Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול בייצור המוני של ג'ין להחרשת תאי NK מאתר באמצעות מערכת בידול נטולת מזין עבור המחקר מכניסטית חוץ גופית בתוך ו ויוו.
Abstract
תאים (NK) רוצח טבעי שייכת מערכת החיסון המולדת, השורה הראשונה נגד סרטן מערכת החיסון הגנה; עם זאת, הם מדוכאים ב microenvironment הגידול, המנגנון הבסיסי הוא עדיין אינו מודע לקיומם. העדר מקור עקבית ומהימנה של תאי NK מגביל את התקדמות המחקר של חסינות התא NK. כאן, אנחנו מדווחים במבחנה מערכת שיכול לספק איכות גבוהה, כמות הנגזרות מח עצם של תאי NK מאתר בתנאי נטולת מזין. יותר חשוב, אנחנו גם להוכיח כי בתיווך siRNA ג'ין להחרשת בהצלחה מעכב ההבשלה התא NK תלויי-E4bp4 באמצעות מערכת זו. לפיכך, הרומן במבחנה NK תא זה המבדילים המערכת היא פתרון biomaterial למחקר חסינות.
Introduction
התקדמות סרטן תלוי במידה רבה הגידול microenvironment1,2, כולל המארח, נגזר immunocytes, למשל, תאי NK. מספר מחקרים הראו כי תאי NK intratumoral נמצאים בקורלציה שלילית עם3,התקדמות הגידול4. בנוסף, מחקרים קליניים הראו כי טיפול המאמצת בתאי NK היא אסטרטגיה אפשרית עבור סרטן5,6,-7,-8,-9. חיסוני סרטן המבוסס על תאי NK לאחרונה הוצע כאופציה טיפולית עבור גידולים מוצקים, אך אתגרים קיים בשל ההפרשה של ציטוקינים לדיכוי המערכת החיסונית ואת downregulation של הפעלת ליגנדים ב- microenvironment של גידולים מוצקים 10,11. שינוי צורה של גורם גדילה-β (TGF-β) הוצע כדי לשחק תפקיד מדכאים carcinogenesis, אבל באופן פרדוקסלי תאים סרטניים גם לייצר TGF-β1 כדי לתמוך את הגידול פיתוח12,13,14 , 15. TGF-β איתות יכול לדכא את פעילות תאי NK באמצעות ויסות מטה תגובתיות אינטרפרון, בתיווך CD16 אינטרפרון-גמא (IFN-γ) ייצור במבחנה16,17, cytolytic 18.
למרות שיבוש TGF-β איתות ב microenvironment הגידול עשוי להיות דרך אפשרית עבור ביטול סרטן, חוסמת לחלוטין TGF-β איתות יגרום מחלות אוטואימוניות בשל תפקידה אנטי דלקתיות, כפי שמעידים על התפתחות תופעות לוואי כולל דלקת מערכתית, מומי לב וכלי דם, מחלת חיסון עצמי עכבר מודלים19. לפיכך, הבנת מנגנון העבודה של TGF-β-מתווכת החיסוני תוביל אל זיהוי מטרה טיפולית נגישים לטיפול בסרטן.
התירי את האירועים המולקולריים הדרושים להתפתחות תאי NK, וויליאמס. ואח הקימה מערכת במבחנה כי להבדיל מאתר מח עצם תאי גזע hematopoietic לתוך NK תאים20. מערכת זו מקלה במידה רבה בחקר התפתחות התא NK, כולל זיהוי אבות הרומן של תאי NK21מכניסטית. עם זאת, צריך להיות תרבותי המוצא לאגס מח עצם במערכת עם תמיכה OP9 סטרומה תאים כמו מזין שכבה20,21, ומגביל אוכלוסייה הטרוגנית תא זו במידה רבה יישום נוסף של שיבוש גנטי כלים (למשל, בתיווך siRNA ג'ין להחרשת) שימושית במיוחד לתאי NK המבדילים.
