Summary
Aquí, presentamos un protocolo para producir en masa las células murinas de silenciamiento génico NK usando un sistema de diferenciación libre de alimentador para estudios mecanísticos in vitro e in vivo.
Abstract
Natural killer (NK) las células pertenecen al sistema inmune innato y son una defensa inmune de primera línea contra el cáncer; sin embargo, se suprimen en el microambiente del tumor y el mecanismo subyacente es todavía desconocido. La falta de una fuente constante y confiable de las células NK limita el progreso de la investigación de la inmunidad de la célula NK. Aquí, Divulgamos un sistema en vitro que puede proporcionar alta calidad y la cantidad de médula ósea murina las células NK en una condición libre de alimentador. Más importante aún, demostramos que con éxito mediada por siRNA silenciamiento inhibe la maduración de la célula NK E4bp4 dependientes mediante el uso de este sistema. Así, esta novela en vitro NK célula diferenciando el sistema es una solución de biomaterial para la investigación de la inmunidad.
Introduction
La progresión del cáncer depende en gran medida de la tumor microambiente1,2, incluyendo immunocytes derivados de host, por ejemplo, las células NK. Varios estudios demostraron que las células NK intratumoral están negativamente correlacionadas con la progresión de tumor3,4. Además, los estudios clínicos demostraron que la terapia adoptiva con células NK es una posible estrategia para cáncer5,6,7,8,9. Inmunoterapia de cáncer basado en la célula NK fue sugerida recientemente como una opción terapéutica para tumores sólidos, pero existen desafíos debido a la secreción de citocinas inmunosupresoras y downregulation de la activación de ligandos en el microambiente de tumores sólidos 10,11. Transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) se ha sugerido para desempeñar un papel represivo en la carcinogénesis, pero paradójicamente las células cancerosas también producen TGF-β1 para apoyar el desarrollo de tumor12,13,14 , 15. señalización de TGF-β puede suprimir la actividad citolítica de las células NK a través de la abajo-regulación de la respuesta de interferón y CD16 mediada por interferón-gamma (IFN-γ) producción en vitro16,17, 18.
Aunque interrupción de señalización de TGF-β en el microambiente del tumor puede ser una forma para eliminar el cáncer, bloqueando totalmente la señalización de TGF-β causará enfermedades autoinmunes debido a su función antiinflamatoria, según lo evidenciado por el desarrollo de efectos secundarios adversos incluyendo la inflamación sistémica, defectos cardiovasculares y autoinmunidad en ratones modelos19. Por lo tanto, comprender el mecanismo de trabajo de inmunosupresión mediada por el TGF-β conducirá a la identificación de una diana terapéutica accesible para tratar el cáncer.
Para dilucidar los eventos moleculares necesarios para el desarrollo de las células NK, Williams et al. estableció un sistema in vitro para diferenciar células madre hematopoyéticas de médula ósea murina en NK células20. Este sistema facilita en gran medida el estudio mecanicista del desarrollo de las células NK, incluyendo la identificación de nuevos progenitores de las células NK21. Sin embargo, los progenitores de médula ósea se deben cultivar en el sistema con el apoyo de las células stromal OP9 como un alimentador capa20,21, y esta población celular heterogénea limita en gran medida el uso adicional de alterar gen herramientas (p. ej., silenciamiento génico mediado por siRNA) específicamente aplicada a las células NK diferenciadoras.
Aquí, describimos un sistema libre de alimentación que ha sido desarrollado por más modificar el sistema en vitro de Williams et al20. En nuestro sistema, las células stromal alimentador de OP9 no están obligatorio, y en su lugar OP9 medio condicional se utiliza sin afectar a la diferenciación de las células NK en vitroy recientemente nos llevan a descubrir que el TGF-β es capaz de promover la progresión del cáncer a través de suprimir el desarrollo de las células NK E4bp4 dependientes del microambiente tumoral del22. Este novedoso sistema con éxito proporciona un método libre de antecedentes para dilucidar el mecanismo molecular del desarrollo de las células NK en condiciones específicas (p. ej., alta TGF-β1, mediada por siRNA silenciamiento, etcetera.) en vitro.
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Protocol
El protocolo para la obtención y diferenciación NK médula ósea células (BM-NK) se basa en métodos previamente publicados20,21,22. Todos los procedimientos con los ratones han sido aprobados por el Animal ética Experimental Comité (AEEC) en la Universidad China de Hong Kong.
1. preparación del medio condicional OP9
- Cultura de la línea de celular del estroma murino OP9 en alfa-MEM que contiene 20% FBS, 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL, a 37 ° C en una atmósfera humidificada de aire/CO2 (95%: 5%).
- Contar las células con un hemocitómetro, luego semilla 2 x 106 células OP9 a cada frasco de cultivo de 75 cm2 con 15 mL de medio. Cultivo de 48 h.
- Cuando la cultura llega a 80% de confluencia, lavar el matraz con 10 mL de PBS y añadir 20 mL de llano medio alfa-MEM (sin antibióticos y FBS) por frasco.
