Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att massproducera nedtystning murina NK-celler med hjälp av en feeder-fri differentiering system för mekanistiska studier in vitro och in vivo.
Abstract
Natural killer (NK) celler tillhör det medfödda immunförsvaret och är en första linjens anti-cancer immunförsvar; men de undertryckta i den tumör närmiljön och den underliggande mekanismen är fortfarande till stor del okända. Bristen på en konsekvent och pålitlig källa av NK-celler begränsar de forskningsframsteg NK cell immunitet. Vi rapporterar här, en in vitro- system som kan tillhandahålla hög kvalitet och kvantitet av benmärgen-derived murina NK-celler under ett feeder-fria tillstånd. Viktigare, Visa vi också att siRNA-medierad nedtystning framgångsrikt hämmar E4bp4-beroende NK cell mognad med detta system. Denna nya in vitro- NK cell differentiering systemet är således en biomaterial lösning för immunitet forskning.
Introduction
Cancer progression är beror på tumören mikromiljö1,2, inklusive värd-derived immunceller, t.ex., NK-celler. Flera studier har visat att intratumoral NK-celler är negativt korrelerade med tumör progression3,4. Kliniska studier visade dessutom att NK adoptiv cellterapi är en möjlig strategi för cancer5,6,7,8,9. NK cell-baserad cancer immunoterapi föreslogs nyligen som behandlingsalternativ för solida tumörer, men utmaningar finns på grund av utsöndringen av immunsuppressiva cytokiner och nedreglering av aktivera ligander i närmiljön av solida tumörer 10,11. Omvandla tillväxt factor-β (TGF-β) har föreslagits att en suppressiv roll i carcinogenes, men paradoxalt nog cancerceller också producera TGF-β1 för att stödja den tumör utveckling12,13,14 , 15. TGF-β signalering kan undertrycka NK celler via ned-reglerande interferon lyhördhet och CD16-medierad interferon-gamma (IFN-γ) produktion in vitro-16,17, cytolytisk aktivitet 18.
Även om störningar av TGF-β signalering i den tumör närmiljön kan vara en möjlig väg för att eliminera cancer, kommer att helt blockerar TGF-β signalering orsaka autoimmuna sjukdomar på grund av dess anti-inflammatoriska funktion, vilket framgår av utvecklingen av negativa biverkningar inklusive systemisk inflammation, modellerar kardiovaskulära defekter och autoimmunitet i musen19. Thus, förstå arbetar mekanismen av TGF-β-medierad immunsuppression kommer att leda till identifiering av ett tillgängligt terapeutiska mål för behandling av cancer.
För att klarlägga de molekylära händelserna som är nödvändiga för NK cell utveckling, etablerat Williams et al. ett in vitro -system för differentiering murina benmärgen hematopoetiska stamceller in i NK cells20. Detta system underlättar i hög grad mekanistiska studier av NK cell utveckling, inbegripet identifiering av romanen föräldraparets NK celler21. Men benmärgen föräldraparets bör vara odlade i systemet med stödja OP9 stromaceller som en feeder lager20,21, och denna heterogena cell befolkningen i stor utsträckning begränsar den fortsatta tillämpningen av gen-störa verktyg (t.ex., siRNA-medierad nedtystning) specifikt tillämpas på särskiljande NK-celler.
Här beskriver vi ett feeder-fria system som har utvecklats av ytterligare modifiera systemet in vitro- Williams et al20. I vårt system, OP9 stromal feeder cellerna behövs inte, och i stället OP9 villkorlig medium används utan att det påverkar differentieringen av NK celler in vitro-och detta nyligen leda oss att avslöja att TGF-β är kunna främja cancer progression via undertrycka E4bp4-beroende NK cell utveckling i tumör mikromiljö22. Detta nya system framgångsrikt ger en bakgrund-fri metod för att belysa den molekylära mekanismen av NK cell utveckling under särskilda förhållanden (t.ex.hög TGF-β1, siRNA-medierad nedtystning, etc.) in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet bygger för att erhålla och differentiera benmärg-derived NK cells (BM-NK) på tidigare publicerade metoder20,21,22. Alla förfaranden med möss har godkänts av den djur etik experimentella kommittén (AEEC) vid Chinese University of Hong Kong.
1. beredning av OP9 villkorlig Medium
- Kultur den murina stroma cellinje OP9 i alpha-MEM som innehåller 20% FBS, 100 U/mL penicillin G och 100 µg/mL streptomycin, vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av luft/CO2 (95%: 5%).
- Räkna cellerna med en hemocytometer, sedan frö 2 x 106 OP9 celler i varje 75 cm2 kultur kolv med 15 mL medium. Kultur för 48 h.
- När kulturen når 80% sammanflödet, tvätta kolven med 10 mL PBS och tillsätt 20 mL vanligt alpha-MEM medium (utan FBS och antibiotika) per kolv.
- Samla in OP9 skick mediet från kultur kolven på 24 h, städa upp cellfragment med 0,25 µm polyetersulfon (PES) filter och bevara vid 4 ° C (användning inom 2 veckor).