כאן נתאר מערכת נטולת מזין, שפותחו על-ידי המערכת במבחנה של וויליאמס ואח20שינוי נוסף. במערכת שלנו, תאי סטרומה מזין OP9 אינם נדרשים, ולהוביל במקום OP9 המדיום המותנה משמש מבלי להשפיע על הבידול של NK תאים במבחנה, ואת זה לאחרונה לנו לחשוף כי TGF-β הוא לקדם התקדמות סרטן באמצעות פיתוח המדכאים של התא NK תלויי-E4bp4 microenvironment גידול22. מערכת חדשנית זו מספקת בהצלחה שיטה ללא רקע שחקרתי את המנגנון המולקולרי התפתחות תאי NK תחת תנאים מסוימים (למשל, גבוהה TGF-β1, בתיווך siRNA ג'ין להחרשת, וכו.) במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול עבור קבלת, המבדילים NK הנגזרות מח עצם תאים (מוניטור-NK) מבוסס על שיטות שפורסמו בעבר20,21,22. כל ההליכים עם עכברים אושרו על ידי החיה אתיקה ניסיוני הוועדה (AEEC) באוניברסיטה הסינית של הונג קונג.
1. הכנת המדיום המותנה OP9
- תרבות משתית מאתר תא בשורה OP9 אלפא-מ המכיל 20% FBS, U/mL 100 פניצילין G ו סטרפטומיצין µg 100/mL, ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של אוויר/CO2 (95%: 5%).
- לספור את התאים עם hemocytometer, ואז זרע 2 x 106 תאים OP9 את הבקבוק תרבות2 כל 75 ס מ עם 15 מ"ל של מדיום. תרבות במשך 48 שעות.
- התרבות מגיעה למפגש 80%, לשטוף את הבקבוק עם 10 מ"ל של PBS ולהוסיף 20 מ"ל של מדיום אלפא-מ רגיל (ללא FBS ואנטיביוטיקה) לכל את הבקבוק.
- לאסוף את המדיום תנאי OP9 מן הבקבוק תרבות-24 שעות ביממה, לנקות את שאריות תאים עם מסנן polyethersulfone (פסי) מיקרומטר 0.25 ולשמר ב 4 ° C (שימוש בתוך 2 שבועות).
2. בידוד תאי מח עצם העכבר
- המתת חסד עכבר C57BL/6J בן 12 בשבוע מנת יתר pentobarbitone (100 מ"ג/ק"ג, הזרקת בקרום הבטן). לאשר את מותו על ידי חוסר נשימה, ואז לקצור את העצמות עצם הירך עם חיתוך סכין כירורגית בצמתים שבין עצמות, להסיר את השרירים הנותרים עם הלהב על ידי גירוד עדין.
- מניחים את העצמות שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל המכיל אלפא סטרילי צונן-מ, ולאחר מכן בצע את הפעולות הבאות באבטחה ארון.
- ביטול המדיום אלפא-מ, ולשטוף את העצמות עם 70% אתנול ל 30 s.
- לשטוף את העצמות עם PBS קר כקרח סטרילי פעמיים כדי לנקות האתנול הנותרים.
- העברת עצמות מרגמה המכילה 5 מ של PBS קר כקרח, בעדינות fragmentize העצמות עם כבעלי (לא pulverize אותם).
- להתסיס את העצמות בעדינות על ידי מתערבל את המרוסקים כדי לשחרר את התאים במח העצם לתוך מגניב. איסוף תאי מח עצם המכיל PBS לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש.
- חזור על שלב 2.6 עבור ארבע פעמים עד שברי עצם הופכים לבן, מוצק בצבע.
- Centrifuge את הצינור ב- g x 465 עבור 5 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר עם 18 מ ל מים מזוקקים סטריליים, ומשהים 30 s כדי להסיר תאי דם אדומים.
- להוסיף 2 מיליליטר 10 קר כקרח PBS X כדי לעצור את התגובה, ואז לסנן את התערובת דרך מסננת תא מיקרומטר 70 להסרת כדוריות דם אדומות lysed.
- Centrifuge את הצינור ב- g x 465 עבור 5 דקות ב 4 º C. Resuspend בגדר עם 20 מ של PBS קר כקרח.
- לשטוף את התאים באמצעות חזרה שלב 2.11 בפעם השנייה.
- להעביר בגדר תא 100-מ מ עקר פטרי עם 10 מ"ל של המדיום המותנה OP9 מהשלב 1.2 בתוספת 20% FBS ותערובת של 0.5 ng/mL 7-IL מאתר 30 ננוגרם למ"ל העכבר SCF, 100 flt3L מאתר U/mL.
- דגירה המנה ב 37 ° C עם 5% CO2 ח' 2 העברת תאי כעיגולים בצבע לתוך מיכל תרבות חדשה-צפיפות של 5 x 105 קיימא תאים למ"ל (ספירת תאים על-ידי hemocytometer עם הדרה trypan-כחול) עם אותה נוסחה בינוני כמו שלב 2.13 , דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2.