- Recoger medio OP9 condición del frasco de cultivo a las 24 h, limpieza de restos celulares con 0.25 μm filtro de polyethersulfone (PES) y conservar a 4 ° C (dentro de 2 semanas de uso).
2. aislamiento de células de médula ósea de ratón
- Eutanasia el ratón C57BL/6J 12 semanas de edad con una sobredosis de compuesto (100 mg/kg, inyección intraperitoneal). Confirman muerte por la falta de respiración, luego recoger los huesos de fémur con un corte de cuchillo quirúrgico en las uniones entre los huesos y retirar los músculos restantes con la hoja rascado suave.
- Colocar los huesos en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene alfa-MEM estéril enfriado y luego realice los siguientes pasos en un gabinete de bioseguridad.
- Deseche el medio alfa-MEM y enjuague los huesos con etanol al 70% durante 30 s.
- Lavar los huesos con PBS estéril helado dos veces para limpiar el etanol restante.
- Transferencia de los huesos en un mortero que contenga 5 mL de PBS helado y suavemente fragmentan los huesos con un mortero (no les pulverizar).
- Agite los huesos suavemente agitando la mano del mortero para liberar las células de médula ósea en el PBS. Recoger las células de la médula ósea que contiene PBS en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.
- Repita el paso 2.6 para cuatro veces hasta que los fragmentos de hueso sólido blanco en color.
- Centrifugar el tubo a 465 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado con 18 mL de agua destilada estéril y dejar reposar durante 30 s para eliminar las células de sangre rojas.
- Añadir 2 mL de helado 10 X PBS para detener la reacción, luego filtrar la mezcla por un colador de celular de 70 μm para eliminar los eritrocitos sometidos a lisis.
- Centrifugar el tubo a 465 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con 20 mL de PBS helado.
- Lavar las células repetir paso 2.11 una segunda vez.
- Transferir el precipitado de células en un 100 mm estériles caja Petri con 10 mL de medio condicional OP9 de paso 1.2 suplementado con 20% FBS y una mezcla de 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL ratón SCF y 100 U/mL flt3L murino.
- Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO2 para 2 h. transferencia las células sueltas en un nuevo contenedor de cultivo a una densidad de 5 x 105 células viables/mL (conteo de células por hemocitómetro con exclusión azul de tripano) con la misma fórmula medio como en el paso 2.13 e incubar a 37 ° C con 5% CO2.
- El día 4, cambio la condición de la cultura al medio condicional OP9 había suplementado con 20% FBS y 2.000 U/mL de IL-2 murino.
- Refrescar el medio de cultivo cada 3 días; células NK maduras pueden ser obtenidas por día 7 y calificadas como en sección 4.
3. mediada por siRNA Gene Silencing de diferenciación de las células de NK
- Mezcla preparada de antemano del siRNA o absurdo control (NC) con un agente de transfección según el manual del producto.
- Realizar paso 3.1 en cualquier momento desde el día 0.
- Agregar los 50 nM de siRNA o mezcla de NC a las células de paso 2.14.
- Repita el paso 3.1 en cada refresco mediano (p. ej., día 0, 4 y 7) hasta el punto final experimental.
4. Análisis de la diferenciación de las células NK mediante citometría de flujo
- En un momento apropiado recoger la suspensión de diferenciar las células y lavar con PBS helado.
- Fijar las células con buffer de fijación celular según el manual del producto.
- Lavar las células fijas con PBS helado y luego resuspender 1 x 106 células en 100 μl de tampón de tinción de citometría flujo con Cy3-conjugado anti-ratón NKp46 PE-conjugado anti-ratón CD244 anticuerpos y en una relación de dilución de 1: 100.
- Mancha de la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.
- Resuspender las muestras teñidas con 300 μL de PBS, luego adquirir datos FACS y analizar con Cytobank plataforma20 (http://cytobank.org/).
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Representative Results
Resultados representativos se obtienen siguiendo el protocolo descrito. Las células de suspensión total de la médula se cultivaron bajo el sistema de diferenciación alimentador-libre durante 11 días; se observó aumento significativo en la tasa de proliferación por día 7 en comparación con el número de células totales en el día 0 (figura 1A). Las células NK maduras con alto cociente nuclear a citoplasmática y citoplasma rico en gránulos morfología fueron encontradas por día 6 en el sistema (figura 1B).
Para aclarar el efecto regulador del TGF-β1/Smad3 señalización en la diferenciación de las células NK, las células fueron transfectadas con siRNA contra E4bp4 mRNA (siE4bp4, que suprime con eficacia nivel de mRNA E4bp4 como se muestra en la figura 2) o absurdo de la médula control en el día 0 y día 4 en la celda de alimentador de sistema libre. Las diferenciación las células fueron cultivadas en el sistema con o sin inhibidor de Smad3 SIS3 durante 6 días. Análisis de flujo detecta esa caída de E4bp4 suprimido en gran parte la maduración de la célula NK como se muestra por la reducción en CD244+ ve NKp46- ve NK células inmaduras en comparación con control NC-transfected, mientras que la inhibición de la activación de TGF-β1/Smad3 significativamente rescata la supresión mediada por siRNA de maduración de la célula NK en comparación con el grupo siE4BP4-transfected (figura 3).
