Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gen-silencing murine NK-Zellen durch ein Feeder-freie Unterscheidung System für mechanistischen Studie in Vitro und in Vivoin Serienfertigung herzustellen.
Abstract
Natürliche killer (NK) Zellen des angeborenen Immunsystems gehören und sind eine Erstlinien Anti-Krebs-Immunabwehr; aber sie werden in den Tumor Mikroumgebung unterdrückt und der zugrunde liegende Mechanismus ist noch weitgehend unbekannt. Das Fehlen einer einheitlichen und zuverlässigen Quelle von NK-Zellen begrenzt den Forschungsfortschritt NK Zelle Immunität. Hier berichten wir über eine in-vitro- System, die hohe Qualität und Quantität der Knochenmark-abgeleitete murinen NK-Zellen unter einem Feeder-freie Zustand zur Verfügung stellen kann. Noch wichtiger ist, zeigen wir auch, dass SiRNA-vermittelten Gen-silencing erfolgreich die E4bp4-abhängige NK Zelle Reifung hemmt durch den Einsatz dieses Systems. Somit ist diese neuartige in-vitro- NK-Zelle Unterscheidung System eine Biomaterial-Lösung für Immunitäts-Forschung.
Introduction
Tumorprogression ist weitgehend abhängig von den Tumor Mikroumgebung1,2, einschließlich Host abgeleitet Immunzellen, z.B., NK-Zellen. Mehrere Studien gezeigt, dass die intratumorale NK-Zellen mit dem Tumor Progression3,4negativ korreliert sind. Klinische Studien zeigten darüber hinaus, dass NK-Zell-Adoptiv-Therapie eine mögliche Strategie für Krebs5,6,7,8,9 ist. NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie wurde vor kurzem als eine Therapieoption bei soliden Tumoren vorgeschlagen, aber Herausforderungen gibt es durch die Sekretion von immunsuppressive Zytokine und Downregulation Liganden in der Mikroumgebung von soliden Tumoren zu aktivieren 10,11. Umwandlung Wachstumsfaktor-β (TGF-β) ist eine suppressive Rolle in der Karzinogenese vorgeschlagen worden, aber paradoxerweise Krebszellen produzieren auch TGF-β1 zur Unterstützung der Tumor Entwicklung12,13,14 , 15. TGF-β-Signalisierung kann die zytolytischen Aktivität von NK-Zellen über Down-Regulierung Interferon Reaktionsfähigkeit und CD16-vermittelten Interferon-Gamma (IFN-γ) Produktion in-vitro-16,17, unterdrücken 18.
Obwohl Störungen von TGF-β-Signalisierung in der Mikroumgebung Tumor eine Möglichkeit zur Beseitigung von Krebs sein kann, wird vollständige Sperrung der TGF-β-Signalisierung Autoimmunerkrankungen durch seine entzündungshemmende Funktion dazu führen, dass ausweislich der Entwicklung Nebenwirkungen einschließlich systemische Entzündung, modelliert Herz-Kreislauf-Mängel und Autoimmunität in Maus19. So wird Verständnis der Arbeitsmechanismus der TGF-β-vermittelten Immunsuppression zur Identifizierung einer zugänglichen therapeutisches Ziel für die Behandlung von Krebs führen.
Um die molekularen Ereignisse notwendig für NK-Zell-Entwicklung zu erhellen, gegründet Williams Et Al. eine in Vitro -System Differenzierung murinen Knochenmark hämatopoetischen Stammzellen in NK20Zellen. Dieses System erleichtert vor allem die mechanistische Untersuchung der NK-Zell-Entwicklung, einschließlich der Ermittlung der neuartigen Stammväter von NK-Zellen-21. Jedoch Knochenmark Stammväter sollten im System mit OP9 Stromazellen Stützzellen als ein Feeder Schicht20,21kultiviert werden, und diese heterogene Zellpopulation weitgehend beschränkt die weitere Anwendung der gen-Störung Werkzeuge (z.B., SiRNA-vermittelten Gen-silencing) speziell auf die differenzierenden NK-Zellen angewendet.
Hier beschreiben wir ein Feeder-freie System, das durch eine weitere Änderung der in-vitro- System von Williams Et Al20entwickelt wurde. In unserem System der OP9 Stromazellen Feeder-Zellen sind nicht erforderlich, und stattdessen OP9 bedingte Medium verwendet wird, ohne Auswirkungen auf die Differenzierung der NK Zellen in Vitro, und dies vor kurzem führen uns zu entdecken, dass TGF-β Tumorprogression über fördern kann E4bp4-abhängige NK-Zell-Entwicklung in den Tumor Mikroumgebung22zu unterdrücken. Dieses neuartige System bietet erfolgreich eine Hintergrund-freie Methode für die Aufklärung des molekularen Mechanismus der NK-Zell-Entwicklung unter bestimmten Bedingungen (z.B.hohe TGF-β1, SiRNA-vermittelten Gen-silencing, etc..) in Vitro.