- יום 4, שינוי התנאי תרבות המדיום המותנה OP9 בתוספת 20% FBS ו- 2,000 U/mL של מאתר il-2.
- רענון המדיום תרבות כל 3 ימים; תאי NK בוגר יכול להיות מתקבל על ידי 7 יום, מוסמך כמו סעיף 4.
3. siRNA בתיווך גנים Silencing של תאי NK המבדילים
- Premix siRNA או שטויות הפקד (NC) עם סוכן תרביות תאים על פי ההדרכה של המוצר.
- בצע את שלב 3.1 בכל נקודת זמן מהיום 0.
- להוסיף את ה-50 nM של siRNA או תערובת NC לתאים מהשלב 2.14.
- חזור על שלב 3.1 על כל כיבוד בינונית (למשל, היום 0, 4 ו- 7) עד נקודת הסיום ניסיוני.
4. ניתוח של התא NK בידול באמצעות Cytometry זרימה
- בנקודת זמן מתאים, לאסוף את התליה של הבחנה תאים ולשטוף עם PBS קר כקרח.
- לתקן את התאים באמצעות מאגר קיבוע תאים על פי המדריך המוצר.
- לשטוף את התאים קבוע עם PBS קר כקרח ולאחר מכן resuspend עונה 1 פרק 106 תאים µL 100 של Flow Cytometry מכתים מאגר המכיל Cy3 מצומדת אנטי עכבר NKp46 ו- PE-מצומדת העכבר אנטי CD244 נוגדנים על יחס דילול בטחונות.
- כתם המדגם בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
- Resuspend הדגימות ויטראז'ים עם 300 µL ל- PBS, ולאחר מכן לרכוש FACS הנתונים ולנתח עם Cytobank פלטפורמה20 (http://cytobank.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות נציג מתקבלים בעקבות הפרוטוקול המתואר. תאים במח העצם הכולל ההשעיה היו מעובדות תחת מערכת מזין ללא בידול למשך 11 ימים; עלייה משמעותית בשיעור התפשטות נצפתה על ידי יום 7 לעומת מספר התאים הכולל ביום 0 (איור 1א'). תאי NK בוגרת עם יחס גבוה גרעיני כדי cytoplasmic, מורפולוגיה ציטופלזמה עשירה גרגר נמצאו ביום 6 במערכת (איור 1B).
כדי להבהיר את השפעת הרגולציה TGF-β1/Smad3 איתות ב NK תאית התמיינות, מח עצם התאים היו transfected עם siRNA נגד E4bp4 mRNA (siE4bp4, אשר ביעילות מדכאת את רמת E4bp4 mRNA כמוצג באיור2) או שטויות לשלוט ביום 0 וביום 4 בתא-המזין ללא מערכת. התאים המבדילים היו תרבותי במערכת עם או בלי Smad3 מעכב SIS3 ל-6 ימים. ניתוח תזרים זיהה את נוקאאוט של E4bp4 במידה רבה דיכא ההבשלה התא NK כפי שמוצג על ידי הפחתת בתאים CD244+ ve NKp46- ve לא בוגר NK לעומת שליטה NC-transfected, ואילו עיכוב של הפעלת TGF-β1/Smad3 מציל באופן משמעותי בתיווך siRNA דיכוי התבגרות התא NK לעומת הקבוצה siE4BP4 transfected (איור 3).