Figura 1 . Imagen de NK médula ósea las células desde el sistema alimentador gratis. Crecimiento (A) curva de médula ósea las células en diferenciación de las células NK en el sistema hasta el día 11, obtenidos por conteo celular. ()B) células NK maduras con alto cociente nuclear a citoplasmática y citoplasma rico en gránulos morfología aparecen por día 6, según lo indicado por las flechas. Magnificación de 200 x, escala bar 50 μm. datos representan media ± SEM de 3 experimentos independientes, ***p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Efecto del silenciamiento de genes mediado por siRNA en la médula ósea las células en diferenciación de las células NK el día 6. Las diferenciación las células fueron transfectadas con absurdo control (NC) o siRNA dirigidas a mRNA E4bp4 murino (siE4bp4) el día 0 y día 4. PCR en tiempo real demuestra que nivel de expresión de mRNA de E4bp4 se redujo significativamente en las células NK si-E4bp4 tratados el día 6 en comparación con el grupo de NC. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes, **p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Silenciamiento de E4bp4 inhibe la diferenciación de murino médula ósea las células NK de forma TGF-β1/Smad3-dependiente. (A) flujo cytometry análisis muestra que caída de E4bp4 disminuye en gran medida la producción de células inmaduras de NK (CD244+ ve NKp46-ve) el día 6 en comparación con el grupo de control (NC) absurdo mediante el sistema libre de alimentador de in vitro , que puede ser rescatado significativamente mediante la supresión de la activación de TGF-β1/Smad3 con 1 μm de Smad3 inhibidor SIS3. (B) cuantificación de los resultados de análisis de flujo, ***p < 0.01 comparado con Carolina del norte; ### en comparación con el grupo siE4BP4-transfected p < 0.01. Se muestran datos representativos de 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1. Bloquean la estrategia para el análisis de flujo de expresión de marcador de la célula NK en total diferenciando células en día 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el presente trabajo, hemos descrito un nuevo método para la producción de células NK murinas derivadas de médula ósea in vitro. El alimentador de la célula en el sistema original21,22 es substituido con éxito por el medio condicionado de OP9 células, que aumenta en gran medida la estabilidad del sistema de diferenciación. Además, el sistema puede producir alta cantidad y pureza de NK madura las células para en vitro como en vivo ensayos, que pueden facilitar el estudio mecanístico, así como la investigación traslacional de las células NK en enfermedades humanas.
El método descrito se ha utilizado para investigar la función reguladora de la señalización de TGF-β1 en la supresión de células NK durante el desarrollo de cáncer23. Como no hubo ninguna influencia de las células de alimentador, en gran parte se mejora la eficiencia de knockdown de genes mediada por siRNA como inhibición mediada por el inhibidor de la. La ausencia de las células de alimentador OP9 nos permite demostrar claramente la función biológica de Smad3 en el desarrollo de las células NK E4BP4-mediada, mostrando la caída o inhibición de genes diana en vitro23.
Más importante aún, este sistema puede ser utilizado además para producir una gran cantidad de células NK murinas modificadas genéticamente para ensayos en vivo . Por ejemplo, hemos producido por lo menos 1 x 108 madura las células NK de las células de la médula ósea de un ratón por este sistema, y las células NK con la caída de un gen específico fueron infundidas en modelo con ratones con tumores NOD/SCID para demostrar la diferencia en efectos cáncer-muerte en vivo23. De hecho, pueden hacerse otras modificaciones en las células NK en este sistema, como la sobreexpresión génica mediada por virus, células de tinción, etcetera.
Sin embargo, debe señalarse que un máximo 70% de las células NK maduras se puede producir desde el sistema de día 9 (datos no mostrados), que es similar al resultado del sistema cultivado con OP9 stromal demostrado por Williams et al. 21 para superar esta limitación, las mixtas células NK pueden ser purificadas más con un flujo de clasificación de la máquina, así como kits de aislamiento de la célula NK comerciales para aislar a la población deseada.
En conclusión, se desarrolló un nuevo método para distinguir las células NK de las células de médula ósea murina. Este novedoso sistema puede proporcionar una opción para la obtención de alta pureza y la cantidad de células NK maduras para el estudio de la inmunidad en las enfermedades humanas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la investigación subvenciones Consejo de Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/FRC/12R) y la innovación y tecnología fondo de Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, su-InP/242/16), la subvención directa para investigación-CUHK (2016.035) y erudito de Hong Kong Programa.
H. Y.L. diseñados y supervisados todos los experimentos y contribuyó a la preparación del manuscrito. P.M.-K.T. realizó experimentos, analizar datos y contribuyó a la preparación del manuscrito. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., p.-M.W., y G. Y.L. recolectó muestras animales y participó en los experimentos con animales. J.S., X.-RH, y K. F.T. contribuyó a la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
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