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Protocol
Das Protokoll für Erhalt und Differenzierung Knochenmark stammenden NK Zellen (BM-NK) basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden20,21,22. Alle Verfahren mit Mäusen wurden durch das Tier Ethik experimentelle Ausschuss (AEEC) an der Chinese University of Hong Kong genehmigt.
1. Vorbereitung des OP9 bedingte Medium
- Kultur die murinen Stroma-Zell-Linie OP9 in Alpha-MEM mit 20 % FBS, 100 U/mL Penicillin G und 100 µg/mL Streptomycin, bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre von Luft/CO2 (95 %: 5 %).
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer, dann Samen 2 x 106 OP9 Zellen jeweils 75 cm2 Kultur Fläschchen mit 15 mL Medium. Kultur für 48 h.
- Wenn die Kultur Zusammenfluss von 80 % erreicht, waschen Sie die Flasche mit 10 mL PBS und 20 mL schlicht Alpha-MEM-Medium (ohne FBS und Antibiotika) pro Flasche.
- OP9 Zustand Medium aus der Kultur-Flasche um 24 Uhr zu sammeln, säubern Sie herauf Zellenrückstand mit 0,25 µm Polyethersulfone (PES) Filter und bewahren bei 4 ° C (Nutzung innerhalb von 2 Wochen).
2. Isolierung von Knochenmarkzellen Maus
- Eine 12 Wochen altes Baby C57BL/6J Maus mit einer Überdosis Pentobarbitone (100 mg/kg, intraperitoneale Injektion) einschläfern. Bestätigen Sie Tod durch das Fehlen der Atmung, dann ernten Sie die Femur-Knochen mit einer chirurgischen Messer schneiden an den Verbindungsstellen zwischen den Knochen und entfernen Sie die restlichen Muskeln durch sanfte Kratzen mit der Klinge zu.
- Legen Sie die Knochen in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen mit gekühlten sterile Alpha-MEM, und führen Sie dann die folgenden Schritte in eine biologische Kabinett.
- Das Alpha-MEM-Medium zu verwerfen, und spülen Sie die Knochen mit 70 % igem Ethanol für 30 s.
- Waschen Sie die Knochen mit eiskalten sterile PBS zweimal zu bereinigen, die restlichen Ethanol.
- Übertragen Sie die Knochen in einem Mörser mit 5 mL eiskaltem PBS und sanft fragmentize die Knochen mit einem Stößel (nicht pulverisieren sie).
- Schütteln Sie die Knochen sanft durch Umschwenken der Stößel um die Knochenmarkzellen in die PBS zu lösen. Sammeln Sie die PBS enthaltenden Knochenmarkzellen in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6 für vier Mal bis die Knochenfragmente leuchtet weiß in der Farbe geworden.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 465 X g für 5 min bei 4 ° C, dann verwerfen Sie den überstand.
- Aufschwemmen der Pellet mit 18 mL sterilem destilliertem Wasser und lassen Sie sie stehen für 30 s, rote Blutkörperchen zu entfernen.
- Fügen Sie 2 mL eiskaltes 10 X PBS, die Reaktion zu stoppen filtern dann die Mischung durch ein 70 µm Zelle Sieb lysierten Erythrozyten zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 465 X g für 5 min bei 4 ° C. Das Pellet mit 20 mL eiskaltem PBS aufzuwirbeln.
- Waschen Sie die Zellen wiederholen Schritt 2.11 ein zweites Mal.
- Übertragen der Zelle Pellet in ein 100 mm sterile Petrischale mit 10 mL OP9 bedingte Medium aus Schritt 1.2 ergänzt mit 20 % FBS und eine Mischung von 0,5 ng/mL murinen IL-7, 30 ng/mL Maus SCF und 100 U/mL murinen flt3L.
- Brüten der Schüssel bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 2 h Transfer ungebunden Zellen in eine neue Kultur-Behälter bei einer Dichte von 5 x 105 lebensfähige Zellen/mL (Anzahl Zellen durch Hemocytometer mit Trypan blau Ausgrenzung) mit der gleichen mittleren Formel wie in Schritt 2.13 , und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2.
- Am 4. Tag ergänzt Veränderung der Kultur Bedingung OP9 bedingte Medium mit 20 % FBS und 2.000 U/mL von murinen Il-2.