איור 1 . התמונה של מח עצם-derived NK תאים ממערכת נטולת מזין. (א) צמיחה עקומה של מח העצם תאי העובר התמיינות תאי NK במערכת עד 11 יום, שהושג על ידי ספירת תאים. (B) תאי NK בוגרת עם יחס גבוה גרעיני כדי cytoplasmic, מורפולוגיה ציטופלזמה עשירה גרגר מופיעים ביום 6, המסומנים על ידי חצים. ההגדלה 200 x, סולם בר 50 מיקרומטר. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM לניסויים עצמאית 3, * * *p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . השפעת בתיווך siRNA ג'ין להחרשת על מח העצם תאי NK עוברת תאית התמיינות ביום 6- התאים המבדילים היו transfected עם שטויות שליטה (NC) או siRNA מיקוד E4bp4 מאתר mRNA (siE4bp4) ביום 0 וביום 4. PCR בזמן אמת מראה כי ה-mRNA רמת הביטוי של E4bp4 פחתו משמעותית בתאי NK סי-E4bp4 מטופלים ביום 6 לעומת הקבוצה NC. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM לניסויים עצמאית 3, * *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . וכמובן E4bp4 מעכב התמיינות התאים מאתר הנגזרות מח עצם NK באופן TGF-β1/Smad3-תלויי- (א) לזרום cytometry ניתוח מציגה את נוקאאוט של E4bp4 במידה רבה מפחית את ייצור תאי NK (CD244+ ve NKp46-ve) לא בוגר ביום 6 לעומת קבוצת הביקורת (NC) שטויות באמצעות מזין ללא מערכת במבחנה , אשר יכול להינצל באופן משמעותי על-ידי דיכוי הפעלה TGF-β1/Smad3 עם 1 מיקרומטר של מעכב Smad3 SIS3. (B) כימות של תוצאות ניתוח תזרים, * * *p < 0.01 לעומת NC; ### p < 0.01 לעומת קבוצה siE4BP4 transfected. נציג נתונים של ניסויים עצמאית 3 מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1. Gating אסטרטגיה עבור ניתוח תזרים של תאי NK סמן ביטוי המבדילים הכולל תאים יום 6- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנת העבודה הנוכחית, תארנו שיטה להפקת הנגזרות מח עצם מאתר NK תאים בתוך חוץ גופית. התא המזין21,המערכת המקורית22 מוחלף בהצלחה על-ידי המדיום המותנה של תאים OP9, שהגדילה במידה רבה את היציבות של המערכת בידול. בנוסף, המערכת יכולה לייצר כמות גבוהה, טוהר NK בוגרת תאי במבחנה , כמו גם ויוו מבחני, אשר יכול להקל את המחקר מכניסטית, כמו גם המחקר translational תאי NK במחלות אנושיות.
השיטה המתוארת שימש עבור חוקרים את התפקיד הרגולציה של TGF-β1 איתות של דיכוי תאי NK במהלך התפתחות סרטן23. כפי שהיתה השפעה מתאי מזין, היעילות של siRNA בתיווך גנים, כמו גם עיכוב בתיווך מעכב במידה רבה משופרות. העדר של התאים מזין OP9 מאפשר לנו בבירור להדגים את הפונקציה הביולוגי של Smad3 בפיתוח תאי NK בתיווך E4BP4, על ידי הצגת נוקאאוט או עיכוב של גנים במבחנההיעד23.
חשוב מכך, מערכת זו יכול להיות עוד יותר מנוצל לייצור כמות גדולה של תאי NK מאתר מהונדסים עבור מבחני ויוו . לדוגמה, הפקנו לפחות עונה 1 פרק 108 בוגרת תאי NK מתאי מח העצם של עכבר אחת באמצעות שיטה זו, תאי NK עם נוקאאוט של גנים מסוימים היו שאנרגית נושאות הנד/SCID דגם העכבר כדי להדגים את השוני סרטן-הרג אפקטים ויוו23. אכן, ניתן לבצע שינויים אחרים על תאי NK במערכת זו, כגון נגיפי בתיווך גנים ביטוי, צביעת תאים, וכו '.
עם זאת, יצוין כי מקסימום 70% תאי NK בוגרת ניתן להפיק מן המערכת ביום 9 (נתונים לא מוצג), אשר דומה לתוצאה של מערכת תרבותית עם OP9 סטרומה המוצגות על-ידי וויליאמס ואח. 21 כדי להתגבר על מגבלה זו, תאי NK מעורבים נוספים יטוהר עם זרם מיון מכונה, כמו גם מסחרי NK תא אלייזה על מנת לבודד את האוכלוסייה הרצוי.
לסיכום, שיטה חדשה עבור המבדילים תאי NK מתאי מח עצם מאתר מפותחת. מערכת חדשנית זו יכולה לספק אפשרות להשגת טוהר גבוהה וכמות תאי NK בוגרת לצורך המחקר של חסינות למחלות אנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מחקר מלגות המועצה של הונג קונג (GRF 468513, CUHK3/crf לניסויים קליניים/12R) ואת החדשנות, קרן הטכנולוגיה של הונג קונג (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), גרנט ישירה מחקר-CUHK (2016.035), מלומד הונג קונג תוכנית.
ה-י. ל תוכנן כל ניסויים מבוקרים, תרמה הכנת כתב היד. אחה צ-K.T. ביצע ניסויים, ניתחו נתונים, תרמה הכנת כתב היד. פי. סי-טי טי, J.Y.-יונייטד, י. ס-ג, ה, ש- M.W., ג-י. ל אספו דגימות בעלי חיים, השתתף בניסויים על בעלי חיים. י. ס, ר. י-ה, ק. ס. ז תרם הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
