK celler in vitro-, og dette seneste føre os til at afdække, TGF-β er i stand til at fremme kræft progression via undertrykke E4bp4-afhængige NK celle udvikling i tumor mikromiljø22. Dette nye system med held giver en baggrund-fri metode til at belyse de molekylære mekanisme af NK celle udvikling under særlige betingelser (f.eks.høj TGF-B1, siRNA-medieret genhæmning, osv.) i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er for at opnå og differentiere knoglemarv-afledte NK celler (BM-NK) baseret på tidligere udgivne metoder20,21,22. Alle procedurer med mus er blevet godkendt af dyr etik eksperimentelle udvalg (AEEC) ved den kinesiske University of Hong Kong.
1. forberedelse af OP9 betingede Medium
- Kultur murine stroma cellelinje OP9 i alpha-MEM indeholdende 20% FBS, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin, ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af luft/CO2 (95%: 5%).
- Tælle celler med en hemocytometer, derefter frø 2 x 106 af OP9 celler til hver 75 cm2 kultur kolbe med 15 mL af medium. Kultur for 48 h.
- Når kulturen når 80% sammenløb, vaske kolben med 10 mL PBS og tilsættes 20 mL af almindeligt alpha-MEM medium (uden FBS og antibiotika) pr. flaske.
- Indsamle OP9 betingelse medium fra kultur kolben på 24 h, rydde op i celle debris med 0,25 µm polyethersulfone (PES) filter og bevare ved 4 ° C (brug inden for 2 uger).
2. isolering af musen knoglemarv celler
- Aflive en 12-uge-forhenværende C57BL/6J mus med en pentobarbitone overdosis (100 mg/kg, intraperitoneal injektion). Bekræft død ved manglende vejrtrækning, så høste lårben ben med en kirurgiske kniv skære i vejkryds mellem knoglerne og fjerne de resterende muskler med kniven ved blid ridser.
- Placer knoglerne i et 50 mL centrifugeglas indeholdende kølet sterile alpha-MEM, og udfør derefter følgende trin i en biosikkerhed kabinet.
- Kassér alpha-MEM-medium, og skyl knoglerne med 70% ethanol til 30 s.
- Vask knoglerne med iskold steril PBS to gange for at rydde op resterende ethanol.
- Overføre knogler i en morter, der indeholder 5 mL iskold PBS, og forsigtigt fragmentize knogler med en pistil (ikke male dem).
- Agitere knoglerne forsigtigt af hvirvlende pistil for at frigive knoglemarv celler i PBS. Indsamle PBS indeholdende knoglemarv celler i en ny 50 mL-centrifugerør.
- Gentag trin 2.6 for fire gange indtil knoglerester bliver solid hvid farve.
- Centrifugeres rør ved 465 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
- Resuspenderes med 18 mL sterilt, destilleret vand og lad det stå for 30 s til at fjerne røde blodlegemer.
- Der tilsættes 2 mL iskold 10 X PBS til at stoppe reaktionen, derefter Filtrer blandingen gennem en 70 µm celle si til at fjerne de lysed røde blodlegemer.
- Centrifugeres tube på 465 x g i 5 min. ved 4 ° C. Resuspenderes med 20 mL iskold PBS.
- Cellerne vaskes ved at gentage trin 2.11 en anden gang.
- Overføre celle pellet i en 100-mm steril petriskål med 10 mL af OP9 betingede medium fra trin 1.2 suppleret med 20% FBS og en blanding af 0,5 ng/mL murine IL-7, 30 ng/mL mus SCF og 100 U/mL murine flt3L.
- Inkuber parabol ved 37 ° C med 5% CO2 for 2 h. overførsel løstliggende cellerne i en ny kultur beholder med en tæthed på 5 x 105 levedygtige celler/mL (tælle celler af hemocytometer med trypan-blå udelukkelse) med den samme medium formel som i trin 2.13 , og der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
- Dag 4 suppleret ændre betingelsen kultur til OP9 betingede medium med 20% FBS og 2.000 U/mL af murine IL-2.