2. isolering av mus benmärgsceller
- Avliva en 12-vecka-gammal C57BL/6J mus med en pentobarbitone överdosering (100 mg/kg, intraperitoneal injektion). Bekräfta död av bristen på andning, sedan skörda lårbenet ben med en kirurgisk kniv skära knytpunkter mellan ben och ta bort återstående musklerna med bladet genom skonsam repor.
- Placera benen i en 50 mL centrifugrör som innehåller kyld sterila alpha-MEM och utför sedan följande steg i en biosäkerhet skåp.
- Kassera det alpha-MEM-mediet, och skölj benen med 70% etanol för 30 s.
- Tvätta ben med iskall steril fosfatbuffrad Koksaltlösning två gånger för att rensa upp återstående etanolen.
- Överföra ben i en mortel innehållande 5 mL iskallt PBS och försiktigt fragmentize ben med en mortelstöt (inte pulverisera dem).
- Agitera ben försiktigt genom omskakning mortelstöten för att släppa benmärgscellerna i PBS. Samla de PBS som innehålla benmärgscellerna i en ny 50 mL centrifugrör.
- Upprepa steg 2,6 för fyra gånger tills benfragment blir solid vit till färgen.
- Centrifugera röret vid 465 x g i 5 minuter vid 4 ° C och sedan Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten med 18 mL sterilt destillerat vatten och låt det stå i 30 s för att ta bort röda blodkroppar.
- Tillsätt 2 mL av iskall 10 X PBS att stoppa reaktionen, sedan filtrera blandningen genom en sil 70 µm cell ta bort lyserat röda blodkroppar.
- Centrifugera röret vid 465 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera pelleten med 20 mL iskallt PBS.
- Tvätta cellerna genom att upprepa steg 2.11 en andra gång.
- Överföra cellpelleten i en 100 mm steril petriskål med 10 mL OP9 villkorlig medium från steg 1.2 kompletteras med 20% FBS och en blandning av 0,5 ng/mL murint IL-7, 30 ng/mL mus SCF och 100 U/mL murina flt3L.
- Inkubera skålen vid 37 ° C med 5% CO2 för 2 h. överföring okopplade cellerna i en ny kultur-behållare med en täthet på 5 x 105 livskraftiga celler/mL (antal celler av hemocytometer med trypan-blå utslagning) med samma medium formel som i steg 2.13 , och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
- På dag 4 kompletteras ändra villkoret kultur till OP9 villkorlig medium med 20% FBS och 2.000 U/mL murina IL-2.
- Uppdatera odlingssubstratet varje 3 dagar; mogen NK-celler kan erhålls genom dag 7 och kvalificerade som i avsnitt 4.
3. siRNA-medierad Gene Silencing av differentiering NK-celler
- Premix siRNA eller nonsens kontrollen (NC) med en transfection agent enligt produkthandboken.
- Utför steg 3.1 vid någon tidpunkt sedan dag 0.
- Lägga till 50 nM med siRNA eller NC blandningen till cellerna från steg 2.14.
- Upprepa steg 3.1 på varje medium förfriskning (t.ex., dag 0, 4 och 7) tills experimentella slutpunkten.
4. analys av NK celldifferentiering genom flödescytometri
- Vid en lämplig tidpunkt, samla upphävandet av differentiering cellerna och tvätta med iskall PBS.
- Fixa cellerna med cell fixering buffert enligt produkthandboken.
- Tvätta fast cellerna med iskall PBS och sedan Omsuspendera 1 x 106 celler i 100 µL av Flow flödescytometri färgning buffert innehållande Cy3-konjugerad antimus NKp46 och PE-konjugerad antimus CD244 antikroppar i en utspädningsfaktor på 1: 100.
- Fläcken provet mörkt vid rumstemperatur för 2 h.
- Omsuspendera färgade proverna med 300 µL av PBS, då förvärva FACS data och analysera med Cytobank plattform20 (http://cytobank.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat erhålls efter protokollet beskrivs. Totala suspension benmärgsceller odlades under feeder-fri differentiering systemet för 11 dagar; betydande ökning av spridning rate observerades av dag 7 jämfört med antalet totala celler på dag 0 (figur 1A). Mogen NK celler med hög kärnkraft till cytoplasma förhållande och granule-rika cytoplasman morfologi fanns av dag 6 i systemet (figur 1B).
För att belysa den rättsliga effekten av TGF-β1/Smad3 signalering i NK celldifferentiering, benmärg celler var transfekterade med siRNA mot E4bp4 mRNA (siE4bp4, som effektivt dämpar E4bp4 mRNA nivå som visas i figur 2) eller nonsens styra på dag 0 och dag 4 i feeder-cellen gratis system. Särskiljande cellerna odlades i systemet med eller utan Smad3-hämmare SIS3 i 6 dagar. Flödesanalys upptäckt att Nedslagning av E4bp4 till stor del undertryckta NK cell mognad som visas av minskningen i CD244+ ve NKp46- ve omogna NK-celler jämfört med NC-transfekterade kontroll, medan hämning av TGF-β1/Smad3 aktiveringen betydligt räddar siRNA-medierad dämpning av NK cell mognad jämfört med siE4BP4-transfekterade gruppen (figur 3).