- Aktualisieren Sie das Kulturmedium alle 3 Tage; Reife NK-Zellen können durch Tag 7 gewonnen und qualifiziert wie in Abschnitt 4.
(3) SiRNA-mediated Gene Silencing von NK-Zellen unterscheiden
- Premix SiRNA oder Unsinn Steuerung (NC) mit einer Transfektion Agent nach dem Produkthandbuch.
- Führen Sie Schritt 3.1 zu jedem Zeitpunkt seit Tag 0.
- Fügen Sie die 50 nM von SiRNA oder NC-Mischung auf die Zellen aus Schritt 2.14.
- Wiederholen Sie Schritt 3.1 auf jedes Medium Erfrischung (z. B.Tag 0, 4 und 7) bis zum experimentellen Endpunkt.
4. Analyse der NK-Zell-Differenzierung mit Durchflusszytometrie
- Ein geeigneter Zeitpunkt die Aussetzung der Differenzierung von Zellen zu sammeln und mit eiskaltem PBS waschen.
- Befestigen Sie die Zellen mit Zelle Fixierung Puffer nach dem Produkthandbuch.
- Die festen Zellen mit eiskaltem PBS waschen und dann erneut 1 x 106 Zellen in 100 µL Flow Cytometry Färbung Puffer enthaltenden Cy3-konjugierten Anti-Maus NKp46 und PE-konjugierten Anti-Maus CD244-Antikörper in einem Verdünnungsverhältnis von 1: 100.
- Färben Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 h.
- Aufschwemmen der gefärbten Proben mit 300 µL PBS, dann FACS Daten erfassen und analysieren mit Cytobank Plattform20 (http://cytobank.org/).
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse nach dem beschriebenen Protokoll. Insgesamt Knochenmarkzellen Aussetzung wurden unter dem Zubringer-freie Unterscheidung System für 11 Tage kultiviert; deutlichen Anstieg der Proliferationsrate wurde von Tag 7 im Vergleich mit der Anzahl der gesamten Zellen am Tag 0 (Abb. 1A) beobachtet. Reife NK-Zellen mit hohen Kernenergie bis zytoplasmatischen Verhältnis und Granulat-reiche Zytoplasma Morphologie wurden von Tag 6 im System (Abbildung 1B) gefunden.
Um aufzuklären die regulierende Wirkung von TGF-β1/Smad3 Signalisierung in NK-Zell-Differenzierung, des Knochenmarks, die Zellen mit SiRNA gegen E4bp4 mRNA (siE4bp4, die E4bp4 mRNA-Ebene wirksam unterdrückt, wie in Abbildung 2gezeigt) oder Unsinn transfiziert wurden Steuern Sie am Tag 0 und Tag 4 in der Feeder-Zelle System frei. Die differenzierenden Zellen wurden in das System mit oder ohne Smad3 Inhibitor SIS3 für 6 Tage kultiviert. Flow-Analyse erkannt, dass Knockdown von E4bp4 weitgehend unterdrückt die NK-Zelle Reifung siehe durch die Reduzierung der CD244+ Ve NKp46- Ve unreifen NK-Zellen im Vergleich zu NC-transfizierten Kontrolle während Hemmung der TGF-β1/Smad3 Aktivierung deutlich rettet die SiRNA-vermittelten Unterdrückung der NK Zelle Reifung im Vergleich mit der siE4BP4-transfizierten Gruppe (Abbildung 3).