- Opdater næringssubstratet hver 3 dage; modne NK celler kan opnås ved dag 7 og kvalificeret som i punkt 4.
3. siRNA-medieret Gene Silencing af differentiering af NK celler
- Premix siRNA eller nonsens kontrol (NC) med en Transfektion agent efter produkt manual.
- Udføre trin 3.1 til enhver tid siden dag 0.
- Tilføje 50 nM siRNA eller NC blanding til cellerne fra trin 2.14.
- Gentag trin 3.1 på hvert medium forfriskning (f.eks.dag 0, 4 og 7) indtil den eksperimentelle slutpunkt.
4. analyse af NK Celledifferentiering bruger flowcytometri
- På et passende tidspunkt indsamle suspension af at differentiere celler og vask med iskold PBS.
- Fastsætte cellerne med celle fiksering buffer ifølge produkt manual.
- Fast cellerne vaskes med iskold PBS, og derefter resuspend 1 x 106 celler i 100 µL af Flow flowcytometri farvning Buffer indeholdende Cy3-konjugerede anti-mus NKp46 og PE-konjugerede anti-mus CD244 antistoffer i et fortyndingsforhold på 1: 100.
- Pletten prøven i mørke ved stuetemperatur i 2 timer.
- Resuspend farves prøverne med 300 µL af PBS, så erhverve FACS data og analyser med Cytobank platform20 (http://cytobank.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater opnås efter den beskrevne protokol. Samlede knoglemarv suspension celler blev dyrket under ordningen feeder-fri differentiering i 11 dage; betydelig forøgelse af spredning sats blev observeret af dag 7 sammenlignet med antallet samlede celler på dag 0 (fig. 1A). Modne NK celler med høj nuklear til cytoplasmatisk ratio og granula-rige cytoplasma morfologi blev fundet af dag 6 i systemet (figur 1B).
For at belyse den regulerende effekt af TGF-B1/Smad3 signalering i NK Celledifferentiering, knoglemarv celler blev transfekteret med siRNA mod E4bp4 mRNA (siE4bp4, som effektivt undertrykker E4bp4 mRNA niveau som vist i figur 2) eller noget vrøvl styre på dag 0 og dag 4 i feeder-celle gratis system. De differentiering celler blev kulturperler i systemet med eller uden Smad3 hæmmer SIS3 i 6 dage. Analyse af handelsstrømmen opdaget at knockdown af E4bp4 i vidt omfang undertrykt NK celle modning som vist ved reduktionen i CD244+ ve NKp46- ve umodne NK celler sammenlignet med NC-transfekteret kontrol, mens hæmning af TGF-B1/Smad3 aktivering betydeligt redder siRNA-medieret undertrykkelse af NK celle modning sammenlignet med gruppen siE4BP4-transfekteret (figur 3).