Figur 1 . Bilden av benmärgen-derived NK celler från feeder-fria system. (A) tillväxt kurva av benmärg celler genomgår NK celldifferentiering i systemet tills dag 11, erhålls genom cell räkning. ()B) mogen NK celler med hög kärnkraft till cytoplasma förhållande och granule-rika cytoplasman morfologi visas av dag 6, som anges med pilar. Förstoringen 200 x, skala bar 50 µm. Data representerar medelvärde ± SEM för 3 oberoende experiment, ***p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Effekten av siRNA-medierad nedtystning på benmärgen celler som genomgår NK celldifferentiering på dag 6. Särskiljande cellerna var transfekterade med nonsens kontroll (NC) eller siRNA inriktning murina E4bp4 mRNA (siE4bp4) på dag 0 och dag 4. Realtids-PCR visar att mRNA uttryck E4bp4 var betydligt mindre i si-E4bp4 behandlas NK celler på dag 6 jämfört med gruppen NC. Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM för 3 oberoende experiment, **p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Tystande av E4bp4 hämmar differentiering av murina benmärg-derived NK-celler på ett sätt som TGF-β1/Smad3-beroende. (A) flöde flödescytometri analys visar att Nedslagning av E4bp4 till stor del minskar produktionen av omogna (CD244+ ve NKp46-ve) NK celler på dag 6 jämfört med gruppen nonsens kontroll (NC) genom att använda feeder-fria system in vitro- , som avsevärt kan räddas genom att undertrycka TGF-β1/Smad3 aktiveringen med 1 µM Smad3 hämmare SIS3. (B) kvantifiering av flöde analysresultaten, ***p < 0,01 jämfört med NC; ### p < 0,01 jämfört med siE4BP4-transfekterade grupp. Representativa uppgifter 3 oberoende experiment visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Gating strategi för Flödesanalys av NK cell markör uttryck i totala differentiera celler på dag 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete, har vi beskrivit en ny metod för att producera benmärg-derived murina NK celler in vitro. Cell mataren i det ursprungliga systemet21,22 är framgångsrikt ersatt av villkorlig medlet av OP9 celler, vilket i hög grad ökat det differentiering systemet stabilitet. Dessutom systemet kan producera hög kvantitet och renhet av mogen NK celler för in vitro- liksom i vivo analyser, som kan underlätta den mekanistiska undersökningar samt translationell forskning av NK-celler i människans sjukdomar.
Den beskrivna metoden har använts för att undersöka reglerande roll av TGF-β1 signalering i NK cell dämpning under cancer utveckling23. Eftersom det inte fanns något inflytande från mataren celler, effektivitet siRNA-medierad gen knockdown samt hämmare-medierad hämning är i hög grad förbättras. Avsaknad av mataren cellerna OP9 tillåter oss att tydligt visa den biologiska funktionen av Smad3 i E4BP4-medierad NK cell utveckling, genom att visa den överväldigande eller hämning av mål gener i vitro23.
Viktigare, kan detta system utnyttjas ytterligare för att producera en stor mängd genetiskt modifierade murina NK-celler för i vivo analyser. Exempelvis har vi tagit fram minst 1 x 108 mogna NK celler från benmärgsceller av en enda mus av detta system, och NK-celler med Nedslagning av en specifik gen var infunderas i tumör-bärande nicka/SCID musmodell att demonstrera skillnaden i cancer-dödande effekter i vivo23. Andra ändringar kan faktiskt göras på NK-celler i systemet, såsom viral-medierad gen överuttryck, cell färgning, etc.
Det bör dock noteras att högst 70% av mogen NK-celler kan produceras från systemet på dag 9 (inga data anges), som är liknande till resultatet av det odlade systemet med OP9 stromal visas av Williams et al. 21 för att övervinna denna begränsning, blandade NK-celler kan ytterligare renas med ett flöde som sortering maskin, samt kommersiella NK cell isolering kit för att isolera önskad befolkningen.
Sammanfattningsvis, utvecklas en ny metod för att skilja NK-celler från murina benmärgsceller. Detta nya system kan ge ett alternativ för att erhålla hög renhet och kvantitet av mogen NK-celler för studien av immunitet i mänskliga sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av den forskning stipendier rådet Hongkong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) och Innovation och teknologi fond i Hongkong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), bidrag för forskning-CUHK (2016.035) och Hong Kong Scholar Programmet.
H.-yl utformade och övervakade alla experiment och bidragit till manuskriptet förberedelse. P.M.-K.T. utförde experiment, analyserat data och bidragit till manuskriptet förberedelse. P.C.-T. T., J.Y.-FC, J.S.-C., H., f.-M.W., och G.-yl samlade djur prover och deltog i djurförsök. J.S., X.-R.H., och K.-F.T. bidragit till manuskriptet förberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