Abbildung 1 . Bild von Knochenmark stammenden NK Zellen aus dem Feeder-freie System. (A) Wachstum Kurve des Knochenmarks in NK-Zell-Differenzierung im System bis Tag 11 Zellen, durch Zellzählung erhalten. (B) Reife NK-Zellen mit hohen Kernenergie bis zytoplasmatischen Verhältnis und Granulat-reiche Zytoplasma Morphologie erscheinen von Tag 6, wie durch Pfeile angedeutet. Vergrößerung 200 x Skala Bar 50 µm. Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM für 3 unabhängige Experimente ***p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Wirkung von SiRNA-vermittelten Gen-silencing auf das Knochenmark Zellen in NK-Zell-Differenzierung am Tag 6. Die differenzierenden Zellen wurden mit Unsinn Steuerung (NC) oder SiRNA targeting murinen E4bp4 mRNA (siE4bp4) am Tag 0 und Tag 4 transfiziert. Real-Time PCR zeigt, dass die mRNA Ausdruck Niveau der E4bp4 an Tag 6 im Vergleich mit der NC-Gruppe in Si-E4bp4 behandelt-NK-Zellen deutlich reduziert wurde. Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM für 3 unabhängige Experimente, **p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Differenzierung der murinen Knochenmark stammenden NK-Zellen in einem TGF-β1/Smad3-abhängigen Weise hemmt Schweigen der E4bp4. (A) Flow Cytometry Analyse, dass Knockdown von zeigt E4bp4 weitgehend sinkt die Produktion von unreifen (CD244+ Ve NKp46-Ve) NK-Zellen am 6. Tag im Vergleich zu den Unsinn-Kontrollgruppe (NC) durch Verwendung von Feeder-freie in-vitro- , die deutlich durch die Unterdrückung von TGF-β1/Smad3 Aktivierung mit 1 µM Smad3 Inhibitor SIS3 gerettet werden können. (B) Quantifizierung der Flow-Analyse-Ergebnisse ***p < 0,01 verglichen mit NC; ### p < 0,01 im Vergleich mit siE4BP4-transfizierten Gruppe. Repräsentative Daten von 3 unabhängigen Experimenten werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 1. Anspritzung Strategie für Flow-Analyse von NK Zelle Marker Ausdruck bei der Unterscheidung von insgesamt am Tag 6 Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In der vorliegenden Arbeit haben wir eine neuartige Methode zur Herstellung von Knochenmark stammenden murinen NK Zellen in Vitrobeschrieben. Die Zelle Zuführung in das ursprüngliche System21,22 wird erfolgreich durch das Medium bedingte OP9 Zellen, die weitgehend die Stabilität des Systems der Differenzierung erhöht ersetzt. Darüber hinaus kann das System hohen Menge produzieren und Reinheit der Reife NK Zellen in Vitro als auch in Vivo Assays, die der mechanistischen Studie sowie die translationale Forschung von NK-Zellen im menschlichen Krankheiten erleichtern kann.
Das beschriebene Verfahren dient zur Untersuchung der Regulierungsfunktion der TGF-β1 Signalisierung in NK Zelle Unterdrückung während Krebs Entwicklung23. Da gab es keinen Einfluss aus den Feeder-Zellen, die Effizienz der SiRNA-vermittelten gen-Knockdown sowie Inhibitor-vermittelte Hemmung weitgehend verbessert werden. Das Fehlen der Feeder-Zellen OP9 lässt sich die biologische Funktion von Smad3 in der E4BP4-vermittelten NK Zelle Entwicklung verdeutlichen, indem den Zuschlag oder Hemmung der Ziel Gene in-vitro-23.
Noch wichtiger ist, kann dieses System weiter für die Herstellung einer großen Menge von gentechnisch veränderten murinen NK-Zellen für in-Vivo -Tests genutzt werden. Zum Beispiel haben wir mindestens 1 x 108 Reife NK-Zellen aus dem Knochenmarkzellen von einem einzigen Mausklick durch dieses System produziert, und der NK-Zellen mit Zuschlag eines bestimmten Gens wurden in Tumor-tragenden NOD/SCID Mausmodell zeigen den Unterschied in infundiert Krebs-Tötung Effekte in Vivo23. In der Tat können andere Modifikationen auf die NK-Zellen in diesem System, wie viral-vermittelten gen Überexpression, Zelle färben usw.erfolgen.
Allerdings sollte angemerkt werden, dass maximale 70 % der Reifen NK-Zellen aus dem System am Tag 9 (Daten nicht gezeigt), herstellbar sind, das ist ähnlich wie das Ergebnis des kultivierten Systems mit OP9 Stromazellen von Williams Et al.gezeigt. 21 um diese Einschränkung zu umgehen, können die gemischten NK-Zellen weiter mit einem Fluss Maschine sowie kommerzielle NK Zelle isoliert Kits zu sortieren, um die gewünschte Bevölkerung isolieren gereinigt werden.
Zusammenfassend ist eine neue Methode zur Differenzierung von NK-Zellen von murinen Knochenmarkzellen entwickelt. Dieses neuartige System kann eine Option für den Erhalt der hohen Reinheit und Menge von Reifen NK-Zellen für die Untersuchung der Immunität bei menschlichen Erkrankungen bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch die Research Grants Council of Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) und der Innovation und Technology Fund of Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), direkte Finanzhilfe für Forschung-CUHK (2016.035) und Hong Kong Gelehrter Programm.
H.-YL konzipiert und betreut alle Experimente und trugen zum Manuskript Vorbereitung. Uhr-k.t. Experimente durchgeführt, analysiert Daten und trugen zum Manuskript Vorbereitung. P.C.-T. T., D.S.-F.C., j.s.-C., H., f.-M.W., und G.-YL tierische Proben gesammelt und im Tierversuch teilgenommen. J.s., X.-R.H. und K.-f.t. zum Manuskript Vorbereitung beigetragen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
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