Figur 1 . Billede af knoglemarv-afledte NK celler fra feeder-fri system. (A) vækst kurve af knoglemarv celler undergår NK Celledifferentiering i systemet indtil dag 11, fremkommer ved cellen optælling. ()B) modne NK celler med høj nuklear til cytoplasmatisk ratio og granula-rige cytoplasma morfologi vises ved dag 6, som er angivet med pile. Forstørrelse 200 x, skala bar 50 µm. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM til 3 uafhængige forsøg, ***p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Effekten af siRNA-medieret genhæmning på knoglemarven cellerne undergår NK Celledifferentiering på dag 6. De differentiering celler blev transfekteret nonsens styring (NC) eller siRNA målretning murine E4bp4 mRNA (siE4bp4) på dag 0 og 4. Real-time PCR viser, at mRNA udtryk niveau af E4bp4 blev reduceret betydeligt i si-E4bp4 behandlet NK celler på dag 6 sammenlignet med gruppen NC. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM til 3 uafhængige forsøg, **p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Hæmning af E4bp4 hæmmer differentiering af murine knoglemarv-afledte NK celler i TGF-B1/Smad3-afhængige måde. (A) Flow flowcytometri analyse viser at knockdown af E4bp4 i høj grad nedsætter produktionen af umodne (CD244+ ve NKp46-ve) NK celler på dag 6 sammenlignet med nonsens kontrolgruppen (NC) ved hjælp af feeder-fri system in vitro- , som væsentligt kan reddes ved at undertrykke TGF-B1/Smad3 aktivering med 1 µM af Smad3 hæmmer SIS3. (B) kvantificering af analyseresultater flow ***p < 0,01 sammenlignet med NC; ### p < 0,01 sammenlignet med siE4BP4-transfekteret gruppe. Repræsentative data 3 uafhængige forsøg er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1. Gating strategi for flow analyse af NK celler markør udtryk i samlede differentiere celler på dag 6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det foreliggende arbejde, har vi beskrevet en ny metode til fremstilling af knoglemarv-afledte murine NK celler in vitro. Celle feeder i det oprindelige system21,22 erstattes med succes af den betingede medium af OP9 celler, som i høj grad øget differentiering systemets stabilitet. Derudover systemet kan producere høj mængde og renhed af modne NK celler til in vitro- samt in vivo assays, som kan lette Mekanismestudier samt Translationel forskning af NK celler i menneskelige sygdomme.
Den beskrevne metode har været brugt for at undersøge den regulerende rolle i TGF-B1 signalering i NK celle undertrykkelse under kræft udvikling23. Da der ikke var nogen indflydelse fra feeder celler, forbedret effektivitet af siRNA-medieret gen knockdown samt inhibitor-medieret hæmning i vid udstrækning. Fravær af feeder celler OP9 tillader os klart påvise den biologiske funktion af Smad3 i en E4BP4-medieret NK celle udvikling, ved at vise knockdown eller hæmning af target gener in vitro-23.
Endnu vigtigere, kan dette system udnyttes yderligere for at producere en stor mængde af genetisk modificerede murine NK celler for i vivo assays. For eksempel, vi har udarbejdet dette system mindst 1 x 108 modne NK celler fra knoglemarven cellerne i et enkelt museklik, og NK-celler med knockdown af et bestemt gen er blevet tilført i tumor-bærende NIKKE/SCID musemodel at demonstrere forskellen i kræft-drab effekter i vivo23. Ja, andre ændringer kan ske på NK-celler i dette system, såsom viral-medieret gen overekspression, celle farvning, osv.
Dog skal det bemærkes, at højst 70% af modne NK celler kan produceres fra systemet på dag 9 (data ikke vist), som ligner resultatet af kulturperler systemet med OP9 stromale vist af Williams mfl. 21 for at overvinde denne begrænsning, de blandede NK celler kan yderligere renses med et flow sortering maskine, såvel som kommercielle NK celle isolation kits for at isolere den ønskede befolkning.
Afslutningsvis, udviklet en ny metode for differentiering af NK celler fra murine knoglemarv celler. Dette nye system kan give en mulighed for at opnå høj renhed og mængden af modne NK celler for studiet af immunitet i menneskelige sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af den forskning tilskud Rådet af Hong Kong (GRF 468513, CRF-CUHK3-12R) og Innovation og teknologi fond i Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), direkte tilskud til forskning-CUHK (2016.035) og Hong Kong Scholar Program.
H.-Y.L. udviklet og overvåget alle eksperimenter og bidraget til manuskriptet forberedelse. P.M.-K.T. udførte eksperimenter, analyseres data og bidraget til manuskriptet forberedelse. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., Q.-M.W., og G.-Y.L. indsamlet animalske prøver og deltog i dyreforsøg. J.S., X.-R.H., og K.-F.T. bidraget til manuskriptet forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
